大鼠主动脉平滑肌细胞的体外培养和观察

目的 建立大鼠主动脉平滑肌细胞体外培养模型，为动脉粥样硬化等心血管疾病的发病机制的研究提供了重要手段。方法 将大鼠主动脉翻转，两端结扎，用0.1%胶原酶消化血管内皮细胞，剩余血管剪成小块均匀种植于培养瓶底，加入DMEM培养液培养，观察血管平滑肌细胞的生长，结果 平滑肌细胞48h后贴壁生长，早期呈多角形，以后呈梭形伸展，胰酶消化后平滑肌细胞可传6－7代。结论 此方法简单易行，是获得血管平滑肌细胞的一种可靠方法。     

大鼠主动脉平滑肌细胞体外培养及其临床意义

目的:建立大鼠主动脉平滑肌细胞的组织贴块培养法,进一步探讨其临床应用价值。方法:取大鼠主动脉切成1mm3的小块,均匀的贴在细胞培养瓶壁上,用RPMI1640培养基培养,并用透射电镜和相差显微镜进行鉴定。结果:相差显微镜下可见细胞呈梭形或长梭形,培养3周后细胞可重叠生长达多层,高低起伏呈“峰”“谷”状;透射电镜下见到平滑肌细胞的胞浆内有很多与细胞纵轴平行的肌丝及其相连的致密体,部分细胞周围可见肌膜。结论:贴块法培养平滑肌细胞具有方法简单、成功率高、稳定性强等优点,适于临床进行心血管疾病病因和机理的研究。     

大鼠血管平滑肌细胞的培养和鉴定

目的:建立一种方便快捷的培养大量大鼠血管平滑肌细胞的方法,为心血管疾病的体外实验研究提供实验材料。方法:采用改良的组织块贴壁法进行原代培养,差异贴壁法纯化细胞,常规胰酶消化法传代,使用倒置相差显微镜进行形态学观察,通过检测平滑肌肌动蛋白对细胞进行免疫组化鉴定。结果:培养4代的平滑肌细胞纯度达96%以上。镜下可见培养细胞呈典型的"峰-谷"样生长,免疫组化染色显示胞质内平滑肌肌动蛋白阳性表达。结论:本研究所介绍的组织贴块培养法较为成熟,可为心血管疾病病因、机制的研究和防治提供一个理想的实验材料。     

酶消化法分离培养家兔血管平滑肌细胞

目的探讨胶原酶分离并培养家兔血管平滑肌细胞的方法。方法取家兔腹主动脉，0．2％胶原酶Ⅰ消化分离血管平滑肌细胞并进行培养，相差显微镜观察培养细胞的形态，免疫组化染色法检测细胞胞浆内α-肌动蛋白（α-actin）的表达。透射电镜观察血管平滑肌超微结构。结果相差显微镜下细胞呈长梭形，未见明显异型细胞，α-actin胞浆染色阳性细胞数占总细胞数的99％以上。电镜显示VSMC内肌丝丰富，线粒体、高尔基复合体等细胞器较少，VSMC呈现分化的收缩表型。结论胶原酶可消化分离培养血管平滑肌细胞，且有成活细胞数多、传代周期短的特点，可用于血管平滑肌表型研究。     

主动脉平滑肌细胞的三维培养研究

目的研究主动脉平滑肌细胞(aortic smooth muscle cell,ASMC)在三维培养中是否仍能产生弹性蛋白。方法取一周龄SD大鼠胸主动脉,经原代、传代培养后,和胶原、血清及培养液混合形成ASMC胶原凝胶,进行三维培养;培养2周后用Comori醛复红弹性纤维染色和弹性蛋白免疫组织化学染色,检测细胞胶原凝胶中所产生的弹性纤维,并进行电镜观察。结果传代细胞经α肌动蛋白免疫组织化学染色鉴定,98％以上为ASMC。培养2周的ASMC胶原凝胶切片用二种染色方法均可显示有弹性纤维存在,电镜观察细胞超微结构呈典型的合成表型。结论 ASM在三难培养中能够产生弹性蛋白,并形成弹性纤维。     

血管平滑肌细胞的培养及鉴定

目的探讨以简便、高效的方法获取血管平滑肌细胞,为相关研究提供实验材料.方法采用改良组织贴块法进行原代培养,胰酶消化传代,综合运用自然纯化、机械刮除、差异贴壁法进行细胞纯化,并应用相差显微镜和SP试剂盒对细胞进行形态学和免疫组化鉴定.结果90%的组织块接种存活,5代的平滑肌细胞纯度达98%以上.镜下培养细胞呈典型的"谷峰状"生长,免疫组化染色显示胞浆内α平滑肌肌动蛋白阳性表达.结论本法简便、可靠,短期内可获大量高纯度、功能良好的血管平滑肌细胞.     

