米非司酮逆转K562/A02细胞多药耐药的研究

目的研究孕激素拮抗剂米非司酮对白血病多药耐药细胞K562／A02的逆转作用及其机制。方法MTT法检测米非司酮作用72h后K562／A02细胞增殖及其对阿霉素杀伤敏感性的变化；流式细胞术检测米非司酮作用前后K562／A02细胞表面P糖蛋白的表达和细胞内柔红霉素的浓度；免疫组化法观察米非司酮作用前后K562／A02细胞凋亡相关蛋白bcl-2、Bax、caspase-3的表达；RT—PCR检测米非司酮作用后对K562／A02细胞内葡萄糖神经酰胺合成酶（GcS）mRNA表达的影响。结果2．5、5．0和10．0μmol／L米非司酮不抑制K562／A02细胞的增殖，但上述浓度的米非司酮作用后K562／A02细胞对阿霉素的敏感性较前分别增强了1．68、4．17和10．71倍。K562／A02细胞表面P糖蛋白的表达为（49．03±5．32）％，10μmol／L米非司酮作用72h后降低到（28．60±2．13）％（P〈0．01）；K562／A02细胞内柔红霉素的浓度为（61．07±8．61）％，而10μmol／L米非司酮作用后升高到（92．72±3．48）％（P〈0．01）。经10μmol／L米非司酮作用后，bcl-2蛋白表达由（56±9）％降低到（37±6）％（P〈0．05）；Bax蛋白由（40±5）％升高到（87±10）％（P〈0．01）；caspase-3蛋白则由（36±7）％升高到（89±6）％（P〈0．01）。RT—PCR结果显示K562／A02细胞GcS mRNA的表达较K562细胞明显升高，10μmol／L米非司酮能明显降低K562／A02细胞内GcS mRNA的表达。结论米非司酮可逆转白血病K562／A02细胞的多药耐药，且具有剂量依赖性。10μmol／L米非司酮能明显逆转白血病K562／A02细胞的多药耐药，其机制与降低P糖蛋白的水平，调节凋亡相关蛋白bcl-2、Bax、caspase-3的表达，降低GcS mRNA有关。     

三氧化二砷对K562及其多药耐药细胞系K562/A02细胞的诱导凋亡研究

Ｐ170表达阳性的白血病细胞往往对多种不同化学结构和作用靶点的药物同时发生耐药。我们观察了三氧化二砷(Ａｓ2 Ｏ3 )对体外培养的人急性红白血病细胞系Ｋ5 6 2及其多药耐药细胞系Ｋ5 6 2 /Ａ0 2细胞的凋亡诱导作用 ,以探讨Ａｓ2 Ｏ3 对多药耐药白血病细胞的作用。材料和方法1　药品　Ａｓ2 Ｏ3 (Ｓｉｇｍａ公司 )溶于Ｈａｎｋｓ缓冲液中 ,配制成 1ｍｍｏｌ/Ｌ ,保存于 4℃。2　细胞株及细胞培养　Ｋ5 6 2及其多药耐药细胞系Ｋ5 6 2 /Ａ0 2细胞 (中国医学科学院、中国协和医科大学血液学研究所提供 )置于含体积分数为 10 %小牛血清的ＲＰＭ…     

