条件培养基对日本血吸虫童虫培养细胞LDH及AgNORs的影响

目的以乳酸脱氢酶(LDH)及核仁组织区相关嗜银蛋白(AgNORs)为评价指标,观察条件培养基对日本血吸虫童虫培养细胞的影响。方法灌注法获取21d虫龄的日本血吸虫虫体,冷消化法制备细胞悬液,调细胞为1×106个/ml,联合法接种细胞。将接种于小盖玻片上的血吸虫细胞随机分为对照(0h)组和24、48、72h3个实验组共4组。对照组用常规培养基即RPMI-1640含20%小牛血清附加常量抗生素(青霉素1×105U/L,链霉素100mg/L)培养,实验组培养基为常规培养基分别与培养24、48、72h的鼻咽癌细胞上清液的条件培养基1∶1的混合液。培养第7天,对培养细胞进行LDH及AgNORs染色;每组随机选取300个LDH染色细胞、50个AgNORs染色细胞输入HPIAS-2000图像分析仪测定培养细胞的吸光度(A)值,并作统计分析。结果日本血吸虫童虫细胞在不同条件培养基作用下,其LDH及AgNORs着色均比对照组深,其中72h组细胞着色最深,其次是48h组,再是24h组,对照组细胞着色最浅,条件培养基培养的各组细胞,LDH含量及AgNORsA值显著大于对照组细胞(q24=8.5287,q48=15.4253,q72=27.6207,P均0.01;q24=13.5690,q48=18.7288,q72=27.0356,P均0.01)。72h的条件培养基作用日本血吸虫童虫细胞后,培养细胞的LDH含量及AgNORsA值明显较对照组高(q0/72=27.6207,P0.01;q0/72=27.0356,P0.01),亦高于其他组(q24/72=19.0919,q48/72=11.8426,P均0.01;q24/72=13.5690,q48/72=18.7288,P均0.01)。结论条件培养基可明显增强日本血吸虫童虫培养细胞LDH的活性及增加AgNORs的含量,且72h的条件培养基对童虫培养细胞的影响最大。     

日本血吸虫童虫培养细胞超微结构动态变化的研究

随着培养时间的延长，日本血吸虫童虫培养细胞的超微结构发生一系列渐进性变化，主要表现在：核中异染色质含量逐渐增加，由０ｄ时的显著少于常染质转变为５４ｄ时的高于常染色质，线粒体逐渐变性，嵴由清晰变为模糊以至消失，基质电子密度降低，最终成为空泡；内质网由环状变为短管状，囊泡状，最后消失。     

日本血吸虫童虫细胞体外培养条件的初步研究

目的 探讨日本血吸虫童虫细胞体外培养条件。方法 选取转铁蛋白、核苷酸、碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)、黄体酮以及非必需氨基酸与维生素组合等5种促进细胞增殖的因子作为考察因素，每种因素选取添加与不添加两个水平，采用正交设计，以RPMI-1640为基础培养液，配制16种条件培养基对日本血吸虫童虫细胞进行体外培养，通过动态观察和AKP组化染色法及直观法分析法获得不同培养条件影响细胞增殖和细胞活力的结果。结果 第2，4，9，13，14孔中的组织出现明显的细胞增殖现象，其细胞AKP检测值也相应较高，各孔中培养细胞的AKP值经直观分析表明：促进细胞增殖最佳因素组合为C181A1，即转铁蛋白、核苷酸、b-FGF。结论 转铁蛋白、核苷酸、b-FGF对日本血吸虫童虫细胞增殖具有明显促进作用。     

日本血吸虫童虫培养细胞超微结构动态变化的研究

随着培养时间的延长，日本血吸虫童虫培养细胞的超微结构发生一系列渐进性变化，主要表现在：核中异染色质含量逐渐增加，由０ｄ时的显著少于常染质转变为５４ｄ时的高于常染色质；线粒体逐渐变性，嵴由清晰变为模糊以至消失，基质电子密度降低，最终成为空泡；内质网由环状变为短管状、囊泡状，最后消失。日本血吸虫童虫培养细胞中线粒体和内质网超微结构的这些变化，可以用来判断培养条件的优劣；而从染色质的一系列变化推断，０～１８ｄ是诱导培养细胞发生增殖的最佳时期。     

