兔抗多疣壁虎Hoxc10抗血清的制备及鉴定

目的:制备兔抗多疣壁虎Hoxc10抗血清并进行特性鉴定.方法:构建pGEX-4T1 -g-Hoxc10质粒,转化大肠杆菌BL21后,在异巯基-1-硫代-β呋喃半乳糖(IPTG)诱导下,表达谷胱甘肽S-转移酶( GyST) -g-Hoxc 10蛋白.用亲和层析纯化的融合蛋白免疫大白兔,制备Hoxc10抗血清.用Western blot和免疫组化染色法检测Hoxc10抗血清的特性.结果:构建的多疣壁虎Hoxc10基因的原核表达质粒pGEX-4T1 -g-Hoxc10,在大肠杆菌中获得高效表达.表达产物经亲和层析纯化后得到高纯度的Hoxc10融合蛋白,以其免疫大白兔获得较高效价的Hoxc10抗血清.Western blot及免疫组化染色法检测显示,所得抗血清具有较高的效价及特异性.结论:利用原核表达的多疣壁虎GST-g-Hoxc10融合蛋白制备的Hoxc10抗血清效价高,特异性良好,为进一步深入研究Hoxc10的功能提供了重要的制剂.     

多疣壁虎精子超微结构

目的:研究多疣壁虎精子超微结构,探讨爬行类精子进化规律.方法:用光镜及透射电镜观察多疣壁虎的精子.结果:多疣壁虎精子总长度约65～75 μm,头部弯曲长约27～30μm,尾部约 40～47 μm.用透射电镜观察多疣壁虎精于超微结构,可见其精子具有以下特点:顶体复合体由顶体帽、顶体下问隙、穿孔器、中央管、顶体下核帽5个部分组成;中段的轴丝复合体与线粒体鞘之间具有微管鞘(microtubule sheath)结构,线粒体鞘向后延伸包围主段,形成终环后隐窝结构;主段具有厚的圆筒状纤维鞘.结论:多疣壁虎精子超微结构比较研究显示爬行类精子具有种的特异性,提示了爬行类可能为多源起源.     

多疣壁虎断尾再生中巨噬细胞的组织定位

目的:研究巨噬细胞与多疣壁虎断尾再生的关系.方法:多疣壁虎120只,断尾后随机分为野生型组(正常组)、生理盐水组(免疫正常组)、生理盐水+氢化可的松组(免疫抑制组)和生理盐水+脂多糖组(免疫增强组).免疫抑制组腹腔注射氢化可的松80μg·g-1·d-1;免疫增强组注射脂多糖10 μg·g-1·d-1;采用免疫组织化学检测巨噬细胞组织定位.结果:在壁虎断尾再生过程中,横断创面巨噬细胞的浸润定位层次是改变的,断尾12 h后迁移到尾巴断截面附近的巨噬细胞数量达到峰值.免疫正常组、增强组在断尾后24 h与免疫抑制组相比较,断面附近巨噬细胞的数量显著增加.结论:巨噬细胞有可能参与多疣壁虎断尾再生过程.     

兔抗人ERA抗血清的制备

目的 在大肠杆菌中表达人ERA蛋白（h-ERA)和h-ERAC端结构域蛋白。并制备兔抗h-ERA抗血清。方法 以PCR扩增人era基因（h-era)全长cDNA和h-ERAC端的结构域基因,并分别克隆到（His)6融合表达载体RSET-C和非融合表达载体pDH中,诱导表达（His)6-h-ERA融合蛋白和h-ERAC端结构域蛋白,用h-ERAC端结构域蛋白免疫兔,制备兔抗h-ERA抗血清,并以Western-blot对兔抗h-ERA抗血清进行鉴定。结果 大肠杆菌中表达的h-ERAC端结构域蛋白和（His)6-h-ERA融合蛋白,分别占菌体总蛋白的40%和80%。用兔抗血清可检出大肠杆菌中表达的（His)6-h-ERA融合蛋白。结论 h-ERA和h-ERAC端结构域蛋白在大肠杆菌中获得高效表达,并成功地制备了兔抗h-ERA抗血清。     