姜黄素、红霉素逆转K562/A02细胞多药耐药机制的研究

目的研究姜黄素（curcumin，Cur）及红霉素（erythromycin，EM）对多药耐药（MDR）细胞株K562／A02的影响及作用机制。方法MTF法测定Cur、EM作用后K562／A02细胞对阿霉素（ADM）敏感性的变化。流式细胞仪测定细胞内柔红霉素的平均荧光强度（DNR MFI）。免疫组化法检测细胞膜上P—gP的表达。RT—PCR法检测细胞mdr1 mRNA水平：结果Cur、EM均可减低ADM对K562／A02细胞的IC50值，两药合用时逆转倍数可达11．3倍。K562／A02细胞内DNR MFI明显低于K562细胞（P〈0．01），Cur、EM均可明显增加K562／A02细胞内DNR MFI（P〈0．05），以两药合用时作用最为明显，Cur2．5μg／ml处理组细胞内DNR MFI略高于EM120μg／ml处理组，但差异无统计学意义（P〉0．05）。免疫组化检测结果显示K562／A02细胞P—gP表达明显高于K562细胞（P〈0．01），各组药物分别处理后，K562／A02细胞膜P—gP表达减低（P〈0．01），但仍高于K562细胞（P〈0．01）；各药物组处理5d细胞膜P—gP表达均低于3d组（P〈0．01），Cur与EM合用时细胞膜P—gP表达降低最为明湿，低于其它处理组（P〈0．01）。RT—PCR结果显示K562／A02细胞mdr1 mRNA水平明显高于K562细胞（P〈0．01），各组药物处理后，K562／A02细胞mdr1 mRNA水平均减低（P〈0．01），5d组低于3d组，但仍高于K562细胞（P〈0．01）；Cur与EM合用时K562／A02细胞mdr1 mRNA水平降低最为显著，Cur 2．5μg／ml处理5dK562／A02细胞mdr1 mRNA水平低于EM120μg／ml处理5d组（P〈0．01）。结论Cur、EM均可部分逆转K562／A02细胞的MDR，降低其P—gP的表达和功能，逆转作用有时间依赖性；两药联合应用时逆转作用明湿增强，Cur2．5μg／ml逆转作用略强于EM120μg／ml。     

WAVE1基因在K562/A02白血病细胞多药耐药中的作用

目的 探讨WASP家族Verprolin同源蛋白1（WAVE1）基因在K562／A02白血病细胞多药耐药机制中的作用。方法 将pEFBOS—WAVE1真核表达质粒转染K562细胞构建WAVE1高表达的K562细胞，将WAVE1基因的特异性小片段干扰RNA（WAVE1siRNA）转染K562／A02细胞构建WAVE1低表达的K562／A02细胞。Western blot和RT-PCR法检测基因转染前后K562／A02细胞及K562细胞WAVE1基因及蛋白的表达；可溶性噻唑盐WST-8染色法检测阿霉素对转染前后细胞的半数抑制浓度（IC50）；Hoechest33258染色法检测细胞形态学改变并计算凋亡细胞百分率；RT—PCR检测多药耐药基因mdrl mRNA表达；Western blot检测Bcl-2表达。结果 ①与K562细胞相比，K562／A02细胞WAVE1 mRNA表达水平增加70％，蛋白表达水平增加63％。②转染WAVE1基因的K562细胞WAVE1过表达，并降低了对阿霉素的药物敏感性，使IC50从转染前的（0．05±0．00）μg／ml，增加到（2．99±0．12）μg／ml，在阿霉素浓度为1.5μg／ml时，凋亡细胞分别下降30％、35％。③转染WAVE1 siRNA的K562／A02细胞WAVE1蛋白表达水平与未转染组相比明显降低，并可增强对阿霉素的药物敏感性，使IC50从转染前的（4．29±0．15）μg／ml下降到（1．85±0．07）μg／ml，阿霉素浓度为1.5μg／ml时，凋亡细胞分别增加24％、21％。④转染WAVE1的K562细胞mdr1基因和Bcl-2蛋白表达水平均增高，而转染WAVE1 siRNA的K562／A02细胞mdr1基因和Bcl-2蛋白表达水平比转染前明显降低。结论 WAVE1参与了K562／A02细胞多药耐药的形成，其机制可能与调控mdr1和Bcl-2水平有关。     

K562细胞及其耐药细胞株K562/A02细胞白血病耐药相关microRNA筛选

目的 通过检测慢性粒细胞白血病急变细胞系K562及其阿霉素耐药株K562/A02的微小RNA(microRNA、miR)表达差异,探讨microRNA与白血病化疗耐药的关系.方法 MTT法检测K562/A02及其亲本细胞系K562的耐药性能;流式细胞术检测K562与K562/A02细胞的P-gp表达;运用microRNA芯片技术筛查K562与K562/A02细胞之间差异表达的microRNA,随后用实时荧光定量RT-PCR方法进一步证实.结果 阿霉素耐药株K562/A02相对于其亲本细胞系K562对阿霉素的耐药倍数为180倍;K562细胞P-gp的表达率为0.2%,K562/A02细胞P-gp的表达率为86%;microRNA芯片结果显示K562/A02与K562细胞之间有22种microRNA表达存在显著的差异(P<0.01),表达差异在2倍以上的有9种,其中miR-221、miR-155、miR-451在K562/A02细胞表达上调,而miR-98、miR-181a、let-7f、miR-424、let-7g和miR-563则表达下调.实时荧光定量RT-PCR进一步证实了上述结果,并显示miR-451、miR-155、miR-221、let-7f、miR-424在两种细胞中表达差异显著.结论 K562/A02与K562细胞存在microRNA表达差异,其中miR-451、miR-155和miR-221在K562/A02中表达显著上调,而let-7f、miR-424则显著下调,提示microRNA可能参与白血病耐药形成,差异表达的microRNA可能为逆转白血病耐药提供新的作用靶点.     