日本血吸虫童虫培养细胞SOD和MDA动态变化的研究

目的：观察日本血吸虫童虫细胞在体外培养过程中超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）含量的动态变化，探讨培养细胞的退化过程。方法：应用邻苯三酚自氧化法及硫代巴比妥酸法分别测定童虫细胞在培养0－54d过程中SOD和MDA含量的变化。结果：在培养第12dSOD出现一个高峰，以后一直处于低平状态。MDA在培养第18d和第48d分别各有一个高峰，其后均逐渐降低。结论：日本血吸虫童虫培养细胞呈逐步退化过程。     

正交试验法研究日本血吸虫童虫细胞的培养条件

本研究首次运用正交试验法探讨日本血吸虫童虫细胞的培养条件，以细胞存活时间为指标，对细胞培养过程中的平衡盐溶液、合成培养基及血清浓度诸因素进行了初步研究，结果表明：A2B1C3为最佳组合。即RP－MI－1640，5％小牛血清和0．85％生理盐水，细胞存活时间长达7个月。     

日本血吸虫成虫培养细胞SDH和LDH细胞化学研究

目的　研究日本血吸虫成虫培养细胞琥珀酸脱氢酶 (SDH)和乳酸脱氢酶 (LDH)含量、分布及变化规律 ,了解日本血吸虫成虫培养细胞的能量代谢类型。方法　将虫龄 2 6d的日本血吸虫成虫细胞接种于小盖玻片上 ,培养于RPMI- 16 4 0含2 0 %小牛血清附加常量抗生素的培养基中 ,定时运用Pearson法进行SDH和LDH染色 ,用Olympus-BH2 显微镜观察并拍照 ,用HPIAS - 2 0 0 0图像分析仪测量其含量 ,并作统计分析。结果　日本血吸虫成虫培养细胞均具有SDH和LDH活性 ,两者均分布在细胞质内。培养 1d细胞的SDH和LDH活性最强 ,随着培养时间延长 ,其活性逐渐减弱 ,其中SDH活性下降较快 ,培养 5d大部分细胞SDH活性已极弱 ;而LDH活性下降则较缓 ,培养 5 6d细胞仍具LDH活性。结论　体外培养的日本血吸虫成虫细胞的能量代谢类型与成虫相似 ,既存在三羧酸循环需氧型呼吸链 ,也具有无氧糖酵解 ,但以无氧糖酵解为主。     

基质对日本血吸虫培养细胞SDH和LDH影响的研究

目的　研究细胞外基质 (ECM)对日本血吸虫培养细胞琥珀酸脱氢酶 (SDH)和乳酸脱氢酶 (L DH)代谢活力的影响 ,筛选适合培养细胞存活、生长的生物基质。　方法　将虫龄 2 1d的日本血吸虫细胞接种于预先涂有肝、肺、鼠尾胶等不同生物基质的小盖玻片上常规培养 ,运用酶细胞化学方法 ,在培养第 3d进行 SDH染色 ,第 7d作 L DH染色 ,显微镜观察并拍照 ,图像分析仪测定其含量 ,并作统计分析。　结果　不同 ECM培养的细胞 ,其 SDH、 L DH活性不同 ,着色颗粒颜色按对照组、鼠尾胶组、肺基质组、肝基质组依次加深。定量分析结果显示 ,肝、肺基质组培养细胞 SDH含量与对照组差异显著 (P<0 .0 1) ,而鼠尾胶组与对照组差异不显著 (P>0 .0 5 )。各基质组培养细胞的 L DH含量与对照组比较 ,差异显著 (P<0 .0 1) ;各基质组之间两两比较差异亦具有显著性。肝基质组培养细胞内两种酶含量最高。　结论　肝基质最适合日本血吸虫培养细胞的存活与生长。     

