多药耐药K562/A02和敏感K562细胞来源的树突状细胞介导抗白血病效应对比研究

本研究探讨多药耐药(MDR)白血病K562/A02细胞和敏感K562细胞诱导树突状细胞(DC)分化及介导的抗白血病效应。采用慢性粒细胞白血病(CML)P170糖蛋白(Pgp)高表达的MDRK562/A02细胞、敏感K562细胞在含细胞因子GMCSF(1000U/ml)、IL4(500U/ml)和TNFα(100ng/ml)的RPMI1640完全培养液中诱导分化成DC,以光镜观察细胞形态、流式细胞术检测细胞表型,异基因混合淋巴细胞反应(alloMLR)检测T细胞增殖活性,MTT法测定细胞毒作用。结果表明:培养14天的K562/A02细胞和K562细胞均出现典型的DC形态特征,表达DC的相关分化抗原及共刺激分子CD1a、CD83、HLADR、CD80、CD86。alloMLR检测中,K562/A02DC较K562DC具有更强的刺激异基因T细胞增殖能力(P<0.05)。两种DC激活的CTL分别对K562/A02和K562细胞较HL60细胞具有显著的杀伤活性(P<0.01);更重要的是,K562/A02DC较K562DC激活的CTL对Pgp高表达的MDRK562/A02细胞、HL60/VCR细胞具有更强的细胞毒作用,杀伤活性分别为(40.7±1.3)%、(28.4±0.9)%(P<0.01)和(24.9±1.1)%、(8.2±0.7)%(P<0.01)。结论:Pgp高表达的MDR白血病细胞K562/A02和敏感K562细胞都可在GMCSF、IL4和TNFα作用下诱导分化为成熟DC,均可活化CTL产生特异的抗白血病效应;尤其K562/A02细胞来源的DC可介导针对Pgp高表达的多药耐药白血病的特异细胞毒作用。     

含CpG基序的寡核苷酸介导的脐血抗白血病细胞作用的研究

目的　观察脐血淋巴细胞经人工合成的含不同CpG基序的寡核苷酸 (CpG ODN)作用后抗白血病细胞的效应。方法　设计合成了四种含不同CpG基序的寡核苷酸 (CpG ODN1 、CpG ODN2 、CpG ODN3和CpG ODN4 )、不含CpG基序的寡核苷酸 (nonCpG ODN)和含甲基化CpG基序的寡核苷酸(ZpG ODN) ,将其分别作用于脐血淋巴细胞 ,用MTT法测定经寡核苷酸作用后的脐血淋巴细胞对白血病K5 6 2细胞的杀伤作用 ,同时用流式细胞术分析了对脐血淋巴细胞刺激作用最强的CpG ODN3作用于脐血淋巴细胞后表面分化抗原的变化。结果　不同的CpG基序对脐血淋巴细胞有不同程度的免疫刺激作用 ,其中CpG ODN3作用后脐血NK细胞对K5 6 2细胞杀伤率最强 ,且在一定范围内呈剂量依赖性变化 ,经CpG ODN3作用后脐血淋巴细胞表面分化抗原CD3、CD4 、CD1 9、CD56 表达率分别为 (6 0 .6±7 9) %、(40 .2± 3.5 ) %、(2 2 .4± 1.9) %、(15 .5± 3.1) % ,均较作用前升高 (P值均 <0 .0 5 )。结论　不同的CpG基序对脐血淋巴细胞免疫刺激作用存在差异 ,优选后的CpG ODN3可较大程度地激活脐血淋巴细胞抗K5 6 2细胞效应 ,为提高脐血抗肿瘤效应提供了新的途径     

抑制VEGF表达对白血病来源树突状细胞免疫功能的影响

目的：探讨抑制血管内皮生长因子（VEGF）对白血病来源树突状细胞（Dc）免疫功能的影响。方法：利用反义寡核苷酸下调K562白血病细胞VEGF表达，K562细胞经细胞因子作用诱生白血病DC。利用MTT法检测DC刺激正常外周血T细胞增殖的能力及DC激发的细胞毒T淋巴细胞（CTL）杀伤活性；ELISA法检测DC培养上清液中IL-12及DC与外周血单个核细胞（PBMNC）共同培养液中IFN-γ的含量。结果：K562细胞经5μmol／LVEGF反义寡核苷酸处理24h后VEGF蛋白分泌下降59％，其诱生的DC与正常K562来源的DC相比，实验组DC刺激T淋巴细胞增殖能力、CTL杀伤活性以及DC分泌IL-12和协同刺激外周血单个核细胞分泌TNF-γ的能力明显增强。结论：抑制VEGF表达可促进白血病来源DC免疫功能的成熟。     