多药耐药K562/A02和敏感K562细胞来源的树突状细胞介导抗白血病效应对比研究

本研究探讨多药耐药(MDR)白血病K562/A02细胞和敏感K562细胞诱导树突状细胞(DC)分化及介导的抗白血病效应。采用慢性粒细胞白血病(CML)P170糖蛋白(Pgp)高表达的MDRK562/A02细胞、敏感K562细胞在含细胞因子GMCSF(1000U/ml)、IL4(500U/ml)和TNFα(100ng/ml)的RPMI1640完全培养液中诱导分化成DC,以光镜观察细胞形态、流式细胞术检测细胞表型,异基因混合淋巴细胞反应(alloMLR)检测T细胞增殖活性,MTT法测定细胞毒作用。结果表明:培养14天的K562/A02细胞和K562细胞均出现典型的DC形态特征,表达DC的相关分化抗原及共刺激分子CD1a、CD83、HLADR、CD80、CD86。alloMLR检测中,K562/A02DC较K562DC具有更强的刺激异基因T细胞增殖能力(P<0.05)。两种DC激活的CTL分别对K562/A02和K562细胞较HL60细胞具有显著的杀伤活性(P<0.01);更重要的是,K562/A02DC较K562DC激活的CTL对Pgp高表达的MDRK562/A02细胞、HL60/VCR细胞具有更强的细胞毒作用,杀伤活性分别为(40.7±1.3)%、(28.4±0.9)%(P<0.01)和(24.9±1.1)%、(8.2±0.7)%(P<0.01)。结论:Pgp高表达的MDR白血病细胞K562/A02和敏感K562细胞都可在GMCSF、IL4和TNFα作用下诱导分化为成熟DC,均可活化CTL产生特异的抗白血病效应;尤其K562/A02细胞来源的DC可介导针对Pgp高表达的多药耐药白血病的特异细胞毒作用。     

K562细胞及其耐药细胞株K562/A02细胞白血病耐药相关microRNA筛选

目的 通过检测慢性粒细胞白血病急变细胞系K562及其阿霉素耐药株K562/A02的微小RNA(microRNA、miR)表达差异,探讨microRNA与白血病化疗耐药的关系.方法 MTT法检测K562/A02及其亲本细胞系K562的耐药性能;流式细胞术检测K562与K562/A02细胞的P-gp表达;运用microRNA芯片技术筛查K562与K562/A02细胞之间差异表达的microRNA,随后用实时荧光定量RT-PCR方法进一步证实.结果 阿霉素耐药株K562/A02相对于其亲本细胞系K562对阿霉素的耐药倍数为180倍;K562细胞P-gp的表达率为0.2%,K562/A02细胞P-gp的表达率为86%;microRNA芯片结果显示K562/A02与K562细胞之间有22种microRNA表达存在显著的差异(P<0.01),表达差异在2倍以上的有9种,其中miR-221、miR-155、miR-451在K562/A02细胞表达上调,而miR-98、miR-181a、let-7f、miR-424、let-7g和miR-563则表达下调.实时荧光定量RT-PCR进一步证实了上述结果,并显示miR-451、miR-155、miR-221、let-7f、miR-424在两种细胞中表达差异显著.结论 K562/A02与K562细胞存在microRNA表达差异,其中miR-451、miR-155和miR-221在K562/A02中表达显著上调,而let-7f、miR-424则显著下调,提示microRNA可能参与白血病耐药形成,差异表达的microRNA可能为逆转白血病耐药提供新的作用靶点.     

