脂质体介导的C-myc反义寡核苷酸在视网膜色素上皮细胞中分布和稳定性的观察

目的；在体外培养的人视网膜色素上皮（RPE）细胞中，观察脂质体（Lipofectamine)介导的C-myc反义寡核苷酸转染效果，为进一步研究增生性玻璃体视网膜病变（PVR）的防治提供实验依据。方法：将人工合成带有FAM荧光标记的反义寡核苷酸（AS－ODN）用脂质体包裹转染体外培养的RPE细胞，同时用无脂质体介导的裸AS－ODN作对比，在荧光显微镜下动态观察AS－ODN在RPE细胞内的分布和存留时间。结果：与无脂质体介导的裸AS－ODN相比，脂质体介导的AS－ODN在细胞内，尤其在胞核的分布明显加强；不仅转染速度快，而且在细胞的存留时间延长1倍以上。结论：脂质体能明显增强AS－ODN在RPE细胞内的转染效率，有望进一步用于防治PVR的研究。     

反义寡核苷酸对人视网膜色素上皮细胞EGFR表达和增生抑制作用的研究

目的 研究反义寡核苷酸(ODN)对人视网膜色素上皮(RPE)细胞，表皮生长因子受体(EGFR)表达和增生的影响。方法 采用人工合成反义ODN经阳性脂质体包裹后转染人RPE细胞。用MTT和细胞周期分析检测转染ODN后对细胞的生长抑制作用，采用半定量RT-PCR法与ELISA法检测EGFR mRNA及蛋白的表达水平。结果 显示转染反义ODN 24 h后，EGFR mRNA的表达抑制率为35．2％，EGFR蛋白抑制率为66．45％。48 h后．反义EGFR ODNS对EGFR蛋白的抑制作用消失。EGFR反义ODN对RPE细胞生长增生的抑制率约为40％。细胞周期分析EGFR反义ODN作用于细胞后，细胞G0／G1期细胞数明显增多，S期细胞数相应减少，而G2 M期细胞数亦明显减少。结论 EGFR反义SON可抑制人RPE细胞的生长和EGFR mRNA及其蛋白的表达。     

金雀异黄素对培养人视网膜色素上皮细胞增生的抑制作用

目的观察金雀异黄素对培养人视网膜色素上皮(hRPE)细胞增生的影响.方法通过MTT比色法和核仁嗜银蛋白染色分析,观察金雀异黄素对hRPE增生的影响.结果不同浓度的金雀异黄素可以抑制hRPE增生,在25～100mg·L-1的范围内呈剂量效应关系,抑制率为12.0%～64.6%(P＜0.05);并随时间的延长,抑制效应增强.嗜银蛋白染色结果50mg·L-1金雀异黄素作用12h即有胞核内AgNORs的减少,平均数为2.7(P=0.034),25mg·L-1金雀异黄素作用24h后,其胞核内AgNORs的数量平均为3.9(P=0.023).并随剂量的增加和时间的延长,胞核内AgNORs的数量减少.结论不同浓度的金雀异黄素作用于培养hRPE细胞,抑制hRPE细胞的增生,有剂量和时间效应关系,随剂量增加和时间延长,抑制作用越明显.提示金雀异黄素可以为增生性玻璃体视网膜病变的机理和防治研究提供新的思路.     

端粒酶编码区的反义寡核苷酸对人视网膜色素上皮细胞增生的影响

目的探讨不同浓度端粒酶编码区的反义寡核苷酸对人视网膜色素上皮细胞增生活性的影响。方法用不同浓度(0μmol·L-1、5μmol·L-1、10μmol·L-1、15μmol·L-1)端粒酶编码区的反义寡核苷酸处理人视网膜色素上皮细胞24h后,使用MTT法测定视网膜色素上皮细胞增生的抑制率,使用流式细胞仪检测其对视网膜色素上皮细胞周期的影响。结果不同浓度端粒酶编码区反义寡核苷酸处理过的视网膜色素上皮细胞的抑制率随反义寡核苷酸浓度的增高而升高,并将视网膜色素上皮细胞阻滞在G0/G1期。结论端粒酶编码区的反义寡核苷酸对视网膜色素上皮细胞有抑制作用且呈浓度依赖性,这一结论可能成为增生性玻璃体视网膜疾病基因治疗的一个新靶点。     