VEGF对白血病树突状细胞诱导CTL杀伤活性的影响

目的观察血管内皮生长因子(VEGF)对白血病树突状细胞(DC)激活的CTL体外杀伤活性的影响。方法K562白血病细胞经5μmol/L VEGF反义寡核苷酸作用24 h后诱导生成DC。流式细胞术检测DC特征性表型(CD40、CD86、HLA-DR和CD83)的表达,MTT法检测DC激发的细胞毒T淋巴细胞(CTL)对靶细胞的杀伤活性。ELISA法检测DC上清中IL-12的表达。结果与正常K562诱生的DC(K562-DC)相比,K562经反义寡核苷酸下调VEGF表达后培养出具有典型特征的DC(AS-K562-DC),它不仅高表达DC免疫表型,而且激活的CTL对K562细胞具有更强的杀伤效应,同时具有更强的IL-12分泌能力(P均<0.05)。结论抑制白血病细胞VEGF表达,能够促进白血病源DC的分化和成熟,激活的CTL在体外具有更强的抗白血病效应。     

体外培养DC-CIK细胞杀伤白血病细胞的免疫效应机制研究

目的研究体外培养杀伤细胞(Cytokine-induced killer cell,DC-CIK)杀伤白血病细胞的效应机制,为研究白血病的免疫疗法提供一定的试验依据。方法收集健康成年人外周血,通过淋巴细胞分离液分离获得人单个核细胞(PBMNC),经过诱导培养获得DC和CIK,通过流式细胞仪检测DC和CIK的细胞表面抗原,共培养成DC-CIK细胞。MTT法绘制DC-CIK细胞生长曲线。K562/A02,THP-1及HL-60细胞作为靶细胞,分别以DC、CIK、DC-CIK细胞作为效应细胞,并通过MTT比色法检测细胞的杀伤效应。用ELISA分别检测DC、CIK、DC-CIK细胞上清中,IL-12、IL-17、INF-α及IFN-γ的表达量,并检测细胞表面抗原。进一步通过Real-time PCR分别分析K562/A02及与DCCIK共培养后K562/A02细胞中多药耐药基因1(MDR1)的表达差异。结果从外周血中可以分离获得较纯的DC及CIK细胞,通过共培养获得DC-CIK细胞。K562/A02,THP-1及HL-60细胞作为靶细胞,分别以DC、CIK、DC-CIK细胞作为效应细胞,随着效靶比的升高,杀伤活性逐渐上升,且DC-CIK组的杀伤活性在同效靶比组中最强(P0.01)。当K562/A02与DC-CIK细胞共培养后,其MDR1基因的表达量显著降低(P0.01)。结论体外培养DCCIK细胞可以显著提高抗K562/A02细胞活性,主要作用机理包括显著增强IL-17等免疫因子的表达以及降低MDR1的表达。     

