固定化E.coli BL21(pTrc-gsh)细胞催化合成谷胱甘肽

分别以卡拉胶、明胶、海藻酸钠包埋E.coli BL21 (pTrc-gsh)细胞催化合成谷胱甘肽(GSH).从酶活收率及机械强度方面进行比较,选择卡拉胶为包埋载体,其最适pH为7.0,最适温度为40°C.相关物质对GSH的合成均有影响半胱氨酸、甘氨酸的最适浓度为20mmol/L,谷氨酸的最适浓度为60mmol/L;Mg2+/ATP为1～5(V/V)较合适;腺苷二磷酸(ADP)浓度为5mmol/L时对酶活的抑制为20%.优化条件下罐式反应器中GSH的产量为0.84g/L,操作稳定性较好;延迟加入甘氨酸时GSH产量可提高17.5%;与酵母生产ATP体系相耦联的共固定化体系在填充床中反应,GSH合成量达1.24g/L,收率比直接加入ATP提高24.2%.     

固定化E.coliBL21（pTc—gsh）细胞催化合成谷胱甘肽

分别以卡拉胶、明胶、海藻酸钠包埋E.coliBL21（pTrc-gsh)细胞催化合成谷胱甘肽（GSH）。从酶活收率及机械强度方面进行比较，选择卡拉胶为包埋载体，其最适PH为7.0，最适温度为40℃。相关物质对GSH的合成均有影响：半胱氨酸、甘氨酸的最达浓度为20mmol/L，谷氨酸的最适浓度为60mmol/L；Mg^2 /ATP为1-5（V/V）较合适；腺苷二磷酸（ADP）浓度为5mmol/L时对酶活的抑制为20%。优化条件下罐式反应器中GSH的产量为0.84g/L，操作稳定性较好；延迟加入甘氨酸时GSH产量可提高17.5%；与酵母生产ATP体系相耦联的共固定化体系在填充床中反应，GSH合成量达1.24g/L，收率比直接加入ATP提高24.2%。     

固定化啤酒酵母细胞合成5’-三磷酸腺苷

用K-卡拉胶包埋啤酒酵母制成固定化细胞,在0.05mol/L葡萄糖,0.022mol/L腺苷酸,0.012mol/LMgSO_4·7H_2O,0.2mol/L氯化钾,0.2mol/L磷酸钾缓冲溶液(pH7.0)中,35℃反应4小时,5′-三磷酸腺苷转化率可达42%,在50ml三角烧瓶中分批反应,连续使用5次,5′-三磷酸腺苷转化率仍维持在37%以上。     

用固定化啤酒酵母细胞合成胞嘧啶核苷二磷酸胆碱

κ－卡拉胶－魔芋多糖复配胶包埋的啤酒酵母细胞，经冻融处理后用于合成胞嘧啶核苷二磷酸胆碱（CDP－胆碱）。结果表明：250mL摇瓶中加入50mL反应液（葡萄糖400mol/L，CMP10mmol/L，磷酸碍碱50mmol/L,K2HPO4-KH2PO4缓冲液100mmol/L，MgSO410mmol/L,pH=8.0），固定化细胞1200g/L,34℃、150r/min下，反应4h后补加400mmol/L葡萄糖，反应8h可使60％以上的CMP转化为CDP－胆碱。反应液经灭菌和添加辅酶I（NAD^ ）后，固定化细胞可连续使用4次，CDP－胆碱转化率维持在40％以上。     

胶束电动毛细管色谱法对三磷酸腺苷及其分解产物的分离分析

对ATP(adenosine triphosphate)及其分解产物ADP(adenosine diphosphate)、AMP(adenosine monophcsphate)等采用胶束电动毛细管色谱法进行分离分析。电动色谱系统为:毛细管柱57 cm×45 μm(I.D),石英毛细管,UV紫外检测器(波长260 nm),磷酸盐缓冲溶液(Na_2HPO_4)5 mmol/L,十二烷基硫酸钠(SDS)50 mmol/L(pH=9.06)。获得了良好的分离,为ATP的定量建立了良好的分析系统。     