视网膜色素上皮细胞在增生性玻璃体视网膜病变中的作用

增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy,PVR)是在炎症和免疫功能细胞及多种活化因子对眼内细胞修复反应的调控过程中,由于过度促进细胞增殖、移行以及由细胞介导的胶原收缩而形成的。参与PVR的细胞目前已知的有5种,其中视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞是最主要的,本文将影响RPE细胞功能的各种影响因素及PVR的治疗进展作一综述。     

反义寡核苷酸对人视网膜色素上皮细胞EGFR表达的影响

目的　研究反义寡核苷酸 (ODN)对人视网膜色素上皮 (RPE)细胞表皮生长因子受体 (EGFR)表达的影响。方法　采用人工合成反义ODN经阳性脂质体包裹后转染人RPE细胞。采用半定量RT PCR法与ELISA法检测EGFRmRNA及蛋白的表达水平。结果　显示转染反义ODN 2 4h后 ,EGFRmRNA的表达抑制率为 35 .2 % ,EGFR蛋白抑制率为 6 6 .4 5 % .4 8h后 ,反义EGFRODNs对EGFR的表达抑制作用消失。结论　EGFR反义ODN可抑制人视网膜色素上皮细胞的EGFRmRNA及其蛋白的表达。     

增殖细胞核抗原反义寡核苷酸对牛晶状体上皮细胞增殖的影响

目的　探讨增殖细胞核抗原 (proliferatingcellnuclearantigen ,PCNA)反义寡核苷酸对牛晶状体上皮细胞增殖的影响。方法　取体外培养的第 2代牛晶状体上皮细胞用于实验。A～F组分别加入PBS、30 μmol/LPCNA反义寡核苷酸、30 μmol/LPCNA正义寡核苷酸、10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子 (basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)、10 μg/LbFGF及 30 μmol/L反义寡核苷酸、10 μg/LbFGF及30 μmol/L正义寡核苷酸 ;常规培养 2 4h后 ,使用流式细胞仪检测细胞周期的变化和PCNA蛋白的含量。提取细胞mRNA ,采用地高辛标记PCNA探针和Northen酶联吸附免疫杂交法 ,在酶标仪上测定吸光度 (A值 )以表达PCNAmRNA含量。结果　牛晶状体上皮细胞S期的细胞数量占细胞总数的百分比A组为 ( 15 7± 1 8) % ,B组为 ( 7 9± 0 4) % ,两组比较差异有非常显著意义 (P <0 0 1) ;PCNAmRNA含量A组A值为 0 2 0 6± 0 0 0 4,B组A值为 0 173± 0 0 14,两组比较差异有显著意义 (P<0 0 5 ) ;PCNA蛋白表达率A组为 ( 5 5 2 7± 2 6 4) % ,B组为 ( 12 32± 1 82 ) % ,两组比较差异有非常显著意义 (P <0 0 1)。牛晶状体上皮细胞S期的细胞数量占细胞总数的百分比D组为 ( 2 3 4± 2 8) % ,E组为( 19 9± 2 3) % ,两组比较差异有显著意     

外伤眼迁移视网膜色素上皮细胞增生活性的观察

目的观察外伤眼经玻璃体切割手术获取的增生组织内迁移视网膜色素上皮(RPE)细胞增生活性随伤后不同时间、不同外伤类型变化的特点。方法利用细胞增生标志物Ki67和PCNA的单克隆抗体对22例外伤眼增生标本进行免疫组织化学染色。结果伤后迁移RPE细胞增生活性迅速升高,1.5个月前后分组比较,Ki67表达率(LI)分别为38.27%和10.82%(P=0.0000);PCNALI分别为32.91%和18.09%(P=0.0273)。病程延长和增生性玻璃体视网膜病变(PVR)加重,RPE细胞增生活性逐渐下降。1.5个月以内手术11例全部为开放伤合并视网膜脱离(RD),Ki67LI为38.27%,6例无RD病例Ki67LI为18%,(P=0.0031)。结论眼外伤后迁移RPE细胞增生活性迅速升高,合并RD是发生PVR的重要危险因素。早期实施玻璃体切割手术将有效地清除异常增生的RPE细胞,减少合并症的产生。     