多疣壁虎脑和脊髓解剖结构的三维重建及体视学测量

目的：建立多疣壁虎中枢神经系统结构的三维立体模型,获取中枢神经系统相关结构的定量数据。方法：多疣壁虎头颈部连续冠状切片行Nissl 染色和Luxol fast blue（LFB）染色,通过显微镜分区拍摄获得切片的二维图像。利用Photoshop7.0 对图像拼接、旋转、配准后,采用3D-Doctor 软件进行三维重建。运用体视学方法对壁虎头部进行定量研究。结果：三维重建的头颅、脑和视神经的立体图像逼真自然,能清楚地区分端脑、间脑、中脑、延髓以及小脑,同时能弄清壁虎脑在颅内位置及相互关系。壁虎颅腔的容积为（25.83±1.46）mm3,全脑体积为（19.99±2.15）mm3、端脑体积为（7.53±0.33）mm3、单侧大脑皮层体积为（0.19±0.02）mm3、小脑体积为（0.22±0.02）mm3、海马体积为（0.16±0.02）mm3,脊髓颈膨大、灰质和白质面积分别为（0.70±0.02）mm2、（0.28±0.01）mm2、（0.36±0.01）mm2,颈膨大灰质与白质面积比是0.78,腰骶膨大、灰质和白质的面积分别为（0.75±0.01）mm2、（0.36±0.01)mm2、（0.38±0.01）mm2,腰骶膨大灰质与白质面积比是0.95。结论：获得多疣壁虎颅脑解剖结构的三维立体模型及相关脑结构的定量分析数据,为壁虎脑内实验和立体定向研究提供了三维解剖学依据。     

兔抗人Bit1抗血清的制备及其纯化

目的：利用大肠杆菌中表达的人Bitl(hBitl)蛋白，制备兔抗人Bitl抗血清并对其进行纯化。方法：在大肠杆菌中诱导表达人Bitl融合蛋白：以其免疫家兔，制备兔抗人Bitl抗血清，用非特异性去除法纯化抗体，并以Western blot对所纯化的兔抗人Bitl抗血清进行鉴定。结果：大肠杆菌中表达的人Bitl蛋白占菌体总蛋白的40％。用纯化的抗血清可特异地检出大肠杆菌表达的人Bit融合蛋白。结论：人Bitl融合蛋白在大肠杆菌中得到高效表达，并成功地制备并纯化了兔抗人Bitl抗血清。     

兔抗人DOC-2抗血清的制备与鉴定

目的利用大肠杆菌中表达的融合蛋白GST-nDOC-2，制备兔抗DOC-2的多克隆抗体。方法将克隆有人DOC-2氨基端PID结构域(暂命名为nDOC-2)的原核表达载体pGEX-4T-nDOC-2转化大肠杆菌，IPTG诱导表达融合蛋白GST-nDOC-2，经包涵体洗涤后，用其免疫兔，制备兔抗人DOC-2抗血清。并以ELISA、Western blot和免疫组化的方法对抗血清进行鉴定。结果用ElISA法测定抗血清的效价为1：32000；Western blot结果显示对应于GST-nDOC-2融合蛋白位置上有阳性条带；免疫组化结果显示人正常卵巢上皮细胞胞浆呈阳性染色，人卵巢浆液性囊腺瘤上皮细胞染色呈弱阳性，而人卵巢癌浆液性囊腺癌上皮细胞呈阴性染色。结论成功制备了兔抗人DOC-2抗血清，为研究DOC-2的功能提供了有利的工具。     

兔抗MAGE-n血清的制备、纯化及鉴定

目的: 制备高效价、特异性的兔抗人MAGE-n血清。方法: 对原核表达的MAGE-n蛋白进行纯化, 与弗氏佐剂混合免疫新西兰兔制备抗血清, 用硫酸铵盐析法及溴化氰活化的Sephrose4B(CNBr-ActivatedSephrose4B)亲和层析柱纯化抗血清, 以双向免疫扩散实验、ELISA、Westernblot和免疫组化对兔抗人MAGE-n血清进行鉴定。结果: 经免疫得到高效价的兔抗人MAGE-n血清, 抗血清能够与MAGE-n特异性结合, 免疫组化结果表明MAGE-n是一种胞质蛋白。结论: 用MAGE-n蛋白与弗氏佐剂混合免疫兔, 制备得到高效价的抗血清, 纯化后的特异性兔抗人MAGE-n血清, 为进一步研究MAGE-n在各种组织中的表达奠定了基础。     

兔抗人BMP-2成熟肽抗血清的制备

目的利用在大肠杆菌中表达的人骨形成蛋白-2(hBMP-2)成熟肽,制备兔抗hBMP-2成熟肽抗血清.方法将含有hBMP-2成熟肽基因的表达载体pDH2m,转化大肠杆菌,热诱导表达hBMP-2成熟肽,经纯化、复性后,再用其免疫兔子,制备兔抗hBMP-2成熟肽抗血清.并以Western-blot和免疫组化方法对抗血清进行鉴定.结果Western-blot结果显示在对应于hBMP-2成熟肽位置有阳性条带,免疫组化结果显示人软骨细胞胞浆阳性着色.结论hBMP-2成熟肽在大肠杆菌中获得高表达,并成功制备了兔抗hBMP-2成熟肽抗血清.     

