阴道毛滴虫沉寂信息调节因子Sir2同源基因克隆和蛋白表达

目的克隆并分析阴道毛滴虫(Trichomonasvaginalis)沉寂信息调节因子Sir2基因,构建原核表达重组载体,表达重组蛋白,并制备抗体进行相关功能的研究。方法从阴道毛滴虫cDNA表达文库中分离获得阴道毛滴虫Sir2同源基因的cDNA克隆、测序,并采用相关在线程序及软件进行序列分析。将cDNA部分片段亚克隆到原核表达载体pET-41a,转化宿主菌E.coliBL21,IPTG(isopropylthio-β-D-galactoside)诱导表达,亲和层析法纯化表达产物并对表达产物进行SDS-PAGE鉴定之后,用纯化重组蛋白免疫豚鼠获得抗血清,对重组蛋白和滴虫总蛋白进行蛋白质印迹鉴定。结果在阴道毛滴虫cDNA文库中获得一株1034bp的cDNA克隆,序列分析表明,该序列开放阅读框有912bp,推测肽链具有304个氨基酸,等电点(PI)5.5。该肽链与酵母SIR2p蛋白及其同源物一致性高达30%～47%,并具有SIR2p及其同源蛋白的三个高度保守的特征性结构域。进化树结果显示,TvSIR2p接近线虫的SIR2蛋白,与同时克隆到的基因组TvSir2比较序列一致,证明该TvSir2基因组DNA不含内含子。PCR扩增出890bp片段,植入表达载体pET-41a;经酶切鉴定后取阳性克隆用IPTG诱导表达,产生融合蛋白产物经SDS-PAGE鉴定相对分子质量为62000,与预期分子质量相符。用该融合蛋白免疫豚鼠得到的抗体,经Westernblotting检测其与相应融合蛋白发生特异性反应,同时在33000处也能识别滴虫虫体全蛋白。结论推测该克隆是阴道毛滴虫Sir2的同源基因,该基因没有内含子,它可能参与阴道毛滴虫的组蛋白去乙酰化作用及调节衰老和寿命。阴道毛滴虫Sir2基因可以在大肠杆菌中得到表达,并获得了相应的抗血清,为进一步研究其功能奠定了基础。     

EOLA1基因5'侧翼区的克隆及调控功能初步研究

目的研究内皮细胞高表达脂多糖相关因子1(endothelial-overexpressed lipopolysaccharide-associated factor 1,EOLA1)基因5'侧翼区的调控序列.方法通过基因组步移克隆EOLA1基因5'侧翼区不同长度的片段,插入β-半乳糖苷酶(β-gal)报告基因载体,分析各片段在ECV304细胞中的β-gal调节活性.结果含EOLA1基因5'侧翼区-1～-2 659 bp和-1～-1 951 bp序列的重组质粒在ECV304细胞中能明显表现β-gal上调活性,而-1～-361 bp序列的重组质粒活性无明显变化.结论 EOLA1基因5'侧翼区-361～-1 951 bp内存在基因转录启动子元件.     

恙虫病东方体Karp株47kDa蛋白成熟肽的克隆与表达

目的 :克隆表达恙虫病东方体 (Orientiatsutsugamushi,Ot)Karp株 4 7kDa表面蛋白的成熟肽 ,探索其作为疫苗及诊断抗原的可能性。方法 :采用PCR方法 ,从 OtKarp株菌种基因组DNA中扩增出 4 7kDa成熟蛋白基因片段 ,将该片段克隆于原核表达载体pQE30 ,构建成重组质粒pQE30 4 7,转化大肠杆菌 (E coli) ,经IPTG诱导表达 ,SDS_PAGE和Western_blotting检测目的蛋白的表达。结果 :①获得长约 12 72bp的OtKarp株 4 7kDa外膜蛋白基因 ;②SDS_PAGE和免疫印迹显示该重组质粒转化的E coli有一相对分子量约为 4 3× 10 4 的独特蛋白带 ;③重组表达质粒序列分析结果显示pQE30 4 7中插入的基因片段的序列与已报告的OtKarp株 4 7kDa外膜蛋白基因序列基本一致 ,并与已知序列相同。结论 :获得了OtKarp 4 7kDa蛋白基因 ,并在E coli中实现了表达 ,表达的重组蛋白具有免疫反应性     