人脐动脉平滑肌细胞体外培养

目的 建立人脐动脉血管平滑肌细胞的体外培养方法.方法 运用植块贴壁法进行人脐动脉血管平滑肌细胞的体外原代和传代培养.倒置相差显微镜和免疫荧光染色方法对培养细胞进行鉴定.结果 原代和传代培养的细胞生长良好,光镜下细胞呈长梭形"峰-谷"样生长,具有典型的平滑肌细胞特征.经传代培养至第5代,细胞生长特性未见异常改变;经考马斯亮兰R250及α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)免疫荧光染色检测,证实为平滑肌细胞.结论 植块贴壁法可成功进行人脐动脉血管平滑肌细胞的体外培养,传代后细胞生物学特征稳定,为慢性肾病并发心血管疾病的机制研究奠定了实验基础.     

人脐动脉平滑肌细胞体外培养

目的建立人脐动脉血管平滑肌细胞的体外培养方法。方法运用植块贴壁法进行人脐动脉血管平滑肌细胞的体外原代和传代培养。倒置相差显微镜和免疫荧光染色方法对培养细胞进行鉴定。结果原代和传代培养的细胞生长良好,光镜下细胞呈长梭形"峰-谷"样生长,具有典型的平滑肌细胞特征。经传代培养至第5代,细胞生长特性未见异常改变;经考马斯亮兰R250及α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)免疫荧光染色检测,证实为平滑肌细胞。结论植块贴壁法可成功进行人脐动脉血管平滑肌细胞的体外培养,传代后细胞生物学特征稳定,为慢性肾病并发心血管疾病的机制研究奠定了实验基础。     

胰岛素下调AP-1抑制血管平滑肌α肌动蛋白的表达以及对细胞增殖的影响

目的研究胰岛素诱导大鼠血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)转录因子激活蛋白-1(activator protein 1,AP-1)表达下调对VSMC表型转换标志蛋白α肌动蛋白(alpha smooth muscle actin,SM-α)表达调控及细胞增殖的影响。方法流式细胞术检测不同浓度(0、25、50、100、125 nmol/L)的胰岛素刺激VSMC 24 h后的细胞周期。设计AP-1表达质粒载体,转染至血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)。分为4组:空白对照组、胰岛素实验组、AP-1表达载体组、胰岛素+AP-1表达载体组。分别采用Western blot、RT-PCR检测AP-1蛋白及SM-α蛋白的表达及mRNA水平。结果细胞周期分布结果显示,不同浓度的胰岛素刺激VSMC 24 h后,VSMC的S期百分比升高至峰值后开始下降[(23.49±1.17)%、(28.08±0.68)%、(30.44±1.77)%、(47.47±0.88)%、(46.23±1.65)%,P<0.05],100 nmol/L的胰岛素刺激VSMC 24 h后,VSMC的S期百分比达到峰值(47.47±0.88)。RT-PCR及Western blot检测结果显示,胰岛素刺激VSMC可下调AP-1[(0.47±0.09)、(0.46±0.14),P<0.05]及抑制SM-α的表达[(0.41±0.03)、(0.32±0.03),P<0.05]。结论胰岛素能下调转录因子AP-1表达,进而抑制表型转换标志蛋白SM-α的表达,诱导VSMC发生增殖。     

改良组织块贴壁法培养大鼠主动脉平滑肌细胞及鉴定

目的以简捷、高效的方法获取原代和传代的大鼠血管平滑肌细胞(VSMC),为进一步的科学研究提供实验材料。方法采用改良的组织块贴壁法培养原代大鼠VSMC,2.5 g.L-1胰蛋白酶消化传代,并用相差显微镜、电镜、荧光显微镜及激光共聚焦显微镜对细胞进行鉴定。结果95%的组织块接种成活,相差显微镜下细胞呈典型的"峰-谷"状生长,胞体长梭形;电镜下可见粗、细肌丝沿细胞长轴平行排列;荧光显微镜及激光共聚焦显微镜检测α-肌动蛋白可见细胞胞浆内呈阳性显色,细胞核不显色。结论本方法培养VSMC简便、易操作,获得的细胞纯度和成活率较高。     

