CpG岛甲基化检测技术比较

Cp G岛过甲基化所致基因去表达是主要的表遗传学 (epigenetics)改变之一 ,是一种在突变、缺失、异位等序列变异之外的非序列性变化。这种表遗传异常不仅与复制延迟、染色体压缩、转录抑制密切相关 ,而且与疾病的易感性、发生发展、预后和转归均有密切关系。很多肿瘤发生都涉及到基因组甲基化的改变 ,包括抑癌基因的高甲基化和原癌基因的去甲基化。因此 ,检测甲基化的相关技术也随着甲基化研究的深入而不断推陈出新。简便高效快捷检测方法的出现极大地提高了工作效率 ,关键性 Cp G位点概念的建立增加了实验结果的实用性     

基因组CpG岛甲基化检测技术研究进展

启动子CpG岛甲基化所致的抑癌基因失活和肿瘤发生密切相关，因而了解抑癌基因CpG岛甲基化情况具有重要意义。目前CpG岛甲基化的检测方法众多，其原理分别基于甲基化敏感的限制性内切酶切割和亚硫酸氢钠修饰，用于全基因组大量CpG岛甲基化检测和基因特异性CpG岛的一个或多个CpG位点甲基化检测。     

FMR1基因启动子区CpG岛甲基化与智力低下的相关性研究

目的探讨智力低下基因1启动子区CpG岛甲基化与智力低下的相关性。方法应用甲基化PCR方法对79例智力低下儿童及79例正常儿童的外周血中FMRI基因启动子区CpG岛甲基化状态及（CGG）n进行检测。结果2例智力低下儿童的FMRI启动子区CpG岛发生甲基化,正常儿童基因CpG岛无甲基化;两组（CGG）n重复数分别为33—48、27—43,两者之间比较（P〉0．05）无统计学意义。结论FMRl基因启动子区CpG岛甲基化可能引起智力低下。     

子宫内膜癌组织中内皮素受体B基因启动子区域CpG岛甲基化状况的研究

我们对子宫内膜癌组织中内皮素受体B（endothelin receptor B,EDNRB）基因启动子区域CpG岛的甲基化（简称启动子甲基化）状况进行检测,以分析探讨其在子宫内膜癌的发生发展中的作用。     

肠道肿瘤组织中C-erbB2基因启动子区CpG岛甲基化状态的分析

目的：探讨肠道肿瘤中致癌基因C-erbB2启动子区CpG岛的甲基化状态。方法收集经病理确诊的40例肠癌患者甲醛固定的肠道肿瘤组织及相应癌旁组织各40份;采用甲基化特异聚合酶链反应(MSP)检测C-erbB2基因启动子区CpG岛甲基化状态。结果肠道肿瘤组织中C-erbB2基因启动子区CpG岛甲基化率(52.5%)低于癌旁组织中存在的甲基化率(75.0%),两者之间差异有统计学意义(<0.05);肿瘤不同分期和有无淋巴结转移组间C-erbB2基因启动子区CpG岛甲基化率差异无统计学意义。结论所检标本显示肠道肿瘤组织与癌旁组织间C-erbB2基因启动子区CpG岛甲基化率差异有统计学意义,提示C-erbB2低甲基化可能是C-erbB2蛋白高表达和肠癌发生的原因之一。     