端粒酶反义寡核苷酸抑制视网膜色素上皮细胞增殖的实验研究

目的：使用脂质体介导的端粒酶反义寡核苷酸对闭端粒酶基因在视网膜色素上皮细胞的表达从而抑制视网膜色素上皮细胞的增殖,为增殖性玻璃体视网膜病变的治疗探索一条基因治疗途径。方法：使用端粒重复序列扩增法（Telomeric repeat amplification protocol,TRAP)定性,定量检测浓度为0umol/L,2umol/L,4umol/L,6umol/L,8umol/L脂质体介导的端粒酶反义寡核苷酸及浓度为4umol/L的正义寡核苷酸在视网膜色素上皮细胞粒酶活性表达。结果：TRAP结果显示随着端粒酶反义寡核苷酸浓度的增高,视网膜色素上皮细胞端粒酶活性逐渐降低,8umol/L几乎没有表达,正义寡核苷酸很少抑制视网膜色素上皮细胞端粒酶活性。结论： 质体介导的端粒酶反义寡核苷酸能抑制视网膜色素上皮细胞端粒酶的活性从而抑制视网膜色素上皮细胞的增殖。     

维生素E对IL-6作用的视网膜色素上皮细胞增生及胶原合成的影响

目的 探讨白细胞介素-6(IL-6)对视网膜色素上皮(RPE)细胞增生及胶原合成的作用，以及维生素E对这种作用的影响。方法 采用放射自显影的方法测定RPE细胞增生和胶原合成。用含IL-6和不同浓度维生素E的EMDM培养基培养RPE细胞，加入氚标记的胸腺嘧啶核苷(^3H-TdR)和氚标记的脯氩酸(^3H-proline)，测定每分钟闪烁值cpm，反映^3H-TdR和^3H-proline的掺入量，即RPE细胞增殖和胶原合成情况。结果 IL-6与RPE细胞共同孵育后，^3H-TdR和^3H-proline的掺入量较单纯RPE细胞培养组明显升高，提示IL-6促进RPE细胞增牛明显，胶原合成显著增加：不同浓度的维生素E和IL-6共同培养的RPE细胞^3H-TdR和^3H-proline的掺入量较单纯IL-6培养的RPE细胞组明显降低。且维生素E浓度越高，^3H-TdR和^3H-proline的掺入量越低，提示维生素E抑制IL-6引起的RPE细胞的增生和胶原合成，且抑制作用随浓度的增加而增加。结论 IL-6对RPE细胞的增生和胶原合成有促进作用，维生素E抑制IL-6引起的RPE细胞的增生和胶原合成，抑制作用与维生素E浓度成正比。     

增殖细胞核抗原与bc1-2在培养的人视网膜色素上皮细胞的表达

目的观察培养的人视网膜色素上皮细胞（ｒｅｔｉｎａｌｐｉｇｍｅｎｔｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｓ，ＲＰＥ）的增殖细胞核抗原（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅｃｅｌｎｕｃｌｅａｒａｎｔｉｇｅｎ，ＰＣＮＡ）和ｂｃ１－２的表达。方法用ＳＡＢＣ法对培养的人ＲＰＥ作鼠抗人ＰＣＮＡ单抗及兔抗人ｂｃ１－２抗体免疫组织化学染色。结果ＲＰＥ在接种后２４小时和４８小时，ＰＣＮＡ的阳性率分别为３１．２％和５０．６％，阳性染色位于细胞核内，斑块状。ｂｃ１－２的表达为７６％～９０％，阳性染色在细胞浆，细颗粒状。结论培养中一半ＲＰＥ有ＰＣＮＡ抗原表达，提示这些细胞处于Ｓ期；ｂｃ１－２抗原在大多数ＲＰＥ表达阳性。这些生物标记物可能与培养的ＲＰＥ生长活性有关。     

实验性视网膜脱离及复位后视网膜色素上皮细胞抗增殖性细胞核抗原的表达

目的 观察视网膜脱离和复位过程中抗增殖性细胞核抗原(proiferating cell nuclear antigen, PCNA)表达的状况，以评价其在接触抑制机制中的意义。 方法 对72只猫眼行晶状体 囊外摘除和玻璃体切除手术。3周后，利用微穿刺技术制作视网膜脱离和复位动物模型，在不同时间取眼球并制成组织切片。采用免疫组织化学方法，观察视网膜脱离后视网膜色素上皮(retinal pigment-epithelium, RPE)细胞PCNA的表达。光镜下确定PCNA阳性的RPE细胞并量化增殖反应。采用方差分析(ANOVA)方法 ，对脱离组的脱离区和非脱离区及复位组复位区RPE细胞层PCNA的表达水平进行比较。 结果 在视网膜脱离后24 h，脱离组脱离区视网膜RPE细胞层出现PCNA阳性细胞 ，5～6 d达到高峰，20 d后逐渐回落。在复位组复位区，PCNA标记的RPE细胞明显少于脱离组脱离区。脱离组非脱离区视网膜很少有PCNA标记的RPE细胞。3组PCNA标记的RPE细胞数比较，差异有显著性的意义。 结论 视网膜脱离诱导RPE细胞增殖，而视网膜复位后这种增殖受到抑制。表明视网膜复位过程中，接触抑制的机制在发挥作用。（中华眼底病杂志，2003，19：20-23）     