K562细胞及其耐药细胞株K562/A02细胞白血病耐药相关microRNA筛选

目的 通过检测慢性粒细胞白血病急变细胞系K562及其阿霉素耐药株K562/A02的微小RNA(microRNA、miR)表达差异,探讨microRNA与白血病化疗耐药的关系.方法 MTT法检测K562/A02及其亲本细胞系K562的耐药性能;流式细胞术检测K562与K562/A02细胞的P-gp表达;运用microRNA芯片技术筛查K562与K562/A02细胞之间差异表达的microRNA,随后用实时荧光定量RT-PCR方法进一步证实.结果 阿霉素耐药株K562/A02相对于其亲本细胞系K562对阿霉素的耐药倍数为180倍;K562细胞P-gp的表达率为0.2%,K562/A02细胞P-gp的表达率为86%;microRNA芯片结果显示K562/A02与K562细胞之间有22种microRNA表达存在显著的差异(P<0.01),表达差异在2倍以上的有9种,其中miR-221、miR-155、miR-451在K562/A02细胞表达上调,而miR-98、miR-181a、let-7f、miR-424、let-7g和miR-563则表达下调.实时荧光定量RT-PCR进一步证实了上述结果,并显示miR-451、miR-155、miR-221、let-7f、miR-424在两种细胞中表达差异显著.结论 K562/A02与K562细胞存在microRNA表达差异,其中miR-451、miR-155和miR-221在K562/A02中表达显著上调,而let-7f、miR-424则显著下调,提示microRNA可能参与白血病耐药形成,差异表达的microRNA可能为逆转白血病耐药提供新的作用靶点.     

CYP3A5基因反义寡核苷酸转染K562/A02细胞逆转耐药的研究

目的:探讨针对细胞色素P4503A亚家族多肽5(CYP3A5)耐药机制进行反义寡核苷酸逆转耐药。方法:CYP3A5基因反义寡核苷酸转染K562/A02细胞后,RT鄄PCR方法检测反义寡核苷酸对CYP3A5基因转录的特异性阻断,MTT法测定不同处理组柔红霉素IC50值。结果:针对CYP3A5基因的反义寡核苷酸转染K562/A02细胞48h后明显抑制CYP3A5基因的转录,而正义、错义寡核苷酸处理组则无明显改变。转染针对CYP3A5基因的反义寡核苷酸,可使柔红霉素对K562/A02细胞的IC50值由(7.728±3.625)mg/L降至(2.494±1.674)mg/L,增敏3.10倍,差异有显著性(P<0.05),而正义、错义寡核苷酸处理组IC50值与对照组相比则无明显差异。结论:针对CYP3A5基因的反义寡核苷酸可显著逆转K562/A02细胞的耐药性。     

藤黄酸对白血病K562/A02细胞的耐药逆转作用

本研究旨在探讨藤黄酸(gambogic acid,GA)对K562/A02细胞株的耐药逆转作用及其逆转机制。采用MTT法检测GA对K562和K562/A02细胞的增殖抑制作用及对K562/A02细胞阿霉素(ADM)耐药逆转效应;用流式细胞术检测GA联合ADM对K562及K562/A02细胞凋亡率的影响;DAPI荧光染色观察ADM联合GA作用后细胞的形态学改变;Western blot法检测K562及K562/A02细胞P-糖蛋白(P-gp)、存活蛋白(Survivin)基因的表达。结果表明:ADM作用48 h抑制K562和K562/A02细胞增殖的IC50值分别为(1.42±0.07)μg/ml和(28.42±1.40)μg/ml。GA≤0.0625μmol/L时,对K562及K562/A02细胞株无明显增殖抑制作用;0.0625μmol/L GA联合ADM作用于K562/A02细胞能增加其对ADM的敏感性,耐药逆转倍数为1.53。0.0625μmol/L GA联合ADM作用于K562/A02细胞48 h能提高细胞的凋亡率(P<0.05),下调Survivin及P-gp蛋白的表达(P<0.05)。结论:GA可以逆转K562/A02细胞的耐药性,增强耐药细胞对ADM的敏感性,其机制可能与提高K562/A02细胞凋亡、下调Survivin和P-gp蛋白的表达有关。     