雌激素受体α阴性乳腺癌雌激素受体α基因启动子区CpG岛甲基化和肼苯哒嗪去甲基化作用

目的 检测雌激素受体(ER)α阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231和MDA-MB-435细胞及ERα阴性乳腺癌组织中ERα基因启动子区CpG岛甲基化状态;探索肼苯哒嗪能否作为去甲基化药物恢复ERα基因表达。方法应用特异性聚合酶链反应(MSP)检测乳腺癌细胞株MDA-MB-231和MDA-MB-435细胞和20例ERα阴性乳腺癌组织ERα基因3个启动子区A、B、CpG岛甲基化情况,肼苯哒嗪处理上述两种乳腺癌细胞,逆转录(RT)-PCR检测不同启动子调控下ERα基因异型体(isoform)ERα-A、ERα-B、ERα-C mRNA和ERα基因公共编码区mRNA表达。结果MDA-MB-231和MDA-MB-435细胞启动子区ERα-A、ERα-B均存在CpG岛甲基化,ERα-C无甲基化,20例ERα阴性乳腺癌组织中,13例(65％)ERα-A、10例(50％)ERα-B CpG岛甲基化阳性。其中9例ERα-A、ERα-BCpG岛甲基化均阳性(45％),仅1例(5％)ERα-C存在CpG岛甲基化。肼苯哒嗪处理上述两种细胞后,检测到ERα-A、ERα-B mRNA和公共编码区mRNA表达。结论乳腺癌组织和细胞ERα基因表达沉默可能与ERα基因启动子区A、B甲基化有关,且肿瘤分期愈晚,甲基化程度愈高。肼苯哒嗪能作为去甲基化药物诱导ERα基因表达。     

KIR3 DL1启动子区域 CpG 岛甲基化对抗原表达的影响

目的：探索KIR3DL1启动子区域CpG岛甲基化对抗原表达的影响。方法选择抗原高表达KIR3DL1倡01502和低表达KIR3DL1倡005样本,分别测定启动子区域碱基序列和启动子区CpG岛甲基化程度。对携带有KIR3DL1倡01502、KIR3DL1倡005的NK细胞分别采用5-aza进行去甲基化处理,利用流式细胞仪检测KIR3DL1抗原。结果 KIR3DL1倡01502和KIR3DL1倡005启动子区域－65和－269位存在碱基差异,这导致它们的启动子区域有两个不同的CpG岛。 KIR3DL1倡01502启动子区CpG岛高度甲基化,去甲基化后相应的细胞表面抗原表达显著增加。而携带KIR3DL1倡005的细胞去甲基化处理后,抗原表达没有明显变化。结论 KIR3DL1倡01502启动子区域CpG岛甲基化影响抗原的表达,但是不同抗原表达模式的KIR3DL1等位基因可能存在不同的调控机制。     

双重复合糖基转移酶的ABO基因启动子CpG岛甲基化

背景：在ABO血型抗原的研究中,绝大多数样本是相同的ABO基因表达出正常的相同的ABH抗原。但有一定数量的样本表现出具有相同分子遗传背景但表达出来的抗原强度却随着家系\个体不同而有所差异,说明了ABO血型中复杂的表达调控机制。分析一类罕见的双重复合型标本的ABO血型血清学与基因背景情况,深入表观遗传学的研究,有利于部分揭示ABO基因表达机制。 目的：探讨双重复合型ABO糖基转移酶表达相关的ABO基因启动子CpG岛甲基化水平与ABH抗原表达的关系。 方法：6例经血型血清学定为CisAB或B(A)型的标本,进行ABO基因编码区全长序列和启动子序列的测定,采用重亚硫酸盐处理法检测ABO基因启动子CpG岛甲基化程度。 结果与结论：6例双重复合AB型的标本中,在B101等位基因基础上存在nt803C > G突变的2个CisAB05/B(A)06等位基因,在ABO启动子CpG岛区域两者在nt-33(30%)、nt+27(50%)、nt+49(50%)具有甲基化差异;在A101等位基因序列的基础上存在nt803C > G突变的2个CisAB01等位基因,在ABO启动子CpG岛区域两者在nt-26(10%)位置有甲基化差异;在B101等位基因基础上存在nt640A > G突变的2个B(A)04等位基因ABO启动子CpG岛,在nt-33(10%)、nt+16(50%)、nt+57(60%)、nt+59(60%)、nt+68(60%)和nt+74(60%)位有甲基化差异。全部的6例标本ABO基因启动子区域DNA序列无任何突变异常。结果提示在相同的ABO遗传基因背景下,ABO基因启动子CpG岛区域某些位点甲基化可能影响ABH抗原在红细胞膜表面的表达。     