白细胞介素-6反义寡核苷酸抑制人视网膜色素上皮细胞表达白细胞介素-6

目的　观察人视网膜色素上皮 (retinalpigmentepithelium ,RPE)细胞表达白细胞介素 6(interleukine 6 ,IL 6 )和IL 6反义寡核苷酸 (antisenseoligonucleotide ,ASON)从基因水平阻断RPE细胞表达IL 6的效应 ,为增生性玻璃体视网膜病变的防治寻找新的药物。方法　将培养的人RPE细胞以IL 1β刺激后 ,用酶联免疫吸附试验 (enzymelinkedimmunosorbentassay ,ELISA)、免疫组化染色及原位杂交等方法 ,观察RPE细胞表达IL 6蛋白质和mRNA的情况。结果　在IL 1β介导下 ,RPE细胞对IL 6蛋白质的表达呈时间和剂量反应关系。用IL 1β刺激 8h ,对照组RPE细胞培养上清液中IL 6蛋白质含量为 2 0 0× 10 6g/L ;IL 6ASON (浓度为 2 0 0× 10 5mol/L)组的IL 6蛋白质含量明显降低 ,为 5 5 0×10 7g/L ;两组比较差异有显著意义 (t=4 5 18,P <0 0 1)。免疫组化染色结果显示 ,对照组RPE细胞胞浆中IL 6蛋白质的表达呈深浅不一的棕黄色 ,IL 6ASON组染色则较浅 ;两组比较差异有显著意义(t=2 32 5 ,P <0 0 5 )。原位杂交结果表明 ,对照组RPE细胞胞浆中IL 6mRNA的表达呈紫蓝色 ,而IL 6ASON组染色较淡 ;图像分析结果显示 ,两组灰度值差异有显著意义 (t=3 74 6 ,P <0 0 1)。结论在IL 1β刺激下 ,人RPE细胞可明显表达IL 6蛋白     

钙调素抑制剂对视网膜色素上皮细胞增殖的抑制作用的研究

目的：探讨三氟拉嗪（ｔｒｉｆｌｕｏｐｅｒａｚｉｎｅ,ＴＦＰ）对视网膜以素上皮（ｒｅｔｎａｌ ｐｉｇｍｅｎｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ,ＲＰＥ）细胞生长、增殖以及细胞周期的影响,为ＴＦＰ治疗增殖性玻璃体视网膜病变（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｖｉｔｒｅｏｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ,ＰＶＲ）提供理论依据。方法：通过细胞生长曲线的测定,观察不同浓度（５、１０、１５、２０μｍｏｌ／Ｌ）ＴＦＰ对ＲＰＥ细胞生长的影响     

舒拉明对碱性成纤维细胞生长因子促进人视网膜色素上皮细胞增殖作用拮抗效应的研究

目的探讨舒拉明抗增生性玻璃体视网膜病变(PVR)的作用及机制。方法采用体外培养的人眼视网膜色素上皮(RPE)细胞,总共10组。其中5个对照组的培养基中分别加入终浓度为1、10、100、500ng/ml的bFGF和3125μg/ml的舒拉明。实验组4组,培养基中除加入3125μg/ml的舒拉明外,还分别加入终浓度为1、10、100和500ng/ml的bFGF。另设1组空白组。培养48h后,采用MTT法,酶联免疫检测仪测定各孔吸光度(A)值,计算细胞的增殖率。采用析因分析比较bFGF和舒拉明的交互效应和单独效应。结果各组细胞生长无明显的形态学差异。舒拉明与bFGF存在拮抗性交互效应(F=673,P<001)。对照组比较空白组,全部bFGF组A值都增加,最大A值为bFGF的10ng/ml浓度组;舒拉明组则降低;实验组中,各组A值较bFGF对照组都下降,最大A值左移对应bFGF的100ng/ml浓度组。结论舒拉明能够拮抗bFGF促RPE细胞增殖的作用,其抑制RPE细胞增殖并进一步防治PVR的机制至少包括拮抗了生长因子的生物学效应。     