兔血管平滑肌细胞体外培养及生长特性研究

目的体外分离培养兔血管平滑肌细胞（VSMC）并观察其生长特征。方法采用酶消化结合贴壁法原代培养兔胸主动脉来源的VSMC并传代,倒置显微镜观察和免疫荧光染色法鉴定培养细胞;锥蓝法、绘制生长曲线、MTT法和划痕法分别测定VSMC传代细胞的成活率及其生长、增殖和迁移能力。结果原代培养5d后,VSMC从组织块边缘长出,传代细胞呈典型＂峰-谷＂状生长,胞质内α-平滑肌肌动蛋白免疫荧光染色阳性;细胞成活率为96%;生长曲线近似＂S＂形;细胞生长第3～5d内光密度值变化较明显;无血清培养的VSMC在24h内划痕宽度变化最显著。结论体外培养的兔动脉平滑肌细胞为收缩表型且活性高,生长3～5d细胞增殖活力较强,无血清培养的细胞在24h内迁移能力最强,为心血管疾病研究提供了良好的实验材料。     

兔血管平滑肌细胞体外培养及生长特性研究

目的 体外分离培养兔血管平滑肌细胞(VSMC)并观察其生长特征.方法 采用酶消化结合贴壁法原代培养兔胸主动脉来源的VSMC并传代,倒置显微镜观察和免疫荧光染色法鉴定培养细胞;锥蓝法、绘制生长曲线、MTT法和划痕法分别测定VSMC传代细胞的成活率及其生长、增殖和迁移能力.结果 原代培养5 d后,VSMC从组织块边缘长出,传代细胞呈典型"峰-谷"状生长,胞质内α-平滑肌肌动蛋白免疫荧光染色阳性;细胞成活率为96%;生长曲线近似"S"形;细胞生长第3～5 d内光密度值变化较明显;无血清培养的VSMC在24 h内划痕宽度变化最显著.结论 体外培养的兔动脉平滑肌细胞为收缩表型且活性高,生长3～5 d细胞增殖活力较强,无血清培养的细胞在24 h内迁移能力最强,为心血管疾病研究提供了良好的实验材料.     

人胚胎平滑肌细胞的三维培养观察

目的：体外培养人胚胎动脉平滑肌细胞（vasular smooth muscle cells,VSMCs），并观察人胚VSMCs在经过改性的乳酸与羟基乙酸共聚（polylatic acid-polyglycolic acid,PLGA)上的三维培养情况，观察细胞在PLGA上的生长情况。方法：成功培养人胚VSMCs后，将其与PLGA（膜材和三维材料）进行三维培养，通过倒置显微镜，扫描电镜和MTT法观察细胞的生长情况。结果：体外培养的人胚VSMCs生长旺盛，且其与改性后的PLGA具有良好的相容性，细胞在PLGA上生长良好，结论：改性后的PLGA与体外培养的人胚VSMCs有良好的相容性，为构建结构和功能与在体胆管上段胆管相似的胆管组织，最终为形成组织工程化胆管提供实验依据。     

糖尿病大鼠血管平滑肌细胞体外培养方法的探讨

目的:对糖尿病大鼠血管平滑肌细胞体外培养方法进行探讨,建立糖尿病大鼠血管平滑肌细胞模型,为糖尿病慢性血管并发症研究奠定基础。方法:建立糖尿病大鼠模型,用组织贴壁法体外培养胸主动脉血管平滑肌细胞。结果:糖尿病大鼠造模成功。用贴壁法培养糖尿病大鼠血管平滑肌细胞,3d后相差显微镜下可见细胞游出,培养7～10d左右细胞重叠生长达多层,高低起伏呈“峰—谷”状。平滑肌细胞actin免疫组织化学染色鉴定为平滑肌细胞。结论:糖尿病大鼠血管平滑肌细胞增殖速度快,培养条件要求严格,在形态学上与正常大鼠平滑肌细胞相同。     

左旋精氨酸抑制人血管平滑肌细胞合成胶原的作用

目的:探讨内皮素(ET-1)对人血管平滑肌细胞(HVSMC)合成胶原的影响并观察左旋精氨酸(L-arginine)对HVSMC合成胶原的影响。方法:将ET-110-8mol/L和不同浓度L-arginine加入体外培养HVSMC。培养24h之后测培养液中NO含量,测细胞内cGMP含量及3H-脯氨酸掺入量即总胶原含量。结果:加入梯度浓度L-arginine,NO水平呈剂量依赖性增加(P均<0.01);ET-1使胶原合成量增加80%(P<0.001),加入梯度浓度L-arginine较ET-1组胶原合成量分别减少了37%、41%、56%(P均<0.01),呈剂量依赖性;ET-1+L-arginine低、中、高浓度组较ET-1组细胞内cGMP含量明显增加(P均<0.01),且cGMP含量随L-arginine增加而增加;细胞内cGMP含量与胶原合成量呈良好负相关关系(r=-0.93)。结论:ET-1可引起HVSMC合成胶原增多;L-arginine可剂量依赖地抑制HVSMC合成胶原;L-arginine对胶原合成的抑制作用可能是通过cGMP途径起作用。     