先天性小耳畸形EYA1基因筛查及其启动子区域甲基化研究

目的EYA1基因编码的蛋白质对鳃弓和耳部的正常发育至关重要,本研究选择EYA1基因作为候选基因对先天性小耳畸形患者进行突变检测,并对其启动子区域CpG岛甲基化状态进行研究。方法研究对象选择先天性小耳畸形患者100例,其中包括13个家系（先证者和家系其他患病成员共31人）,散发患者69人。通过PCR和直接测序对EYA1基因进行突变检测。并应用基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析技术检测了病例组和正常对照的EYA1基因启动子区域CpG岛甲基化情况。结果检测到4种EYA1核苷酸改变,分别为258G〉A（Q86Q）、813A〉G（T271T）、1278C〉T（G426G）和1755T〉C（H585H）。先天性小耳畸形患者EYA1基因的CpG_Unit3和CpG_Unit5甲基化程度分别为0.09258±0.033846和0.0922±0.02379,与正常对照相比明显降低,其差异具有统计学意义。结论本实验未能在先天性小耳畸形伴耳前凹、耳前赘患者中检测到EYA1基因的突变,考虑EYA1基因突变可能不是中国人群先天小耳畸形的主要致病原因。先天性小耳畸形存在EYA1基因低甲基化情况,可能与该病的发生发展相关。     

脆性X综合征FMR1基因CpG岛的甲基化程度分析

目的 建立用甲基化敏感性限制性内切酶定量聚合酶链反应(methylation-sensitiverestriction enzymes-based quantitative PCR,MSRE-qPCR)分析FMR1基因CpG岛甲基化程度的方法,并探讨其对脆性X综合征的诊断价值.方法 以常规PCR初筛存在FMR1基因5′(CGG)n异常扩增的30例智力低下男童和20名母亲作为研究对象,用Eag Ⅰ酶消化DNA样品,针对FMR1基因CpG岛设计引物,定量PCR扩增Eag Ⅰ酶切前、后DNA,用2-△△Ct法计算CpG岛甲基化程度;以Southern印迹杂交确诊的3例患儿和正常体检男、女各30例DNA样品为质控样本,从而建立优化的MSRE-qPCR方法.结果 确立了正常甲基化、部分异常甲基化、全甲基化的区间值,并明确30例常规PCR初筛异常患儿中3例存在部分甲基化,27例为全甲基化,其中3例经Southern印迹杂交验证;13例母亲处于正常甲基化,7例存在异常甲基化.结论 MSRE-qPCR可以对FMR1基因CpG岛的甲基化程度进行快速可靠分析,为脆性X综合征的分子诊断提供新的策略.     

膀胱移行细胞癌中TMIP-3 CpG岛DNA甲基化的研究

目的 检测膀胱移行细胞癌中金属蛋白酶组织抑制因子3(tissue inhibitor of metalloproteinase 3,TIMP-3)CpG岛甲基化程度,探讨该基因CpG岛甲基化在该肿瘤中的作用及临床意义.方法 收集60例膀胱移行细胞癌组织标本和30例正常膀胱粘膜标本,用甲基化特异的PCR(methylmion specific PCR ,MSP)法检测TIMP-3基因CpG岛的甲基化状态.结果 膀胱移行细胞癌TIMP-3基因CpG岛的甲基化发生率为45 %(27/60).而出现甲基化的膀胱癌病例,其TIMP-3的蛋白表达水平均不高.结论 膀胱癌细胞TIMP-3基因的CpG岛甲基化发生率较高,检测其表达水平对膀胱移行细胞癌的诊断及预后判断具有一定的参考价值.     