人载脂蛋白M的表达与纯化

目的:表达人细胞外全长结构域重组人载脂蛋白M(apolipoprotein M,ApoM)并将其纯化.方法:利用人类肝脏cDNA文库做模板,聚合酶链反应(PCR)法扩增ApoM DNA,将测序正确的目的基因片段插入质粒pGEXT相应住点,插入E.coli JM109,转化E.coli DL21(DE3),IPTG诱导蛋白表达.结果:PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳证实在SDS-PAGE上出现一条560bp的基因片段.测序结果与GenBank公布的人ApoM基因序列完全一致.ApoM cDNA基因片段经IPTG诱导表达重组蛋白,SDS-PAGE电泳分析表明在相对分子量24 kD左右出现新的蛋白条带.结论:成功克隆出人ApoM基因,重组表达出ApoM蛋白.     

阴道毛滴虫Rab1a基因的cDNA克隆及重组表达

目的克隆和分析阴道毛滴虫(Trichomonasvaginalis,Tv)Rab1a基因,构建Rab1a基因表达重组载体并表达其融合蛋白,以进一步探讨其功能。方法提取阴道毛滴虫基因组DNA为模板,扩增TvRab1a基因,用pQE80L载体与TvRab1acDNA克隆构建原核表达重组体并表达融合蛋白,纯化表达产物并由SDS-PAGE鉴定。结果在阴道毛滴虫cDNA文库克隆中发现了Rab1a基因,序列分析显示Rab1a基因的基因组DNA序列含有一个25bp大小的内含子。成功构建了pQE/Rab1a原核表达重组体,并表达出预期大小的重组蛋白质。结论分析表明TvRab1a基因是阴道毛滴虫Rab1鸟苷三磷酸酶同源基因,它含有一个25bp的内含子。获得了该基因的重组蛋白,将对TvRab1a基因的功能进行进一步研究。     

LHS cDNA的部分克隆及其表达对肝癌细胞行为的影响

目的:克隆在肝癌组织中低表达的差异显示片段L2的基因cDNA序列,并初步探讨其在肝癌发生、发展过程中的作用.方法:将L2在GenBank中拼接后,分析其序列结构,并构建正义真核表达质粒,转染BEL-7402肝癌细胞后,对转染细胞增殖、粘附、迁移和侵袭等指标进行测定.结果:克隆得到一条1 005 bp的cDNA,其5′端712 bp与人Liprinβ1 cDNA 5′端调控序列和外显子1,2,3序列同源(100%),而3′端293 bp与Liprinβ1基因内含子4同源(100%).其间有一个510 bp开放阅读框架,起始密码位置与Liprinβ1基因相同,推断的蛋白产物除C端13个氨基酸残基外,其余均与Liprinβ1同源.此cDNA暂命名为LHS (Liprinβ1-homologous sequence).LHS cDNA正义转染BEL-7402肝癌细胞系,对于细胞的增殖活性和侵袭能力无明显影响,但可降低肝癌细胞在层粘连蛋白上的粘附和迁移能力.结论:LHS表达下调可能在肝癌的转移过程中起重要作用.     

阴道毛滴虫衰老相关基因Tv-Sir2-like克隆与序列分析

目的：克隆单细胞模式生物阴道毛滴虫(Tv)Sir2基因，以便探讨其功能。方法：构建Tv cDNA表达文库，筛选出Tv-Sir2-like基因，并对该基因进行序列分析。结果：成功克隆Tv-Sir2-1ike基因。测序及序列分析显示，Tv-Sir2-1ike如基因开放读码框长1116bp，编码371个氨基酸残基的蛋白质。该氨基酸序列与SIR2的同源性最高，并具有SIR2 3个特征性的高度保守结构域。结论：推测Tv-Sir2-like是Sir2的同源基因，其表达产物可能参与Tv转录沉默，并调节Tv的细胞周期。     