致敏的脐血源树突状细胞诱导CTL特异杀伤白血病细胞的实验研究

探讨脐血单个核细胞（MNC）诱导的树突状细胞（DC）通过负载冻融的HL-60、K562细胞抗原体外诱导产生细胞毒性T淋巴细胞（CTL）对HL-60、K562的杀伤作用。取脐血12份,分离MNC。在MNC中加入细胞因子GM-CSF（granulocyte monocyte colony-stimulating factor）、IL-3（interleukin 3）、SCF（stemcell factor）和EPO培养4周。使用CD83、CD1a、CD11C和CDw123单克隆抗体、流式细胞仪测定培养前后脐血DC抗原变化及扩增情况。DC通过负载HL-60、K-562白血病细胞抗原致敏T淋巴细胞产生CTL^3H-TdR掺入试验测定DC免疫刺激活性,MTT法观察CTL对HL-60、K562细胞的特异性杀伤活性。结果表明：新鲜脐血CD1a^＋、CD11c^＋、CD83^＋、CDw123^＋细胞数分别为0．27×10^5／ml、5．87×10^5／ml、1．94×10^5／ml、2．73×10^5／ml。加入上述细胞因子培养的脐血MNC分化为CD1a^＋、CD11C^＋、CD83^＋、CDw123^＋DC,经培养2—4周,DC数明显增多,分别达11．02×10^5／ml、28．24×10^5／ml、10．57×10^5／ml、18．7×10^5／ml,此后逐渐减少。细胞因子诱导脐血DC具有免疫刺激活性,且DC与CBMNC细胞比例为1：40时的刺激活性最佳。冻融法得到的HL-60、K562白血病细胞抗原致敏DC诱导的CTL对HL-60、K562细胞的杀伤率分别为（42．04±8．46）％和（31．25±11．07）％,与实验组比较有显著性差异（P〈0．01）。结论：加入细胞因子GM—CSF、IL-3、SCF和EPO培养2-4周的脐血MNC可分化为cD1a^＋、CD11C^＋、CD83^＋、CDw123^＋DC。冻融法得到的HL-60、K562白血病细胞抗原致敏DC,其诱导的CTL对HL-60、K562细胞具有特异的杀伤作用。脐血DC作为抗原呈递细胞在肿瘤免疫治疗上将起到重要作用。     

人外周血树突状细胞的体外诱导培养

目的研究rhGM-CSF和rhIL-4培养体系对树突状细胞(Dendritie Cell,DC)的诱导培养.方法分离正常人或多发性骨髓瘤(MM)患者外周血中单个核细胞,体外培养树突状细胞.观察培养的DC的形态变化,并应用流式细胞仪分析DC表面的免疫分子的表达.结果100ng/ml rhGM-CSF和500U/ml rhIL-4能使正常人或多发性骨髓瘤患者外周血中单个核细胞分化发育为高表达CD80、CD86、HLAⅠ类和HLAⅡ类抗原的DC.结论rhGM-CSF和rhIL-4能使树突状细胞定向分化成为抗原提呈细胞,为DC疫苗治疗肿瘤感染性疾病奠定了基础.     

硒与树突状细胞对T细胞杀伤白血病细胞活力的影响

本研究探讨经亚硒酸钠（Na2SeO3）处理、K562细胞裂解物冲击致敏的外周血衍生的树突状细胞（DC）的生物学特性和体外诱导抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）应答的能力。健康人外周血单个核细胞（PBMNC）于体外在含3种细胞因子（rhGM—CSF、rhIL-4、TNF-α）的RPMI1640＋10％FBS培养液中培养4天，收获贴壁细胞，实验分4组：DCⅠ组：仅含DC；DCⅡ组：DC＋Se（0．5μmol／L）；DCⅢ组：DC＋K562细胞裂解液；DCⅣ组：在DCⅢ组中加入Se（0．5μmol／L）。在培养的第7天于倒置显微镜下进行活细胞观察。用流式细胞术（FCM）检测细胞表型CD1a、CD40、CD83、CD86。乳酸脱氢酶（LDH）释放试验检测CTL效应。用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定IL-12含量。结果表明：各组DC均具有典型树突状细胞形态，均较培养前集落增多。DCⅠ组和DCⅡ组的细胞形态及数量无明显差异，DCⅢ组和DCⅣ组的细胞集落数量增加，悬浮细胞比例增加。各组DC细胞的CD1a、CD40、CD83、CD86表达率较PBMNC明显增高（P〈0．01），各组间DC细胞的CD1a和CD40的表达率无明显差异，DCⅢ组和DCⅣ组的CD83和CD86的表达率均高于DCⅠ组和DCⅡ组（P〈0.01），DCⅠ和DCⅡ以及DCⅢ和DCⅣ两组之间CD83和CD86表达率均无明显差异。在效靶比例为25：1时，各组DC致敏的T淋巴细胞对K562细胞的杀伤率为15．3±2．3％、26．3±3．7％、28．2±4.5％和36．2±3．7％，均明显高于未经DC致敏的单独T淋巴细胞组（5．9±2．4％）（P〈0．01），DCⅣ组的CTL效应最强，高于DCⅠ、Ⅱ、Ⅲ组（P〈0．01），DCⅡ和DCⅢ组的CTL效应也高于DCⅠ组（P〈0．01），而DCⅡ和DCⅢ两组间CTL效应程度无明显差异（P〉0.05）；各组DC与T淋巴细胞共培养的上清液中IL-12水平为256．96±64．2、328．12±43.9、322．98±53．5和353.85±46．2pg／ml，均显著高于未经DC致敏的单独T淋巴细胞组（35?     