人金属硫蛋白MT-2a的原核表达、纯化及其抗血清的制备

目的:在大肠杆菌中表达人金属硫蛋白(MT)-2a与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白,并制备兔抗MT-2a抗血清。方法:人MT表达菌株BL21/GST-MT-2a经IPTG诱导、超声裂解及GlutathioneSepharose4B亲和层析纯化后,以可溶性融合蛋白GST-MT-2a免疫新西兰大白兔,制备抗血清。用双向凝胶免疫扩散和ELISA检测抗血清的效价,用Westernblot检测抗血清的特异性。结果:经诱导表达及亲和层析纯化,每L菌液可获得可溶性融合蛋白GST-MT-2a38mg。以此融合蛋白免疫新西兰大白兔制备的抗血清,双向免疫扩散效价>1∶256,ELISA效价>1×10-7。Westernblot检测证明抗血清的特异性良好。结论:人MT-2a在大肠杆菌中得到高效表达,以纯化的GST-MT-2a可溶性融合蛋白免疫家兔得到高效价、高特异性的抗血清,为进一步研究MT-2a蛋白的生物学功能提供了重要的制剂。     

兔BK通道β亚基多克隆抗血清的制备

目的:用小鼠制备抗兔BK通道β亚基的抗血清。方法:采用RT-PCR扩增编码兔BK通道β亚基胞内段的基因。在大肠杆菌中表达GST-β亚基融合蛋白。以从PAGE凝胶上切下的融合蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗血清。用ELISA和Westernblot鉴定抗血清的特异性。结果:用RT-PCR扩增出约300bp的兔BK通道基因。序列分析显示,扩增的序列与已发布的新西兰大白兔骨骼肌BK通道的序列完全一致。在E.coliDH5α成功地表达Mr约为37000GST-β亚基融合蛋白。ELISA和Westernblot检测证明,针对GST-β亚基融合蛋白的抗血清,不仅可特异性地识别GST-β,也可识别源于兔组织的β蛋白。抗血清的最高滴度达1∶128000。结论:克隆了编码兔BK通道β亚基胞内段的基因,并成功地获得可特异性识别新西兰大白兔BK通道β亚基的高滴度抗血清,为BK通道的进一步研究提供了物质基础。     

人BTLA分子胞外区的原核表达及其多克隆抗体的制备与鉴定

目的:表达并纯化重组人BTLA(hBTLA)分子胞外区,制备和鉴定兔抗hBTLA多克隆抗体,为进一步实验研究奠定基础。方法:采用特异性引物扩增hBTLA胞外功能区DNA,经酶切、连接构建原核表达载体pET28a-hBTLA。将构建的重组表达质粒转化入E.coliBL21(DE3)菌株,采用IPTG诱导表达,Ni-NTA柱亲和层析纯化目的蛋白,SDS-PAGE电泳分析蛋白纯度。将纯化的目的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,并对抗体进行纯化、效价测定及特异性鉴定。结果:序列测定证实构建的pET28a-hBTLA重组表达载体含有hBTLA编码序列,其序列比对分析与GenBank中公布序列一致,质粒在E.coli中诱导表达相对分子质量(Mr)为15720的目的蛋白,SDS-PAGE电泳分析纯化后的目的蛋白达到电泳纯。双向琼脂扩散法检测抗体效价为1∶16,ELISA法检测抗体效价为1∶20 000,Western blot分析显示抗体能特异性结合重组hBTLA蛋白。结论:成功构建了hBTLA蛋白的原核表达载体,获得高纯度的融合蛋白,制备高效价、高特异性的多克隆抗体。     

草原兔尾鼠GST-LZP3融合蛋白的原核表达及其抗体制备

目的 :在原核中表达并纯化草原兔尾鼠卵透明带 3 (zonapellu cida3 ,ZP3 ) ,并以其作为抗原 ,制备抗ZP3的抗血清。方法 :将LZP3基因的核心片段克隆到原核表达载体pGEX 4T 1中。经酶切和序列分析后 ,用重组质粒转化大肠杆菌BL2 1(DE3 ) ,并经丙基β D 硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导产生GST LZP3融合蛋白。以纯化的融合蛋白免疫新西兰兔制备抗血清。抗血清的效价及特异性采用ELISA和Westernblot检测。结果 :成功地构建GST LZP3融合蛋白表达载体 ,并在大肠杆菌中高效表达特异性的GST LZP3融合蛋白。以该融合蛋白免疫兔子获得抗GST LZP3融合蛋白的高效价抗血清。结论 :获得原核表达的GST LZP3融合蛋白并制备了兔抗LZP3的抗血清 ,为采用免疫不育技术进行草原兔尾鼠生育控制的研究提供了重要的制剂     