结核分枝杆菌furA基因片段的克隆、表达和分离纯化

目的: 获得结核分枝杆菌furA基因片段并高效表达、纯化. 方法: 用PCR技术从MTB毒株H37Rv-DNA中扩增出相应大小的DNA片段,将片段与pGEM-T-easy 载体连接后测序. 将测序正确的furA按照BamHⅠ和HindⅢ酶切位点克隆入原核表达载体pRSET-A,将连接产物转化入E.coli BL21,挑出阳性克隆,IPTG诱导表达重组的(His)6融合蛋白. 对重组融合蛋白通过镍柱进行纯化. 结果: PCR获得的furA序列与Genbank报道的一致(为453 bp). 重组载体在E.coli BL21中以可溶形式高效表达,融合蛋白经SDS-PAGE和Western blot分析,在Mr为23.0×103处有特异的蛋白条带,目的蛋白表达量占菌体总蛋白量的10%,重组蛋白经镍柱进行纯化后,得到了高纯度的FurA融合蛋白. 结论: 成功克隆结核分枝杆菌furA基因片段,并在E.coli BL21中高效表达,亲和层析纯化后获得高纯度FurA融合蛋白.     

小鼠PGRP-L分子PGRP结构域基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的 克隆小鼠长型肽聚糖识别蛋白（PGRP—L）的PGRP结构域基因并在大肠杆菌中表达。方法采用RT-PCR技术。从Balb／C小鼠肝组织总RNA中扩增PGRP—L的PGRP结构域基因片段,将其克隆人pUCm-T载体,以PCR、酶切和测序进行鉴定。以PCR从含PGRP结构域基因的重组质粒中扩增目的基因片段,插入表达质粒pQE-30构建重组表达质粒,转化大肠杆菌M15,诱导表达并纯化目的蛋白。结果RT—PCR扩增得到约500bp的基因片段,将其与pUCm-T载体连接构建成重组质粒prnPGRPd,其酶切图谱与计算机分析结果一致,该基因片段长518bp,序列与Genbank中相应基因序列相同。构建成重组表达载体pQE-PGRPd,在大肠杆菌M15中表达,表达产物主要存在于菌体裂解液上清中,为一相对分子质量约29000的可溶性蛋白。结论成功克隆并原核表达了小鼠PGRP—L分子PGRP结构域基因,为PGRP—L分子的研究奠定了一定基础。     

法国梧桐花粉变应原Pla a1基因的克隆与原核表达

目的克隆编码法国梧桐花粉主要变应原(Platanus acerifolia pollen allergen 1)的Pla a1基因,并构建原核表达载体进行表达。方法采用RT-PCR法从法国梧桐花粉总RNA中扩增Pla a1基因全长cDNA以及不含信号肽的编码区,克隆至pMD18-T载体中进行测序。采用SalⅠ SphⅠ双酶切,将不含信号肽的编码区定向亚克隆到pQE-30载体,形成原核表达载体pQE-30-Pla a1E,转化大肠杆菌M15菌株,PCR和酶切图谱鉴定为阳性的克隆子采用IPTG诱导表达,采用SDS-PAGE电泳检测蛋白表达结果。结果通过RT-PCR从法国梧桐花序总cDNA中扩增出了Pla a1基因的全长cDNA,与已报道序列基本一致,但发现该基因在非编码区存在SNP位点,尤其是在起始密码子ATG之前的Oligo A序列存在长度多态性。本研究还克隆了一条与Pla a1高度同源的新基因Pla a1′的大部分编码区序列。以基因组DNA为模板的对比克隆表明,该基因没有内含子。克隆子菌液PCR和质粒酶切图谱鉴定均表明,pQE-30-Pla a1E构建成功。IPTG诱导的含有pQE-30-Pla a1E的大肠杆菌M15菌液表达的具有6×His标签的PLA A1E蛋白,经SDS-PAGE电泳,显示了一条约16kd的条带。结论发现了法国梧桐花粉主要变应原Pla a1基因的多态性位点,克隆了与其高度同源的另一条新基因Pla a1′的大部分编码区,成功构建了原核表达载体pQE-30-Plaa1E,并在大肠杆菌中获得高效表达,为获得重组纯化Pla a1变应原并用于花粉变应性疾病的诊治奠定了基础。     