视网膜色素上皮细胞中诱导型一氧化氮合酶、 精氨酸代谢相关酶的表达及一氧化氮对 细胞紧密连接的影响

目的研究在免疫活化的视网膜色素上皮（RPE）细胞中诱导型一氧化氮合酶（iNOS）被诱导、产生NO时，其底物精氨酸的来源；产生的NO对RPE细胞紧密连接的影响。方法用干扰素γ（IFNγ）、肿瘤坏死因子α（TNFα）、脂多糖（LPS）刺激大鼠视网膜色素上皮细胞系（RPE-J）细胞，Northern blotting、Western blotting方法研究RPE-J细胞内精氨酸再生系瓜氨酸NO循环的相关酶的表达及地塞米松和环磷酸腺苷（cAMP）对iNOS表达的影响。并通过免疫细胞化学和Western blotting方法，研究产生的NO对RPE J细胞紧密连接功能的影响。结果活化的RPE-J细胞中，iNOS和精氨酸的再生系瓜氨酸 NO 循环相关酶精氨酸琥珀酸合成酶（AS）在mRNA和蛋白质水平同时被诱导，精氨酸琥珀酸裂解酶（AL）没有被诱导，同时产生NO，cAMP可以增加NO的产量。NO不仅以精氨酸为底物产生，而且也可由瓜氨酸产生。产生的NO破坏RPE-J细胞的紧密连接功能，与紧密连接相关蛋白ZO 1的合成量减少。结论在活化的RPE-J细胞中产生NO时，由瓜氨酸 NO循环再生的精氨酸是RPE-J细胞中产生NO的底物精氨酸的主要来源；NO对RPE-J细胞的紧密连接起破坏作用。(中华眼底病杂志,2005,21:32-36)     

碱性成纤维细胞生长因子诱导牛晶状体上皮细胞增殖细胞核抗原的表达及对晶状体上皮细胞增殖作用的研究

目的 观察碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF)诱导牛晶状体上皮细胞（bovine lens epithelial cell,BLEC)增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA)表达及对BLEC增殖的作用。方法 取体外培养的第2代BLEC,加入不同浓度的bFGF(0.01-100.00μg/L）共同培养24－96h后,用^3H-TdR掺入法测定BLEC DNA合成率,用流式细胞仪检测细胞周期和PCNA的表达。结果 不同浓度的bFGF有促进BLEC增殖作用,并呈剂量时间依赖性,当浓度为10.00μg/L的bFGF作用BLEC24－48h后,晶状体上皮细胞的^3H-TdR掺入值分别为11772．5和10988．2,较对照组的6550．5增加约一倍,两组比较差异有显著意义（P＜0．05）。bFGF作用BLEC可使PCNA表达率上升（77．40％）,并使BLEC周期发生变化,S期细胞和G2／M期细胞比例分别提高至23．41％和20．76％,与对照组比较,差异有显著意义（P＜0．05）。结论 bFGF通过上调BLEC的PCNA表达,改变细胞周期,致使BLEC进入增殖状态。     

特发性脉络膜新生血管采用光动力疗法后视网膜色素上皮损伤的研究

目的探讨特发性脉络膜新生血管（CNV）采用光动力疗法（PDT）后视网膜色素上皮（RPE）损伤的原因。方法对43例（45只眼）接受PDT治疗的特发性CNV患者资料进行回顾性分析,以25例（27只眼）CNV膜大小接近的病理性近视合并CNV患者作为对照。分析治疗后4周的荧光素眼底血管造影图像,判断病灶周围色素上皮的透见荧光情况,探讨治疗后8-12周CNV患者的复发原因。结果特发性CNV患者经初次治疗后,PDT光照区内有21只眼的RPE发生改变,二次治疗后又增加了1只眼,RPE改变的发生率约为48．9％,而病理性近视组仅2只眼经PDT治疗后RPE发生改变。随访期内4例特发性CNV患者经PDT治疗后CNV明显扩大。两组CNV患者男女比例基本相同,其男女RPE改变的发生率差异也无统计学意义（P〉0．05）。与病理性近视的CNV患者相比,特发性CNV患者的发病年龄较轻,而病理性近视的CNV患者经治疗后出现RPE改变的2例患者中,1例为37岁,1例为15岁。结论特发性CNV患者经PDT治疗后病灶周围出现RPE损伤,提示年轻患者易出现治疗后的过度反应。