MeCP2促进山姜素对鼠巨噬细胞炎性因子表达的抑制及其分子机制

通过分析甲基CpG结合蛋白2(methyl CpG binding protein 2, MeCP2)对山姜素作用下鼠巨噬细胞(RAW246.7)合成IL-6和TNF-α的影响及作用机制,揭示山姜素与MeCP2联合应用对于炎症性疾病的干预潜力。用重组质粒pEGFP-C1-MeCP2以及空白质粒pGL-basic分别转染RAW246.7,后将细胞随机分为对照组、山姜素组(终浓度1 mg/mL)以及山姜素+GW9662(0.1 mmol/L)组。孵育72 h后,ELISA检测培养液中IL-6和TNF-α表达水平,Western blotting分别检测细胞核内过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferators-activated receptor, PPAR)、MeCP2以及胞质中NLRP3、pro-Caspase-1和各聚集状态凋亡相关微粒蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD, ASC)含量,并采用免疫荧光染色法检测ASC斑点形成情况。结果显示,与空白质粒转染比较,重组质粒转染RAW246.7在山姜素作用下合成IL-6和TNF-α的水平更低;而在对照组以及GW9662组,转染重组质粒对炎性因子合成无明显影响。山姜素对MeCP2表达无促进作用,且重组质粒转染对PPAR表达亦无影响。另外,山姜素可明显抑制RAW246.7胞质NLRP3合成,但对pro-Caspase-1含量以及ASC聚集状态无显著影响;而过表达MeCP2可遏制pro-Caspase-1合成并促进ASC解聚。由此,MeCP2可通过抑制炎症小体通路以促进山姜素对鼠巨噬细胞炎性因子合成的抑制,提示山姜素与MeCP2联合有望成为炎症性疾病防治的新策略。     

肺癌患者PTEN基因启动子高甲基化的检测

目的 探讨肺癌患者组织、外周血浆及支气管肺泡灌洗液(BALF)中张力蛋白同源的磷酸酶基因(PTEN)启动子异常基因化状况及其在肺癌诊断中的价值.方法 用甲基化特异性PCR方法检测组织、血浆及BALF中的PTEN基因启动子区CpG岛甲基化.结果 45例肺癌患者中,PTEN基因启动子异常甲基化率组织为26.67%(12/45)、血浆为15.56%(7/45),BALF为22.22%(10/45);而非肺癌组织、正常对照血浆、非肺癌患者BALF中未检出甲基化;血浆、BALF中甲基化改变与肿瘤组织甲基化状况显著相关(P<0.01).结论 血浆、BALF中PTEN基因异常甲基化改变的检测在肺癌的早期特异诊断等方面有一定的价值.     

卵巢癌细胞中OY-TES-1基因启动子CpG位点甲基化状态分析

目的:了解卵巢癌SKOV3细胞中OY-TES-1启动子区域CpG位点的甲基化状态.方法:运用免疫细胞化学法检测SKOV3细胞中OY-TES-1蛋白表达;通过硫化测序PCR法,分析SKOV3细胞中OY-TES-1启动子区域CpG位点的甲基化状态,并与睾丸组织相比较.结果:免疫细胞化学法检测结果显示,SKOV3细胞中OY-TES-1蛋白呈阳性反应;在检测的OY-TES-1启动子区域(转录起始点-127 bp～+110 bp,含24个CpG位点)中,CpG位点的甲基化频率为80.21％,其甲基化状态明显高于睾丸组织.结论:SKOV3细胞中OY-TES-1启动子CpG位点处于高甲基化状态,进一步可探讨甲基化抑制剂氮杂脱氧胞嘧啶对OY-TES-1甲基化状态及其表达水平的影响.     