阴道毛滴虫两个Sir2同源基因的克隆和功能

目的探讨寄生性原虫阴道毛滴虫细胞生长和衰老的相关基因。方法从阴道毛滴虫的cDNA表达文库中分离出两个与酵母沉寂信息调节因子（Sir2）有较高同源性的cDNA克隆,分别命名为TvSir2和TvSir2-like,它们的编码框分别长915bp和1116bp。结果序列分析显示这两个cDNA克隆与酵母Sir2同源性很高,其氨基酸序列中含有Sir2p及其同源蛋白三个特征性保守结构域。分别从这两株cDNA克隆中扩增出表达片段植入表达载体pET-41a,转化宿主菌E.coli BL21并用IPTG（isopropylthio-β-D-galactoside）诱导表达到大量融合蛋白。用亲和层析法纯化的融合蛋白分别免疫豚鼠,获得的抗血清用Western-blot法识别到滴虫虫体全蛋白中大小为34000Mr和42000 Mr的条带。免疫荧光法检测TvSir2和TvSir2-like蛋白位于细胞核外的内质网和高尔基复合体区域。结论TvSir2和TvSir2-like克隆是酵酶Sir2的同源基因,为TvSir2和TvSir2-like在模式生物阴道毛滴虫的功能研究奠定了基础。     

SARS冠状病毒S蛋白基因片段的表达及其单克隆抗体的制备

目的: 表达SARS冠状病毒S蛋白片段,并制备特异性单克隆抗体(mAb).方法: 原核表达SARS冠状病毒S蛋白片段,从SARS病毒cDNA中扩增S蛋白(N端205至419aa)基因片段,测序结果正确.将该基因片段插入pQE-30中,构建重组质粒pQE-30-S1m,以重组质粒转化E.coli M15诱导表达His-S1m蛋白.纯化后免疫BALB/c小鼠,经融合、筛选制备特异性mAb.结果: 表达并纯化了重组蛋白His-S1m,获得1株抗His-S蛋白的mAb1H2.Ig亚类鉴定为IgG1a,轻链为κ型.经Western blotting检测,mAb1H2与S蛋白发生特异性反应,而与His蛋白无交叉反应.结论: 成功表达了重组S蛋白并制备了特异性mAb,为SARS-CoV的早期诊断及进一步研究S蛋白的功能奠定了基础.     

伤寒沙门菌fljB∶∶lacZ变异株的制备

目的:为研究伤寒沙门菌z66鞭毛抗原编码基因fljB的表达调节机制,建立该fljB基因的β-半乳糖苷酶基因(lacZ)插入变异株。方法:采用自杀质粒介导的同源重组方法进行制备。设计加接KpnⅠ和SalⅠ的特异性引物,用PCR扩增获得fljB基因的上、下游同源性DNA片段,并与用KpnⅠ和SalⅠ酶切pSV-β-半乳糖苷酶载体(pSV-β-galactosidase vector)的片段定向连接,将连接片段克隆至自杀质粒pGMB151,再通过电击法将重组质粒转入伤寒沙门菌,在含X-Gal的蔗糖平板上筛选获得同源重组的变异株。结果:经筛选获得阳性克隆,经PCR及序列分析证实,fljB基因中的763 bp被3550 bp的lacZ片段替代。结论:成功构建伤寒沙门菌flj∶∶lacZ突变株,为进一步研究fljB基因表达调节机制奠定了基础。     