siRNA逆转K562/A02细胞多药耐药的研究

目的　研究小分子干扰RNA片段 (smallinterferingRNAs,siRNA)对白血病多药耐药细胞系K5 6 2 A0 2mdr1基因和P 糖蛋白 (P gp)表达及功能的影响。方法　根据mdr1基因已知序列设计 3条含 2 1个碱基的siRNA(si mdr1 1,si mdr1 2 ,si mdr1 3)及阴性对照 (si neg) ,在脂质体的介导下转染K5 6 2 A0 2细胞 ;用RT PCR分析mdr1mRNA的表达 ;流式细胞术检测P gp表达和细胞内柔红霉素积累量 ;MTT法检测阿霉素对K5 6 2 A0 2细胞的半数抑制浓度 (IC50 )。结果　 3条siRNA均能不同程度地逆转K5 6 2 A0 2细胞的多药耐药。第 3条序列能更有效地封闭mdr1基因 ,使mdr1mRNA相对水平下降(5 8.0± 1 5 4 ) % ;P gp表达由处理前的 (76 .0± 1.0 ) %降到处理后的 (19.6± 1.9) % ;对阿霉素药物敏感性的相对逆转效率为 70 .4 % ;同时使K5 6 2 A0 2细胞内柔红霉素积累量增加。结论　siRNA可逆转mdr1基因编码蛋白P gp介导的多药耐药。     

雷公藤甲素对K562/A02细胞阿霉素敏感性的影响

本研究旨在探讨雷公藤甲素(TPL)对K562/A02细胞阿霉素敏感性的影响。采用MTT法检测TPL细胞毒性和阿霉素药物敏感性;流式细胞术检测P-糖蛋白表达和细胞内阿霉素浓度;双荧光素酶报告基因系统检测MDR1启动子活性。结果表明:TPL增强K562/A02细胞阿霉素敏感性。TPL作用后,K562/A02细胞P-糖蛋白表达相关平均荧光强度(MFI)由123±13下降到39±13(P<0.05);K562/A02细胞内阿霉素相关MFI由18±5上升到34±6(P<0.05),TPL能够有效抑制K562/A02细胞的药物外排。TPL降低MDR1启动子转录活性约75%。结论:TPL通过下调P-糖蛋白表达增强K562/A02细胞对阿霉素的敏感性,其有可能成为一种耐药逆转剂。     

HMGB1基因沉默对阿霉素诱导K562/A02细胞凋亡增敏作用的研究

目的 探讨高迁移率族蛋白1(HMGB1)基因沉默对白血病细胞耐药逆转的作用.方法 将HMGB1基因特异性干扰RNA(HMGB1 siRNA)导入K562/A02细胞中,通过Western blot和RTPCR方法检测HMGB1基因在转染前后的表达;WST8法检测阿霉素(ADM)对转染前后K562/A02细胞的半数抑制浓度(IC50);流式细胞术检测凋亡细胞百分率;Western blot检测线粒体促凋亡蛋白Smac/DIABLO的释放;采用caspase活性定量检测试剂盒分析caspase-3的活性.结果 ①与未经处理的K562/A02细胞组相比,转染HMGB1 siRNA的K562/A02细胞组HMGB1 mRNA和蛋白水平分别下降86%和71%;②HMGB1基因沉默使K562/A02细胞对ADM的药物敏感性增强,其IC50值从转染前的(4.83±0.08)μg/ml降低到(1.33±0.10)μg/ml,并在ADM浓度为1μg/ml和5μg/ml时,细胞凋亡百分率分别增加27%、32%;③HMGB1基因沉默可促进ADM所致Smac/DIABLO从线粒体向胞浆释放,并增加caspase-3的活性.结论 HMGB1基因沉默能明显增加K562/A02细胞对ADM的敏感性,逆转K562/A02细胞对ADM耐药.     