同时检测脑积水脑组织中多种高能磷酸化合物的反相高效液相色谱法的建立

目的　建立能同时测定狗脑积水不同时期脑组织中肌酸 (Cr)、磷酸肌酸 (Crp)、磷酸腺苷酸 (ATP、ADP、AMP)含量的方法 ,了解脑积水不同时期脑组织的能量代谢受损状况。方法　采用反相高效液相色谱法同时测定狗脑积水脑组织中 Cr、Crp、ATP、ADP、AMP的含量。色谱柱为 Inertsil ODS- 3C18(2 5 0 mm× 4 .6 mm i.d. 5μm )分析柱 ,流动相为 :KH2 PO4 缓冲液 (330 mmol/ L ) -乙腈 - TBA(4 5 mm ol/ L ) (94 :5 .5 :0 .5 ) (p H=6 .2 7) ,检测波长为 2 10 nm。结果　最低检测限为 3.5 5～ 5 .84μmol/ L ,Cr在 5 .6 9～ 36 4 0 .5 0μm ol/ L (r=0 .9993) ,Crp 3.4 7～5 5 5 .5 0μmol/ L (r=0 .9999) ,AMP在 2 .6 9～ 172 3.0 0μmol/ L (r=0 .9993) ,ADP在 2 .6 6～ 170 4 .0 0μm ol/ L (r=0 . 9999) ,ATP在 2 .94～ 1883.5 0μ mol/ L (r=0 .9999)范围内均具有良好的线性关系。回收率为 90 .10 %～10 7.0 0 % ,日内精密度为 1.5 8%～ 3.88% ,日间精密度为 1.99%～ 4 .2 4 %。应用该方法测定了 16只狗脑积水不同时期脑组织中 Cr、Crp、ATP、ADP、AMP的含量 ,获得了良好的结果。结论　该方法准确、灵敏、快速 ,适合于脑积水脑组织中高能磷酸化合物的测定。     

胶束电动毛细管色谱法对三磷酸腺苷及其分解产物的分离分析

对ATP(adenosine triphosphate)及其分解产物ADP(adenosine diphosphate)、AMP(adenosine monophcsphate)等采用胶束电动毛细管色谱法进行分离分析。电动色谱系统为:毛细管柱57 cm×45 μm(I.D),石英毛细管,UV紫外检测器(波长260 nm),磷酸盐缓冲溶液(Na_2HPO_4)5 mmol/L,十二烷基硫酸钠(SDS)50 mmol/L(pH=9.06)。获得了良好的分离,为ATP的定量建立了良好的分析系统。     

IP-RPHPLC法检测电针后肥胖大鼠肝脏组织中ATP、ADP和AMP含量

目的 建立一种离子对反相高效液相色谱(IP-RPHPLC)法并将其用于检测电针对肥胖大鼠肝脏组织中ATP、ADP和AMP含量的影响。方法 应用岛津SIL-20AT高效液相色谱系统,Megres-C₁₈(5μm,250mm×4.6mm)耐水性色谱柱,对大鼠肝脏组织中ATP、ADP和AMP进行分离,流动相为0.18mol/L的磷酸二氢钾缓冲液(含5%甲醇且pH=6.25),检测波长为254nm,流速为0.8mL/min,进样体积为20μL,柱温为25℃。结果 ATP在1.1~212.2μg/mL(r=0.9999),ADP在0.9~180.0μg/mL(r=0.9999)及AMP在0.9~181.8μg/mL(r=0.9997)范围内线性关系良好。ATP、ADP和AMP平均回收率分别为96.4%、98.3%、100.8%;RSD分别为2.50%、2.88%、4.14%;日内和日间精密度RSD分别为0.06%~0.40%和0.06%~0.69%;准确度均在99.0%~108.6%之间;ATP、ADP和AMP检测限为0.11、0.09、0.045μg/mL。结论 建立的高效液相色谱法用于检测大鼠肝脏组织中ATP、ADP和AMP含量简便、快速并且准确可靠,为针刺干预治疗后组织中小分子生物活性物质浓度的检测等研究工作奠定了基础。      

心肌缺血再灌注损伤时细胞核被膜钙泵活性特征的研究

目的　研究心肌缺血再灌注损伤时Ca2 + 、ATP、ADP和AMP对细胞核被膜钙泵 (Ca2 + ATPase)活性的调节。方法　采用大鼠心肌缺血再灌注模型 ,密度梯度分离纯化细胞核 ,定磷法测定Ca2 + ATPase活性。结果　与正常大鼠相比 ,缺血再灌注损伤动物血浆MDA和FFA显著升高 (P <0 0 1) ;细胞核Ca2 + ATPase活性下降 ,对Ca2 + 亲和力降低 ;ADP、AMP对核Ca2 + ATPase活性的影响明显减弱 ;ATP对Ca2 + ATPase的作用在 [ATP]小于 1 0mmol L时 ,与正常细胞Ca2 + AT Pase活性无显著差异 ,浓度增至 2 0mmol L时 ,活性低于正常细胞 ,ATP浓度继续增加 ,核Ca2 + ATPase活性快速增加。结论　心肌缺血再灌注损伤时Ca2 + 、ATP、ADP、AMP对心肌细胞核Ca2 + ATPase活性的影响发生了明显改变 ,其病理生理意义值得进一步探讨。     