鼠胚胎成纤维细胞饲养层及其与肝基质联合对日本血吸虫童虫培养细胞LDH、ACP影响的研究

目的以乳酸脱氢酶(LDH)、酸性磷酸酶(ACP)为评价指标,研究鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养层及其与肝基质联合对日本血吸虫童虫培养细胞代谢的影响。方法实验分MEF与肝基质联合组(后简称联合组)、MEF组、肝基质组和对照组4组。联合组与肝基质组预先铺敷肝基质,MEF组和对照组未铺敷肝基质,将虫龄21d的日本血吸虫童虫细胞分别接种于预先铺敷或未铺敷肝基质的小盖玻片上。肝基质组和对照组细胞培养于RPMI1640含20%小牛血清附加常量抗生素的常规培养基中,联合组与MEF组的细胞培养于有MEF饲养层的常规培养基中。培养第7d,运用酶细胞化学方法对日本血吸虫童虫培养细胞进行LDH、ACP染色,OlympusBX51显微镜下观察并拍照,HIPAS2000图像分析仪测定其含量,并作统计分析。结果4组童虫培养细胞其LDH、ACP活性不同。LDH、ACP着色按联合组、MEF组、肝基质组、对照组依次变浅。定量分析显示,培养细胞的LDH含量,各组之间两两比较差异具显著性(P<0.01);联合组、MEF组、肝基质组培养细胞的ACP含量两两比较存在显著差异(p<0.01),联合组、MEF组与对照组之间比较差异具统计学意义(P<0.01),而肝基质组与对照组之间差异无显著性(P>0.05)。结论MEF饲养层能促进日本血吸虫童虫培养细胞的代谢,并能与肝基质协同促进培养细胞代谢。     

雄虫抽提物对日本血吸虫卵黄培养细胞最适浓度的筛选

目的筛选雄虫抽提物对日本血吸虫卵黄培养细胞影响的最适作用浓度。方法灌注法获取28 d虫龄的日本血吸虫虫体,无菌处理后分离雌雄虫体。将雄虫匀浆,反复冻融3次,离心取上清液,考马斯亮蓝法测定蛋白后置于-20℃下保存备用。切下雌虫卵黄腺段虫体,冷消化法制备细胞悬液,调整细胞数为1×10~9/L后,将卵黄细胞接种于小盖玻片上,RPMI-1640含20%小牛血清培养,根据加入不同质量浓度雄虫抽提物分为6组(0、10、50、100、150、200mg/L组)。培养第7天,以核仁组织区相关嗜银蛋白(argyrophilic nucleolar organizer region associated proteins,AgNORs)及乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)为评价指标,对卵黄细胞进行AgNORs及LDH染色,Olympus-BH2显微镜观察,输入HPIAS-2000图像分析仪测定培养细胞的灰度值。结果随着雄虫抽提物质量浓度的增加,培养细胞的AgNORs与LDH着色均逐渐加深,至100 mg/L时最深,随后又逐渐变浅。图像分析显示,雄虫抽提物处理的各组细胞AgNORs及LDH均明显高于对照组(q_(10)=14．2189、q_(50)=18．3358、q_(100)= 35．6491、q_(150)=13．1849、q_(200)=13．8604,P＜0．01；q_(10)=10．3377、q_(50)=11．7532、q_(100)=23．1883、q_(150)=10．2792、q_(200)= 9．3052,P＜0．01)。雄虫抽提物100 mg/L组与其他各组比较,AgNORs及LDH明显升高(q_(10)=21．4302、q_(50)= 17．3132、q_(150)=22．4642、q_(200)=21．7887,P＜0．01；q_(10)=12．8506、q_(50)=11．4351、q_(150)=12．8896、q_(200)=13．8831,P＜0．01)。结论雄虫抽提物可显著提高日本血吸虫卵黄细胞的增殖能力与代谢活性,其作用的最适质量浓度为100 mg/L。     

亚精胺对日本血吸虫成虫培养细胞核仁组织区相关嗜银蛋白的影响

目的以日本血吸虫培养细胞核仁组织区相关嗜银蛋白(Argyrophilicnucleolarorganizerregionassociatedproteins,AgNORs)为评价指标,探讨亚精胺(Spermidine,Spd)对培养细胞的促增殖作用。方法采用联合法将虫龄为24d的日本血吸虫成虫细胞接种于小盖玻片上,培养于常规培养基中。接种后第3天,随机分为实验组和对照组。将实验组细胞用无血清培养基配制的终浓度为75μmol/L的Spd处理48h,对照组细胞则用不含Spd的无血清培养基处理,时间相同;PBS清洗3次后换用常规培养基继续培养。于第7、14、21、28、35天分别对培养细胞进行AgNORs染色。使用HPIAS-2000图像分析系统,计算培养细胞核内AgNORs颗粒数及平均吸光值,并作统计分析。结果经Spd处理,各实验组培养细胞AgNORs着色明显深于对照组;但随着培养时间的延长,实验组与对照组细胞着色均逐渐变浅。各实验组细胞AgNORs颗粒数目与平均吸光值高于对照组,二者比较差异有统计学意义(u7=50.95、43.78;u14=55.23、43.54;u21=36.65、32.25;u28=31.6、32.95;u35=28.86、9.54;P<0.01)。各实验组AgNORs吸光值两两比较,除第7天与第14天之间差异无统计学意义外(q=0.008058,P>0.05),其余差异都有统计学意义(P<0.01)。结论Spd具有促进日本血吸虫培养细胞增殖的能力,每周用Spd处理培养细胞1次,能更大限度地促进血吸虫培养细胞的生长。     