多囊蛋白1表达载体的构建及表达

目的：体我表达并纯化多囊蛋白1胞外区片段。方法：提取健康人肾组织总RNA，用一步法RT－PCR选择扩增编码多囊蛋白1胞外多拷贝区的2个cDNA片段，并将之克隆到融合蛋白表达载体pQE30中，转染含有阻遏质粒pREP4的大肠杆菌M15。异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达融合蛋白，用亲和层析法纯化。纯化产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳及蛋白质印迹分析鉴定。结果：克隆到2个编码多囊蛋白1胞外区的cDNA片段，其大小分别为502bp和471bp。构建的表达质粒pQE30-PKD1el和pQE-30-PKDle2经限制性内切酶酶切和DNA测序证实为所需要的质粒。表达出相对分子质量分别为19800，189000的融合蛋白，经蛋白质印迹分析鉴定为多囊蛋白1的融合蛋白。结论：本实验克服了PKD1基因在体内多个同源序列的干扰，克隆了编码多囊蛋白1胞外多拷贝区的cDNA序列，并成功地获得了融合表达的目的蛋白，为进一步制备抗多囊蛋白1胞外区的抗体创造了条件。     

结核分枝杆菌furB基因的克隆、表达和纯化

目的: 从H37Rv基因组中扩增furB并高效表达和纯化. 方法: 用PCR技术从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增furB序列,将其与pGEM-T-Easy载体连接转化E.coli DH5α,构建重组克隆载体pGEM-T-Easy/furB,测序正确后将目的基因片断克隆入pQE-80L原核表达载体并转化E.coli DH5α,IPTG诱导目的蛋白表达. 经Western blot鉴定目的基因与(His)6融合表达,将已表达的蛋白质通过Ni2 -NTA亲和色谱柱进行纯化. 结果: PCR得到结核分枝杆菌furB,测序结果与Genbank中报道的完全一致. SDS-PAGE显示,在Mr为15.0×103处有相应的蛋白质表达条带,Western blot鉴定为(His)6融合表达蛋白. 经Ni2 -NTA亲和色谱柱进行纯化后可得到纯化的蛋白. 结论: 成功克隆了铁调节蛋白基因furB序列,并在E.coli DH5α高效表达,亲和层析后获得了纯化目的蛋白.     

凋亡抑制蛋白Livin两种异构体真核表达载体的构建及表达鉴定

目的构建凋亡抑制蛋白Livin两种异构体(Livinα和β)真核细胞表达载体pcDNA3.1-Livin α和pcDNA3.1-Livin β.方法利用分子克隆技术,首先设计合成扩增Livin基因异构体全长cDNA序列的特异性PCR引物,以肺腺癌SPC-A1细胞总RNA为模板,RT-PCR获得Livin基因异构体全长cDNA序列,TA克隆将Livin全长cDNA序列克隆到T载体上,用限制性内切酶HindⅢ和Xba Ⅰ双酶切取所需目的片段,然后将该片段插入真核表达载体pcDNA3.1的多克隆位点,最后对产生的重组子进行双酶切、PCR鉴定,并经过测序证实后,构建成为Livin基因异构体表达载体(pcDNA3.1-Livin).电穿孔法获得稳定表达Livin α和β的A549细胞克隆,Western blot验证Livin蛋白在转染细胞中的表达情况.结果成功获得Livinα和Livin β全长cDNA序列,并克隆到真核表达载体pcDNA3.1上;基因转染后,阳性细胞分别表达Livinα和β.结论Livin基因两种异构体真核表达载体的构建及在细胞中的表达鉴定,为进一步研究Livin异构体功能及在肺癌细胞中的抗凋亡效应奠定了基础.     