液相色谱法测定小鼠脑组织中ATP、ADP及AMP含量

目的建立小鼠脑组织中腺苷酸含量测定的高效液相色谱(high performance liquid chromatogram,HPLC)-可变波长检测法。方法应用酸沉淀蛋白、Agilent1200高效液相色谱系统、Supelco Discovery C18(150 mm×4.6 mm,5μm)反相色谱柱及相同填充材料的预柱,对小鼠脑组织样品中腺苷酸进行分离分析,波长为254 nm,流动相为30 mmol/L K2HPO4-KH2PO4(含5%甲醇),pH5.85,流速为1.0 mL/min,进样体积为20μL,柱温为30℃。结果腺苷酸ATP、ADP及AMP在10～100 mg/L范围,线性关系良好,线性方程为ATP:A=28.924C+14.144,γ=0.999 90;ADP:A=31.504C-12.608,γ=0.999 92;AMP:A=46.539C-5.255,γ=0.999 95。平均回收率为95.3%～103.2%;日内和日间相对标准差(RSD)分别为1.14%～1.75%、2.45%～3.97%。结论高效液相色谱-可变波长检测法可以简便、准确、有效地测定急性重复低氧小鼠脑组织中ATP、ADP和AMP的含量。     

无醛固定液与醛类固定液对细胞核DNA及细胞质着色的影响

目的 旨在探究无醛固定液与醛类固定液对细胞核DNA及细胞质着色的影响.方法 通过运用DNA定量分析系统(ICM)对分别经过8种不同固定液固定的细胞核DNA含量(IOD)、离散系数(CV)、DNA指数(DI)、细胞核面积进行测量,联合细胞学染色,分析不同固定液对核DNA及细胞质染色的影响.结果 醛类固定液优于无醛固定液,固定液中的甲醛对Feulgen-eosin联合染色有重要影响.结论 采用醛类固定液进行后固定,硫堇对细胞核DNA染色,与细胞学染色相结合,获得了良好的染色效果,为后续的多技术联合诊断提供依据.     

分化抑制因子1相互作用蛋白AGGF1的筛选

目的 利用酵母双杂交方法,筛选成人肺组织文库中与分化抑制因子1(Id1)相互作用的蛋白.方法 PCR方法扩增Id1的编码序列并定向克隆入诱饵质粒pHybLex/Zeo,构建重组诱饵质粒pHybLex/Zeo-Id1,酶切鉴定后转化人酵母株EGY48/pSH18-34,检测重组诱饵质粒有无非特异激活报告基因Leu2、LacZ作用;扩增并提取成人肺组织文库质粒,将文库质粒及重组诱饵质粒转化入酵母细胞,依次筛选Leu2 ,Leu2 LacZ 克隆;设置阴性及阳性对照,重复筛选Leu2 LacZ 克隆并排除假阳性克隆,获取真阳性文库质粒,进行测序和同源性比对.结果 酶切证实,重组诱饵质粒构建成功.重组诱饵质粒转化入酵母细胞后.经检测无非特异激活报告基因作用.扩增并筛选成人肺组织文库.获得198个Leu2 及19个Leu2 LacZ 克隆.经排除假阳性克隆,最终获得1个Leu2 LacZ 真阳性克隆,经测序和同源性比较证实该克隆与蛋白AGGF1高度同源(556/559,99.5%),Westem blotting证实其在酵母细胞中有表达.结论 利用酵母双杂交方法,通过筛选成人肺组织文库,发现Id1与AGGF1存在相互作用.     