兔抗人唾液酸转运蛋白抗体的制备及特性鉴定

目的：制备兔抗人唾液酸转运蛋白（sialin）的抗体，并进行特性鉴定。方法：应用RT—PCR从培养的人颌下腺细胞系HSG中扩增编码sialin N端1～38氨基酸的DNA序列，构建重组表达质粒pGEX-5X-1-sialin，测序鉴定后，转化大肠杆菌JM109，在0．1 mmol／L IPTG的诱导下表达GST—sialin融合蛋白。经SDS-PAGE鉴定后，利用GSTrap FF^TM柱纯化融合蛋白，并以其免疫家兔制备抗人sialin抗体。用ELISA法测定兔抗sialin血清的效价；用Western blot及免疫细胞化学等方法鉴定抗血清的特异性。结果：构建了重组表达质粒pGEX-5X-1-sialin；以其转化大肠杆菌在IPTG诱导下，获得以可溶性形式表达的GST-sialin融合蛋白；表达的GST—sialin经GSTrap FF^TM柱纯化后，免疫家兔制备出抗sialin抗血清，ELISA法测定抗血清的效价为1：32000。Western blot鉴定表明，制备的抗sialin抗体可特异地识别HSG细胞中相对分子质量（Mr）约55000的sialin蛋白。免疫细胞化学检测表明，sialin抗血清识别的抗原定位于HSG细胞的细胞质和胞核。结论：成功地制备出兔抗人sialin抗血清，为进一步研究sialin在涎腺组织的功能奠定了基础。     

人乳头瘤病毒16型E2蛋白表达、纯化及抗血清制备

目的 表达人乳头瘤病毒16型(HPV16) E2蛋白,并制备小鼠抗HPV16 E2血清.方法 采用PCR技术扩增HPV16E2基因,构建入pET21b载体,重组表达载体pET21 b-HPV16E2经鉴定后转化大肠埃希菌BL21(DE3),诱导表达并鉴定表达产物.经纯化、变性和复性方法,制备可溶性HPV16 E2蛋白.免疫BALB/c小鼠制备抗血清,检测小鼠IFN-γ、CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4/CD8比值和抗血清滴度变化.结果 酶切和测序结果表明pET21b-HPV16 E2构建成功.表达蛋白相对分子质量(Mr)为42 000,Western blot法证明具有较高特异性.小鼠抗血清效价升高,CD4+T细胞数量和CD4/CD8比值升高,小鼠IFN-γ无升高.结论 成功制备可溶性HPV16 E2蛋白和小鼠抗HPV16 E2高效价的抗血清.     

DnaJ类分子伴侣PBP基因的原核表达及兔抗PBP抗体的制备

目的:在原核系统中表达DnaJ类分子伴侣感光受体外周蛋白结合蛋白(PBP)基因,并制备兔抗PBP的抗体鉴定其特性。方法:应用RTPCR从人胎脑组织总RNA中扩增PBPcDNA。测序后将其克隆到表达载体pET28a中,并在大肠杆菌中以IPTG诱导表达。表达产物经NiNTA亲和层析柱纯化后,用SDSPAGE进行鉴定。以所获纯化的PBP免疫新西兰白兔,制备兔抗PBP抗体。抗体的效价及特异性用Westernblot进行测定和分析。结果:扩增和克隆出了720bp的PBP基因。构建的重组质粒pET28aPBP在大肠杆菌中得到高表达,诱导表达的蛋白存在于包涵体和细菌裂解上清中,纯化的PBP经SDSPAGE鉴定呈单一条带。以纯化的PBP免疫兔,制备了兔抗PBP抗体。Westernblot鉴定证实,该抗体可与原核表达的PBP特异性结合,抗体效价为1∶1600。结论:在原核细胞中表达了具有生物学活性的PBP,并以其为免疫原制备了兔抗PBP的抗体,为进一步研究PBP的结构与生物学活性奠定了基础。     

昆虫抗冻蛋白DAFP的原核表达、纯化和抗血清制备

目的:制备昆虫抗冻蛋白DAFP特异性的鼠抗血清。方法:根据GenBank已发表的Dendroides canadensis抗冻蛋白基因序列(gi:2737939),人工合成加拿大拟步甲虫(Dendroides canadensis)的抗冻蛋白基因(dafp),并克隆到原核表达载体pGEX-4T-1和pMAL-p2x中,在大肠杆菌中进行表达。表达的融合蛋白经Glutathione Sepharose4B纯化后,免疫小鼠制备抗DAFP的抗血清,抗体的效价及特异性分别采用ELISA和Western blot进行检测。结果:SDS-PAGE检测表明,人工合成的dafp基因在大肠杆菌中可表达相对分子质量(Mr)为38000的可溶性融合蛋白。以该融合蛋白免疫小鼠所制备的抗体,其ELISA滴度为1∶5000,Western blot证实BL21/pGEX-4T-1-dafp菌和TB1/pMAL-p2x-dafp菌的表达产物可特异性地与该抗体结合。结论:在大肠杆菌中成功地表达了DAFP的融合蛋白并制备出抗融合蛋白的鼠抗血清,为进一步研究DAFP的特性奠定了基础。