低氧诱导因子-1α抑制剂逆转K562/A02细胞多药耐药机制研究

目的 探讨低氧诱导因子抑制剂3-(5'-Hydroxymethyl-2'-furyl)-1-benzylindazoh(YC-1)对人白血病耐阿霉素细胞K562/A02的耐药逆转作用,并探讨逆转机制.方法 采用MTT法检测不同浓度YC-1和阿霉素(ADM)单独或联合使用48 h对K562/A02细胞和K562细胞增值抑制效应及耐药逆转效应;用流式细胞术检测0、5、10和20 μmol/L YC-1单独或联合1 mg/L阿霉素作用K562/A02细胞48 h后细胞凋亡率及联合应用后细胞内阿霉素浓度;半定量RT-PCR检测各组细胞低氧诱导因子-1α(HIF-1α)、mdr1基因mRNA表达变化;Western blot方法检测各组细胞HIF-1α、P-糖蛋白(P-gp)表达变化.结果 K562与K562/A02细胞对阿霉素的IC50值分别为(1.56±0.07)mg/L和(42.98±3.15)mg/L,耐药倍数为27.55倍.予5、10和20μmol/L YC-1作用后,K562/A02细胞对阿霉素的耐药倍数分别为24.63、16.38和10.71倍;0、5、10和20μmol/L YC-1单独或联合1 mg/L阿霉素处理K562/A02细胞48 h后,凋亡率分别为(1.9±0.9)%、(4.9±0.9)%、(5.8±1.1)%和(9.3±1.4)%与(2.3±0.7)%、(8.2±1.2)%、(19.0±1.7)%和(34.5 ±2.4)%.0、5、10和20 μmol/L YC1联合1 mg/L阿霉素处理K562/A02细胞48 h后细胞内阿霉素荧光强度分别为232±33、1300±219、1961±240和3342±269;随着YC-1浓度增加,HIF-1α mRNA表达没有明显差异,mdr1 mRNA逐渐下调,HIF-1±和P-gp表达均下调.结论 YC-1可以通过抑制HIF-1α蛋白表达,下调mdr1 mRNA水平和P-gp水平,增加细胞内阿霉素药物浓度,部分逆转K562/A02细胞耐药.     

K562细胞外泌体诱导特异性CTL生成的研究

为了研究人白血病细胞株K562细胞分泌的外泌体（exosomes）及K562细胞总RNA刺激人树突状细胞（DC）分泌的外泌体能否诱导出K562细胞特异性CTL，采用四步离心法提取K562细胞及K562细胞总RNA刺激人树突状细胞的培养上清液中的外泌体，并诱导CTL生成，以四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测CTL对K562细胞的杀伤作用。结果显示：K562细胞外泌体和K562细胞RNA刺激的DC和外泌体均能明显促进对K562细胞的杀伤活性，与未经外泌体作用的对照组相比有显著性差异（P〈0．05）。外泌体作用后对K562细胞的杀伤作用明显比对HL-60细胞的杀伤作用强，其差异有显著性（P〈0．05）。结论：K562细胞外泌体能够诱导出特异性抗白血病细胞的免疫反应。     