利用膜蛋白酵母双杂交系统构建人尿道上皮细胞cDNA文库

利用基于分离的泛素介导的膜蛋白酵母双杂交技术,构建人永生尿道上皮细胞(SV-HUC-1)cDNA文库。Trizol法提取人尿道上皮细胞总RNA,并分离纯化其mRNA;以mRNA为模板,合成cDNA第一链、第二链;通过T4 DNA聚合酶将DNA链两端加上5′接头;并将其大于1 kbp的片段与膜蛋白酵母双杂交载体pPR3-N连接,经电转化大肠杆菌感受态细胞,以构建基于分离的泛素介导的膜蛋白酵母双杂交cDNA文库,并检测文库的库容量和随机性。本研究成功构建了人尿道上皮细胞的基于分离的泛素介导的膜蛋白酵母双杂交cDNA文库,为进一步研究泌尿生殖道感染病原体与宿主尿道上皮细胞的相互作用奠定了实验基础。     

固定化诺卡氏菌批次连续转化生产L(+)酒石酸

采用卡拉胶包埋具有环氧琥珀酸水解酶活性的诺卡氏菌用于生产L( )酒石酸。为了提高细胞固定化的效率,采用自制的固定化装置,将固定化细胞制成细条状,可以加快固定化细胞的制备,获得具有高活性和强度的固定化细胞颗粒,固定化细胞的最佳菌体浓度为100 g(湿细胞)/L。将固定化细胞用于填充床反应器进行反复批式反应,可以反复利用48次以上,将0.85 mol/L的环氧琥珀酸溶液转化为L( )酒石酸,酒石酸的得率不低于96%。     

人早幼粒细胞cDNA文库的构建及其鉴定

目的：构建人早幼粒细胞HL60的cDNA文库,阐明文库内相关基因在急性早幼粒细胞白血病（APL）发生发展中的相关机制。方法：采用Trizol法提取HL60细胞总RNA,离心柱法分离纯化样本中的mRNA,逆转录PCR法合成cDNA第一链,酶促法直接合成cDNA第二链,胶回收目的长度的cDNA片段后将其与pPR3-N载体连接,通过同源重组方法在酵母Y187菌株中构建人早幼粒细胞cDNA文库。将培养的菌液涂布于LB平板进行库容量鉴定,PCR法鉴定插入片段大小及分布。结果：提取到的HL60细胞RNA条带清晰无降解且弥散度低,以纯化后的细胞mRNA为模板成功合成cDNA,经胶回收cDNA片段后顺利将其与pPR3-N载体连接。将重组载体转化至酵母菌株Y187,通过同源重组方法在菌株中成功构建人早幼粒细胞cDNA文库。在原始电转化菌稀释100倍后取10 μL涂板,共长约250个克隆子,库容量为2.5×10⁶ CFU·mL^-1,转化后原始菌液共计5 mL,总库容量为1.25×10⁷ CFU。文库的插入片段电泳检测,平均插入片段大于1200 bp,阳性率为100%。结论：成功构建人早幼粒细胞的cDNA文库,为白血病的发病机制及治疗机制的研究奠定了基础。     

鼻咽癌细胞株HNE-1蛋白质二维电泳图谱的建立

目的建立及优化聚丙烯酰胺二维凝胶电泳技术,结合分析软件,全面展示鼻咽癌细胞株HNE-1的蛋白质表达谱,为进一步开展鼻咽癌的蛋白质组学研究奠定了基础。方法大规模培养HNE-1细胞,利用优化的蛋白质抽提技术获得HNE-1细胞的总蛋白。选用线性及非线性的不同pH梯度固相(IPG)干胶条对细胞总蛋白等电聚焦以及聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳,初步建立了HNE-1细胞株总蛋白质的二维电泳(2-DE)图谱。结果采用不同pH梯度范围的IPG胶条和优化的2-DE技术能够有效展示HNE-1细胞全蛋白质表达谱。结论重叠窄pH梯度范围的IPG胶条提高了2-DE中蛋白质的分离效果。     

以甲壳胺为载体固定乙酰胆碱酯酶

目的 探讨以甲壳胺为载体固定乙酰胆碱酯酶的最佳条件及固定化酶的理化性质.方法 以戊二醛为交联剂,将乙酰胆碱酯酶固定在甲壳胺上,并分别测定固定化酶与溶液酶的活力.结果 固定化酶与溶液酶的最适温度相同,均为37℃;固定化酶与溶液酶最适pH分别为8.2、8.0;固定化酶在50℃仍有较高热稳定性,而溶液酶活力明显下降;固定化酶的米氏常数Km=0.84 mmol/L,溶液酶的Km=1.16 mmol/L;固定化酶活力回收为44.66%,在重复使用8次后仍能保持原有活力的50%.结论 该固定化酶与溶液酶相比,其热稳定性提高,与底物的亲和能力增大,且重复使用性较好.