人β-防御素-3与人表皮生长因子融合蛋白的克隆及原核表达

目的:克隆融合蛋白d-EGF成熟链基因,构建原核表达载体,并在大肠埃希菌(E.coli)表达体系中进行有效表达、分离纯化并鉴定其特异性。方法:以蛋白基因序列为基础,RT-PCR扩增人防御素-β和表皮生长因子基因,分别构建β-防御素-3(β-defensin-3)、EGF重组质粒,应用重组PCR方法,将EGF的DNA序列拼接到β-defensin-3 DNA序列的3'端,将基因克隆入原核表达载体pET-SUMO,构建重组质粒pET-SUMO-d-EGF。采用PCR、测序等方法鉴定后转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达,Ni-trap柱纯化,SDS-PAGE检测表达及纯化结果,最后以Western blot对其进行特异性鉴定。结果:成功构建β-defensin-3、EGF重组质粒,经重组PCR成功扩增出294 bp的目的片段,重组体PCR结果与预期结果一致,测序正确。转入重组质粒的E.coli BL21(DE3)经IPTG诱导经SDS-PAGE分析得到28 kDa左右的目的蛋白条带。Western blot鉴定出融合蛋白含有抗EGF、β-防御素-3两种抗原特异性的蛋白。结论:成功构建原核表达载体pET-SUMO-d-EGF,并获得纯化的融合蛋白,为进一步的活性分析奠定了实验基础。     

弓形虫RH株微线体蛋白MIC3基因的克隆与表达

目的 克隆和表达弓形虫微线体蛋白MIC3基因。方法 从弓形虫RH株分离总的RNA,反转成cDNA.根据MIC3基因序列,设计合成一对引物,用聚合酶链式反应(PCR)方法从弓形虫cDNA中扩增MIC3基因片段,插入pGEM-T载体,并转化大肠杆菌Top10,经PCR、双酶切、测序验证后,将MIC3基因片段定向亚克隆到载体pET-28a中构建原核表达重组质粒pET-28a-MIC3,重组子在E.coli BL21中经IPTG诱导表达,并对表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析。结果 从弓形虫RH株cDNA中扩增出792bp大小的MIC3基因片段并诱导表达27 300 Mr的重组MIC3蛋白。结论 成功构建和表达了弓形虫pET-28a-MIC3重组质粒,为弓形虫病诊断抗原和疫苗的研究莫定了基础。     

肿瘤抗原基因MAGE-3的克隆、原核表达与纯化

目的: 克隆人MAGE-3基因并进行原核表达和分离纯化. 方法: 通过RT-PCR从人黑色素瘤细胞株中扩增MAGE-3全长cDNA,经PCR扩增MAGE-3基因3′端324 bp片段,克隆入pGEX-4T-1载体,构建重组原核表达质粒pGEX/MAGE-3,对含有该质粒的大肠杆菌DH5α进行诱导表达和分离纯化.结果: 经RT-PCR扩增出大小约950 bp的基因片段,以此为模板经PCR扩增出约320 bp片段,测序结果与GenBank公布的MAGE-3序列一致,成功构建了pGEX/MAGE-3原核表达质粒,经IPTG诱导在大肠杆菌中表达Mr约42 000的GST融合蛋白,纯化的蛋白纯度为89%.结论: 成功克隆了人MAGE-3基因全长cDNA并对其3′端324 bp片段编码的108个氨基酸的蛋白进行了原核表达和分离纯化,为该蛋白应用于肿瘤免疫治疗奠定了基础.     

伤寒沙门菌fljB∷lacZ变异株的制备

目的：为研究伤寒沙门菌z66鞭毛抗原编码基因fliB的表达调节机制，建立该fljB基因的β-半乳糖苷酶基因（1acZ）插入变异株。方法：采用自杀质粒介导的同源重组方法进行制备。设计加接茚nI和SalI的特异性引物，用PCR扩增获得舻基因的上、下游同源性DNA片段，并与用Kpn I和Sal I酶切pSV-β-半乳糖苷酶载体（pSV-β-galactosidase vector）的片段定向连接，将连接片段克隆至自杀质粒pGMBl51，再通过电击法将重组质粒转入伤寒沙门菌，在含X-Gal的蔗糖平板上筛选获得同源重组的变异株。结果：经筛选获得阳性克隆，经PCR及序列分析证实,fljB基因中的763bp被3550bp的lacZ片段替代。结论：成功构建伤寒沙门菌flj∷lacZ突变株，为进一步研究fljB基因表达调节机制奠定了基础。