K562细胞RNA负载人树突状细胞后体外诱导特异性CTL的研究

目的探讨人的树突状细胞(dendriticcell,DC)体外经K562细胞株总RNA转染后,能否诱导出p210蛋白表达,并诱导特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)。方法自健康人浓缩白细胞制品(白膜)分离有粘附特性的单核细胞(PBMC),经GMCSF、IL4培养5d后,获得未成熟的DC(imatureDC,imDC);体外以脂质体DOTAP或直接电穿孔转染K562细胞总RNA。抽提转染前后以及转染24h后的DC内RNA进行RTPCR检测,Westernblot分析p210蛋白表达,以及诱导CTL杀伤K562细胞功能检测等。PBMC以每组5×106/ml,分别在不同组分的培养液中培养DC,通过细胞计数、流式细胞仪测定CD1a表达、细胞纯度来估计制备效果。结果RTPCR检测表明DC经K562总RNA转染后,细胞内出现BcrAbl的cDNA条带,24h后消失。Westernblot试验表明转染24h后,开始表达p210特征性蛋白;并且明显促进T细胞对K562的杀伤活性。1%自体血浆体积分数RPMI1640培养的DC的CD1a表达量最高,并且细胞获得数量也仅屈居第二,为总体评价较高的一组。结论应用肿瘤总RNA负载DC来制备DC疫苗具有可行性,预示改良的DC疫苗抗肿瘤的广泛应用前景。     

树突细胞联合细胞因子诱导的杀伤细胞对耐药K562细胞的体外杀伤作用

目的研究细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞与同源树突细胞(DC)共培养后CIK细胞的增殖活性及表型的变化,并观察其对K562、K562/ADM细胞毒作用的影响。方法采集健康供者外周血单个核细胞(MNC)用于诱导培养CIK细胞及成熟DC,将成熟DC和CIK细胞混合培养,用MTT法检测DCCIK共培养细胞杀伤K562细胞及其耐药株的活性。结果在2.5～20.0效靶比范围内,CIK细胞对K562和K562/ADM细胞的杀伤率分别为(20.0±1.2)%～(61.1±2.2)%和(17.5±2.1)%～(45.2±3.3)%;DCCIK共培养细胞对K562和K562/ADM细胞的杀伤率分别为(25.2±2.3)%～(70.9±4.1)%和(22.4±2.7)%～(62.3±5.0)%。CIK细胞对K562敏感株和耐药株杀伤率的差异无统计学意义,DCCIK细胞对敏感株和耐药株的杀伤作用差异亦无统计学意义;DCCIK细胞对K562和K562/ADM细胞的杀伤活性均高于单纯CIK细胞组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论DC与CIK共培养细胞的增殖活性和细胞毒活性高于CIK细胞。     

外泌体联合CpGODN免疫刺激佐剂诱导CTL抗白血病效应

为了探讨外泌体（exosomes）作为白血病治疗性疫苗的可行性，体外研究了外泌体联合CpG佐剂诱导CTL杀伤白血病细胞的作用。获取正常人外周血MNC—DC，并分为7组，其中3组分别加入K562细胞来源外泌体（Kexo）、K562细胞诱导分化树突状细胞来源外泌体（DCexo）及K562细胞冻融抗原冲击K562细胞诱导分化树突状细胞来源外泌体（FTexo）作为实验组（分别为Kexo、DCexo和FTexo）；另外3组在加入Kexo、DCexo和FTexo的同时加入CpGODN佐剂也作为实验组（Kexo＋CpG、DCexo＋CpG和FTexo＋CpG）；第7组作为空白对照组。所有7组DC再继续培养3天，然后加入同源正常人T淋巴细胞共同培养3天，诱导T淋巴细胞为效应细胞（CTL），K562细胞为靶细胞，用MTT法测CTL对K562细胞的杀伤活性。结果显示：各外泌体实验组刺激诱导的CTL的杀伤作用比对照组明显增强（P〈0．05）。DCexo及FTexo诱导的CTL对K562靶细胞的杀伤作用比Kexo强（P〈0．05），联合应用GPGODN佐剂可以进一步增强这种杀伤作用（p〈0．05）。结论：外泌体能诱导有效的CTL对白血病靶细胞的杀伤作用，CPGODN佐剂能进一步增强这种杀伤作用，外泌体有望作为治疗性疫苗用于白血病的临床治疗。     