Bax抑制因子1可抑制体外培养的大鼠血管平滑肌细胞的钙化

目的 探讨Bax抑制因子1（BI-1）对血管平滑肌细胞钙化的具体作用机制。方法 使用β磷酸甘油和氯化钙诱导大鼠主动脉血管平滑肌细胞建立钙化模型。将模型分为对照组（使用常规培养基）、BI-1过表达组（过表达BI-1蛋白后使用常规培养基）、钙化组（使用钙化培养基）、钙化+BI-1过表达组（过表达BI-1蛋白后使用钙化培养基）4组。运用茜素红S染色测定血管平滑肌细胞钙沉积,酶联免疫吸附法测定细胞碱性磷酸酶活性和钙含量,Western blot法测定Runt相关转录因子2、骨形态发生蛋白2和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达水平。结果（1）随着钙化诱导时间的延长,BI-1蛋白表达明显下降,结果具有明显差异性（P=0.001）;（2）使用质粒转染方法过表达BI-1蛋白后,细胞钙含量、碱性磷酸酶活性明显降低（P=0.0006）,Runt相关转录因子2和骨形态发生蛋白2表达明显下降（P=0.0001）,血管钙化减轻;（3）钙化诱导后血管平滑肌细胞凋亡率增加,而过表达BI-1后细胞凋亡率明显减少（P=0.01）,半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3水平下降（P=0.0003）。结论 BI-1抑制细胞凋亡、钙磷沉积和细胞骨型分化起到减轻血管钙化作用。     

大鼠胃平滑肌细胞的体外分离与三维支架培养方法

目的:探讨复合胶原酶和胰蛋白酶解离大鼠胃平滑肌细胞,建立稳定的胃平滑肌细胞体外培养模型,并探讨其三维复合培养的可行性。方法:0.2%Ⅰ型胶原酶和0.05%胰蛋白酶酶解大鼠胃平滑肌,用相差显微镜观察细胞学形态与生长情况,免疫组化鉴定平滑肌细胞;采用纤维蛋白胶作为细胞外基质建立三维PLGA复合物培养模型,荧光显微镜观察复合物中的细胞活性。结果:平滑肌组织裂解充分均匀,细胞接种成功率高,1～2周细胞可传代,传代后细胞呈典型的"峰-谷"样生长;α-平滑肌肌动蛋白免疫组化染色证实所获得的平滑肌细胞,荧光显微镜下观察到PLGA支架内细胞均匀分布,存活率达90%以上。结论:酶解分离法可获得高纯度大鼠胃平滑肌细胞,三维支架培养在体外成功培养胃平滑肌细胞复合物,为深入研究胃组织工程再生奠定了基础。     

大胞饮途径介导血管平滑肌细胞内脂滴聚集

目的 探讨大胞饮途径是否介导血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)内脂滴聚集.方法 组织块贴壁培养法培养VSMCs;免疫荧光染色鉴定原代VSMCs;天然低密度脂蛋白(nLDL,50、200、800 μg/mL)及脂多糖(LPS,200 ng/mL)刺激培养VSMCs,构建泡沫细胞模型;流式细胞术检测VSMCs对大胞饮示踪剂Lucifer Yellow (LY)和DiI标记的nLDL (DiI-nLDL)的摄取;油红O染色鉴定VSMCs内脂滴聚集.结果 ①LPS刺激可促进VSMCs对nLDL呈浓度依赖性地摄取增加,导致细胞内脂滴的聚集逐渐增多.②200 ng/mL LPS刺激VSMCs 6 h,VSMCs对LY的摄取增加75％(P＜0.01),对DiI-nLDL的摄取增加76％ (P ＜0.01).③应用胞饮抑制剂LY294002后,VSMCs对DiI-nLDL的摄取减少约29％ (P ＜0.01),VSMCs内脂滴聚集明显减少.结论 LPS刺激诱导VSMCs通过大胞饮途径摄取nLDL,从而增加细胞内脂滴的聚集,促进平滑肌源性泡沫细胞形成.