细胞外基质促日本血吸虫培养细胞贴壁作用的研究

目的　研究肝、肺生物基质及鼠尾胶三种细胞外基质 (ECM )对日本血吸虫培养细胞的促贴壁作用。方法　灌注法获取 2 1d虫龄的日本血吸虫虫体 ,冷消化法制备细胞悬液 ,将密度为 2× 10 6/ml的细胞悬液分别接种于均匀铺敷三种基质及未铺敷基质 (对照 )的各组培养瓶中进行培养 ,定时计数贴壁细胞数 ,计算贴壁率。结果　随着培养时间从 8h— 4 8h ,各组日本血吸虫细胞的贴壁率逐渐增高 ,4 8h后下降。同一培养时间 ,基质不同 ,细胞的贴壁率不同。培养 4 8h时细胞的贴壁率 ,鼠尾胶组、肝与肺基质组分别为 6 3 2 7%、4 8 95 %、4 5 36 % ;统计学处理发现 ,它们之间差异显著 ;鼠尾胶组与肝、肺基质组比较 ,p <0 0 1;肝与肺基质组之间比较 ,p <0 0 5 ;对照组与各基质组比较 ,均具显著差异 (p <0 0 1)。 结论　ECM对日本血吸虫培养细胞具有明显的促贴壁作用。其中 ,鼠尾胶对日本血吸虫细胞的促贴壁作用最强 ,其次是肝生物基质 ;肺生物基质的促贴壁作用相对较弱 ,但也强于对照组 (p <0 0 1)。     

正交试验法筛选日本血吸虫细胞的培养条件

目的　筛选日本血吸虫成虫细胞的培养条件及评价细胞培养条件优劣的指标。方法　以琥珀酸脱氢酶(SDH)、乳酸脱氢酶(L DH)和葡萄糖- 6 -磷酸脱氢酶(G- 6 - PDH )为指标,运用正交试验法进一步研究合成培养基、细胞外基质和血清浓度3个因素在3个不同水平对虫龄为2 1d的日本血吸虫细胞的影响。培养第5天对日本血吸虫培养细胞进行SDH染色;培养第14天分别进行L DH、G- 6 - PDH染色,Olympus- BH2 显微镜观察并拍照,HPIAS- 2 0 0 0图像分析仪测量其含量,用SPSS10 .0作统计分析。结果　不论以SDH或L DH,还是G- 6 - PDH为指标,均显示RPMI- 16 4 0含2 0 %小牛血清组成的培养基培养接种于肝基质上的日本血吸虫细胞,培养细胞的SDH、L DH、G- 6 -PDH活性最强。血清浓度对培养细胞酶活性的影响最大,其次是细胞外基质(ECM) ,影响最小的是合成培养基。其中,血清浓度对3种酶活性的影响差异均显著;基质对SDH、L DH活性的影响差异显著,而对G- 6 - PDH活性的影响差异不显著;合成培养基的影响均无差异。结论　RPMI- 16 4 0含2 0 %小牛血清组成的培养基培养接种于肝基质上的日本血吸虫细胞,培养细胞的SDH、L DH、G- 6 -PDH活性最强。选择3种酶中任一,均可用来评价日本血吸虫细胞培养条件的优劣。     

日本血吸虫培养细胞整装内质网膜系统形态及基质对其结构的影响

目的 研究日本血吸虫培养细胞整装内质网膜系统的三维结构及细胞外基质(ECM)对其的作用。方法 用高锰酸钾作固定剂，制备日本血吸虫培养细胞整装内质网膜系统标本，扫描电镜下观察。结果 日本血吸虫培养细胞的内质网膜系统由膜性小管、小泡相互连接构成小型扁囊样网络结构。基质中细胞的内质网膜系统较对照组发达、丰富；基质的种类不同，培养细胞内质网膜系统的形态各异。鼠尾胶中细胞多由膜性小管和小泡构成，其网眼数目较少，可见伪足样结构；伪足较短，也由膜性小管或小泡构成管囊状网络。肺基质中细胞几乎均为小管，小泡极少；网眼和伪足数目增多，伪足呈针状。肝基质中细胞的内质网膜系统与肺基质中的相似，但网眼和伪足数目更多，伪足细长，呈纤维状。结论 ECM可明显影响日本血吸虫培养细胞的内质网膜系统形态；ECM的种类不同，培养于其中细胞的内质网膜系统形态不同。     