Clinical-scale generation of dendritic cells in a closed system

Immunotherapy of malignant diseases based on dendritic cells (DCs) pulsed with tumor antigens is a promising approach. Therefore, there is a demand for large-scale, clinical-grade ex vivo generation of DCs. Here, a procedure is presented that combines monocyte selection and tissue culture in closed systems under current good manufacturing practice conditions. Leukocytes from three patients with urologic cancers were collected by leukapheresis and subjected to immunomagnetic enrichment. From leukapheresis products containing 1.6 +/- 0.2 x 1010 (mean +/- SEM) leukocytes with a frequency of CD14+ monocytes of 18.7 +/- 2.3%, monocytes were enriched to 94.3 +/- 2.2%. CD14+ cell recovery was 67.0 +/- 4.7%. After 6 days of culture in Teflon bags in X-Vivo 15 medium supplemented with autologous plasma, GM-CSF, and IL-4, cells showed an immature DC phenotype and efficient antigen uptake. Following an additional 3 days of culture in the presence of GM-CSF, IL-4, IL-1beta, IL-6, TNFalpha, and PGE(2), cells (82.0 +/- 5.8% CD83+) displayed a mature DC morphology and phenotype, including expression of CD11b, CD11c, CD18, CD25, CD40, CD54, CD58, CD80, CD86, HLA class I, and HLA-DR as well as expression of CCR7 but not CCR5. The mature DC phenotype remained stable for at least 5 days in the absence of cytokines. Yield of DC was 14.0 +/- 4.7% and viability was 91.9 +/- 3.5%. Mature DCs effectively clustered with naive T cells and potently induced allogeneic T-cell proliferation and IL-2 and IFNgamma but not IL-4 production. Thus, this procedure allows large-scale generation of stably mature, Th1 responses inducing DCs under cGMP conditions in a closed system from cancer patients and is therefore well suited for immunotherapy.     

单用A23187快速诱导K562细胞分化成树突细胞的研究

目的探索一种快速、简便、廉价而高效获取树突细胞(DC)的方法。方法通过单用A23187、A23187+GMCSF或联合细胞因子(GMCSF、IL4及TNFα)将K562细胞诱导分化为DC(K562DC),倒置显微镜下观察细胞形态并摄相,流式细胞术检测K562DC表面分子表达情况。用MTT法检测K562DC刺激异基因淋巴细胞增殖及介导T细胞杀伤靶细胞的能力。结果上述3种细胞因子组合均能诱导K562细胞向成熟DC分化,均高表达CD1a、CD80、HLADR、CD83和CD86;含A23187的两组诱导72h获得DC数量分别为(69.5±17.2)%、(73.1±13.9)%,均高于细胞因子组的诱导率[(28.5±12.3)%],也高于细胞因子组诱导7d后的诱导率[(51.2±10.7)%](P值均<0.05);诱导7d后,含A23187的两组诱导的DC低表达CD1a,分别为(8.2±2.3)%和(10.3±5.1)%,而CD83表达分别高达(85.6±8.8)%和(82.4±9.1)%,而细胞因子组CD1a和CD83表达率分别为(17.2±1.6)%和(77.4±12.9)%;3组所获得的DC在对异基因淋巴细胞的刺激增殖能力及其致敏T细胞对靶细胞的杀伤作用差异无统计学意义(P值均>0.05)。结论单用A23187可快速(72h以内)诱导K562细胞向成熟DC转化,与联合细胞因子相比,该方法所获得的DC更趋成熟从而更适用于临床免疫治疗。单用A23187快速诱导白血病细胞生成DC是一种快速、简便、廉价而高效获取DC的方法。     

Generation of tumor-associated cytotoxic T lymphocytes requires interleukin 4 from CD8(+) T cells.

Activation of tumor-associated CD8(+) cytotoxic T lymphocytes (CTLs) often requires antigen representation, e.g., by dendritic cells (DCs), and CD4(+) T cell help. Previously, we showed that CTL-mediated tumor immunity required interleukin 4 (IL-4) during the immunization but not effector phase. To determine the source and target cells of IL-4, we performed adoptive T cell transfers using CD4(+) and CD8(+) T cells from IL-4(-/-) and IL-4R(-/-) mice and analyzed CTL generation. Even though necessary for CTL generation, CD4(+) T cells did not need to express IL-4 or IL-4R. Surprisingly, CTL generation required IL-4 but not IL-4R expression by CD8(+) T cells. As IL-4 (a) was expressed by naive CD8(+) T cells within 24 h after antigen encounter, (b) IL-4 induced DC maturation, and (c) CTL development was impaired in T cell-reconstituted IL-4R(-/-) mice, CD8(+) T cell-derived IL-4 appears to act on DCs. We conclude that CD4(+) and CD8(+) T cells provide different signals for DC activation during CTL generation.