汉防己甲素对K562/A02细胞株SORCIN基因表达的影响

本研究旨在探讨汉防己甲素（Tet）在逆转K562/A02细胞耐药与耐药相关的可溶性钙结合蛋白（SORCIN）基因表达之间的关系,为Tet的临床应用提供新的理论基础。通过MTT法筛选出所需浓度Tet,与K562/A02细胞株孵育培养48小时后,通过MTT检测Tet对柔红霉素（DNR）细胞毒性的影响,用RT-PCR方法检测SORCIN基因表达的变化,用Western blot方法检测sorcin表达蛋白的变化。结果表明：在所选浓度范围内,Tet可以增强DNR对K562/A02的细胞毒作用,（Tet浓度为0,0.5,1.0,2.0mg/L时DNR和Tet的IC50分别为11.3±0.17,5.15±0.10,3.91±0.06,2.52±0.04mg/L,p〈0.01）;K562/A02细胞中SORCIN基因高表达,且随着Tet浓度的增加SORCIN的表达先增强后减弱（Tet浓度为0.5mg/L时增强,1.0和2.0mg/L时减弱,p〈0.05）;K652细胞中sorcin蛋白低表达,K562/A02细胞中sorcin蛋白高表达,且随着Tet浓度的增加先增强后减弱（Tet浓度为0.5mg/L时增强、1.0和2.0mg/L时减弱,p〈0.05）。结论：MTT检测显示Tet对K562/A02耐药逆转呈浓度依赖性,Tet可能通过调整SORCIN基因及蛋白的表达参与逆转K562/A02的耐药性,但并不与其耐药逆转作用完全相关。     

小檗胺逆转K562/A02细胞耐药性及其机制

为了探讨钙调素拮抗剂小檗胺 (berbamine,BBM )逆转多药耐药的可能性及其机制 ,采用人红白血病细胞K5 6 2及其阿霉素 (ADR)诱导的耐药细胞K5 6 2 /A0 2与不同浓度ADR和BBM共培养后 ,经MTT比色法计算半数抑制浓度 (IC50 )、耐药倍数和增敏倍数 ;用流式细胞术检测细胞内ADR相对含量和P gp表达水平 ;用半定量RT PCR检测mdr1mRNA和抗凋亡基因survivinmRNA表达。结果显示 ,ADR对K5 6 2和K5 6 2 /A0 2的IC50 分别为1 16± 0 .0 9μmol/L和 37.4 7± 1.76 μmol/L ,K5 6 2 /A0 2对ADR的耐药倍数是K5 6 2的 32 .30倍。 5 μmol/L ,10μmol/L和 2 0 μmol/LBBM增加K5 6 2 /A0 2细胞对ADR的敏感性 ,并呈剂量依赖性 ,增敏倍数分别达 2 .0 1,9.6 8和4 1.18倍 (P值均 <0 .0 1)。5 μmol/L或 10 μmol/LBBM作用 2小时 ,使K5 6 2 /A0 2细胞内ADR相对含量增加到1 4 1和 1 5 2倍 (P <0 .0 1) ;作用 72小时使K5 6 2 /A0 2细胞P gp表达分别下降 4 .12 % ( P <0 .0 5 )和 2 7.0 9% (P<0 .0 1) ,且下调mdr1mRNA和survivinmRNA表达。结论 :BBM提高耐药细胞K5 6 2 /A0 2胞内的ADR浓度 ,下调mdr1mRNA、P gp及survivinmRNA的表达 ,使其对ADR的敏感性显著增高 ,从而逆转耐药性。     

树突细胞联合细胞因子诱导的杀伤细胞对耐药K562细胞的体外杀伤作用

目的研究细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞与同源树突细胞(DC)共培养后CIK细胞的增殖活性及表型的变化,并观察其对K562、K562/ADM细胞毒作用的影响。方法采集健康供者外周血单个核细胞(MNC)用于诱导培养CIK细胞及成熟DC,将成熟DC和CIK细胞混合培养,用MTT法检测DCCIK共培养细胞杀伤K562细胞及其耐药株的活性。结果在2.5～20.0效靶比范围内,CIK细胞对K562和K562/ADM细胞的杀伤率分别为(20.0±1.2)%～(61.1±2.2)%和(17.5±2.1)%～(45.2±3.3)%;DCCIK共培养细胞对K562和K562/ADM细胞的杀伤率分别为(25.2±2.3)%～(70.9±4.1)%和(22.4±2.7)%～(62.3±5.0)%。CIK细胞对K562敏感株和耐药株杀伤率的差异无统计学意义,DCCIK细胞对敏感株和耐药株的杀伤作用差异亦无统计学意义;DCCIK细胞对K562和K562/ADM细胞的杀伤活性均高于单纯CIK细胞组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论DC与CIK共培养细胞的增殖活性和细胞毒活性高于CIK细胞。