乳腺癌发生模型MCF10 抑癌基因NOEY2启动子区甲基化及mRNA表达

DNA甲基化是常见的表观遗传学变化。越来越多的证据表明,抑癌基因启动子区CpG岛甲基化可使其转录沉默,从而解除其抑癌作用,导致肿瘤的发生和发展。NOEY2是近年来发现的抑癌基因,表达于正常乳腺导管上皮细胞和卵巢生发上皮细胞,但在乳腺癌和卵巢癌细胞中表达显著减少或不表达。在本实验中检测乳腺癌发生模型MCF10中不同阶段的细胞系NOEY2基因启动子区CpG岛Ⅰ甲基化状态,并与mRNA表达水平进行比较,以研究乳腺癌的发生机制和早期诊断。     

胃癌细胞株中NPRA基因启动子区CpG岛的甲基化分析

目的NPRA-cGMP信号通路系统可激活cGMP依赖的蛋白激酶,活化的蛋白激酶调控离子转运蛋白和转录因子的表达,从而最终影响细胞生长、凋亡、增殖和炎症反应。本研究旨在研究NPRA基因在胃癌细胞中的甲基化状态及其对下游mRNA表达的影响。方法应用亚硫酸氢钠处理基因组DNA后PCR并测序,我们分析了6株胃癌细胞株NPRA基因的甲基化状态及去甲基化试剂对下游mRNA表达的影响。结果在胃癌细胞中发现NPRA基因启动子区存在甲基化畸变并导致下游mRNA表达减少或沉默。去甲基化试剂可逆转mRNA表达沉默。结论胃癌细胞中存在NPRA基因甲基化畸变。     

卵巢癌细胞IL-6、IL-8及其受体表达的研究

目的分析比较五种常见的上皮性卵巢癌细胞系IL-6、IL-8及其受体表达的差异。方法IL-6、IL-8的表达分别采用RT-PCR和ELISA法进行检测,IL-6受体（IL-6Rα和gp130）及IL-8受体（IL-8RA和IL-8RB）的表达采用免疫印迹技术进行测定。结果①五种上皮性卵巢癌细胞均组成性表达IL-6和IL-8。IL-6和IL-8在CAOV-3细胞中的表达水平均最高,而在HO-8910PM细胞中的表达水平均最低,IL-6在SKOV-3、HO-8910、OVCAR-3细胞中的表达水平依次降低,IL-8在OVCAR-3、SKOV-3、HO-8910细胞中的表达水平依次降低。②五种上皮性卵巢癌细胞均表达IL-6Rα、gp130及IL-8RA;除CAOV-3细胞外,其它细胞均表达IL-8RB。结论本研究旨在筛选表达IL-6和IL-8及其相应受体的细胞株,为研究IL-6、IL-8与卵巢癌发生、发展关系奠定基础,同时也为今后卵巢癌的免疫治疗提供一个新的思路。     

IL-37通过调控M-CSF和抑制IL-6-JAK2/STAT3信号通路抑制骨质疏松的机制研究

目的:探讨IL-37 在抑制骨质疏松过程中的作用机制。方法:选取本院2013 年1 月至2015 年12 月收治的97例骨质疏松患者及在本院行骨折手术的81 例无骨质疏松患者(对照组)为研究对象,检测两组血清中IL-37 及IL-6 的水平。构建IL-37 转基因小鼠,将C57BL/6J 小鼠、IL-37 转基因小鼠分别设置假手术(Sham)组,手术组(卵巢切除术,OVX 组)。8 周后,取小鼠血清,检测血清中雌激素水平、碱性磷酸酶水平(ALP)、血钙和血磷水平;同时取小鼠的双侧股骨、脊柱,病理切片分析股骨组织形态结构,骨密度仪检测脊柱骨密度变化。分离培养各组小鼠骨髓基质细胞(Bone marrow stromal cells,BMSCs), 检测BMSCs 的体外增殖能力,M-CSF 及IL-6 的表达及STAT3 的激活。IL-37 转染小鼠成骨细胞MC3T3-E1,转染后72 h,ELISA 检测上清中M-CSF 及IL-6,流式细胞术检测MC3T3-E1 细胞的凋亡,Western blot 检测STAT3 的激活。结果:骨质疏松患者血清中IL-37 水平显著低于对照组(P<0.05),而IL-6 则显著高于对照组;C57BL/6J 小鼠、IL-37 转基因小鼠OVX 组血清中雌激素、血钙和血磷显著低于假手术组,而ALP 水平显著高于假手术组(P<0.05),但IL-37 转基因小鼠OVX 组血钙和血磷则显著高于C57BL/6J 小鼠OVX 组(P<0.05)。股骨病理切片及脊柱骨密度结果显示,C57BL/6J 小鼠、IL-37 转基因小鼠OVX组均出现组织形态结构的破坏和骨密度下降,但IL-37 转基因小鼠明显优于C57BL/6J 小鼠(P<0.05)。IL-37 转基因小鼠OVX 组BMSCs 增殖能力显著高于C57BL/6J 小鼠OVX 组,而STAT3 的激活和M-CSF 的表达则显著低于C57BL/6J 小鼠OVX组(P<0.05)。MC3T3-E1 细胞转染IL-37 后能明显抑制M-CSF 及IL-6 的表达,而STAT3 的激活也明显被抑制,流式细胞检测显示转染IL-37 后能显著抑制MC3T3-E1 细胞的凋亡。结论:骨质疏松患者血清IL-37 水平显著降低,IL-37 可能是通过调控M-CSF 及IL-6-JAK2/ STAT3 信号通路促进BMSCs 增殖和抑制成骨细胞的凋亡从而抑制骨质疏松的进展。     