肝基质对日本血吸虫培养细胞生长的影响

目的研究肝基质对日本血吸虫培养细胞形态、增殖的影响.方法联合法将虫龄为21 d的日本血吸虫童虫细胞接种于预先铺敷有肝基质(实验组)和未铺敷肝基质(对照组)的小盖玻片上,培养于常规培养基中,用高碘酸雪夫(PAS)法染色培养细胞,Olympus-BH2显微镜下观察并拍照;并将接种第3天的实验组和对照组培养细胞用胶银法进行核仁组织区相关嗜银蛋白(AgNORs)染色,HPIAS 2000图像分析仪测定AgNORs平均光密度值进行图像分析.结果实验组中的培养细胞其细胞质突起和分裂细胞增多,AgNORs的平均光密度值显著高于对照组细胞(P＜0.01).实验组的细胞分裂方式除常见的一分为二方式外,还观察到一分为三的多极分裂方式;而对照组未观察到分裂细胞.结论肝基质可明显影响日本血吸虫培养细胞的形态,显著促进培养细胞的增殖.     

日本血吸虫雄虫抽提物对卵黄培养细胞超微结构的影响

目的观察日本血吸虫雄虫抽提物对卵黄培养细胞超微结构的影响。方法灌注法获取28d虫龄的日本血吸虫虫体,无菌处理后分离雌、雄虫体。取雌虫卵黄腺段虫体,冷消化法制备细胞悬液,将细胞接种于培养瓶中,随机分为对照组和实验组。对照组以常规培养基培养,实验组以常规培养基含100μg/ml雄虫抽提物培养。培养第7天,取实验组与对照组细胞制备标本并观察。结果实验组成熟卵黄细胞出现概率较对照组高,核和胞质染色均匀;卵黄滴内的卵黄球之间界限清晰,数目可数;线粒体数目较少,电子密度较低。未成熟卵黄细胞胞质中粗面内质网较丰富。对照组中卵黄细胞的核和胞质电子密度降低,脂滴数目增多,空泡化程度严重,未见线粒体;成熟卵黄细胞中卵黄滴内的卵黄球之间已发生融合,有卵黄球从中释放出来,成为裸露体;未成熟卵黄细胞中卵黄球与外面包绕的膜之间空隙增大,粗面内质网扩大和囊泡变,核糖体脱颗粒。结论日本血吸虫雄虫抽提物对雌虫卵黄细胞在体外的发育与存活具有促进作用。     

日本血吸虫乳酸脱氢酶(SjLDH)结构与功能的生物信息学分析

目的 应用生物信息学分析软件预测日本血吸虫乳酸脱氢酶（SjLDH）氨基酸序列的结构与功能。 方法 应用NCBI、Expasy等在线生物信息学网站及Vector NTI、PCgene等软件包分析SjLDH与其他物种的同源序列，进行多序列同源比对，分析相同的保守位点及催化活性位点，构建分子进化树；预测二级结构、拓扑结构；同源模建预测三级结构；预测主要抗原表位等。 结果 SjLDH与其他物种的同源序列含相同的保守位点及催化活性位点，与华支睾吸虫LDH（CsLDH）同源性最高为75％，与阴道毛滴虫LDH（TvLDH）同源性最低为17%，与人LDH（HsLDH-A，-B，-C）的同源性为58%~60％； SjLDH与果蝇（DmLDH）的进化距离较秀丽隐杆线虫（CeLDH）为近，3种人LDH中与HsLDH-B、-C的进化距离较HsLDH-A为近；该蛋白具有3个跨膜区域，3个高亲水性区域，主要的线性表位98aa~106aa位于膜外，与原虫LDH相同区域差异显著，而与其他LDH有1~3个氨基酸的差异，关键催化位点之一及底物丙酮酸结合区域位于该区域，蛋白质同源模建分析表明该区域位于蛋白表面形成环状结构，3个关键催化位点位于该区域或在其附近。 结论 生物信息学预测结果提示LDH是研究物种分子进化理想的分子；SjLDH可能是免疫诊断、药物作用及疫苗潜在的靶分子。