乳腺癌细胞中PELP1基因表达与启动子区CpG岛甲基化相关性

目的建立针对PELP1基因启动子区CpG岛的甲基化特异性PCR(Methylation specific PCR,MSP)检测方法,分析乳腺癌细胞中PELP1基因表达与启动区CpG岛甲基化的相关性。方法设计针对PELP1基因启动子区的MSP引物组,以甲基化和非甲基化DNA为模板验证MSP引物的特异性,建立针对PELP1基因启动子区的MSP检测方法。以DNA甲基转移酶抑制剂5'-氮杂-脱氧胞苷磷酸(5'-Aza-d C)分别处理MCF-7乳腺癌细胞、MCF-10正常乳腺导管上皮细胞,采用MSP检测PELP1基因启动子区甲基化状态变化,采用Western blot检测蛋白表达。结果针对PELP1基因启动子区设计的MSP引物组特异性良好,甲基化特异性引物仅在甲基化DNA模板获得阳性扩增条带,非甲基化引物仅在非甲基化DNA模板获得阳性条带。MCF-7乳腺癌细胞中PELP1基因启动子区呈非甲基化状态,MCF-10正常乳腺导管上皮细胞中PELP1基因启动子区呈甲基化状态,MCF-10细胞中PELP1蛋白表达水平为MCF-7细胞的1/16(P0.05)。采用5'-Aza-dC去除MCF-10细胞PELP1基因启动子区甲基化后,PELP1蛋白表达水平上升了9.7倍(P0.05)。结论所建立的PELP1基因启动子区MSP检测方法特异性良好,去甲基化可能是导致乳腺癌细胞中PELP1基因过表达的重要机制。     

脑胶质瘤患者组织和血清MGMT、hMLH1和hMSH2基因启动子甲基化状态检测

目的 探讨脑胶质瘤患者组织和血清中MGMT、hMLH1和hMSH2基因启动子CpG岛甲基化发生率及相关性.方法 甲基化特异性PCR(MSP)检测39例脑胶质瘤组织样本及32例预处理的脑胶质瘤血清样本中MGMT、hMLH1和hMSH2基因启动子区的甲基化状态.结果 脑胶质瘤组织MGMT、hMLH1和hMSH2基因启动子区甲基化发生率分别为46.2 %、10.3 % 和20.5 %,肿瘤组织中至少有一种基因甲基化的发生率为64.1 % (25/39);在脑胶质瘤患者外周循环血液中检测到了相关基因甲基化系列,并且与组织中基因甲基化发生率明显相关.结论 MGMT、hMLH1和hMSH2基因启动子甲基化是脑胶质瘤发生过程中常见的分子事件,血清中相关基因DNA甲基化检测有可能为脑胶质瘤诊断和个体化化疗提供一种稳定的无创性检测指标.