PCR-ELISA法检测HCV-RNA的临床应用

采用 PCR法检测血清中 HCV-RNA是诊断丙型肝炎和观察抗病毒疗效的重要指标。但常规 PCR仍存在产物污染和需使用有毒化合物溴化乙啶等缺点。我们最近采用抗污染 PCR与 ELISA检测相结合的新方法进行了初步临床应用 ,现将结果报告如下。1　材料和方法1 .1　试剂　由上海复华公司提供成套 PCR-ELISA法试剂盒 ,其中引物对选自 HCV5′非编码区 (5′UTR) ;目的扩增片段长 2 97bp,1 1 5 bp;特异性捕集探针长度为 5 0～ 60bp;第一次扩增反应液中加入适量尿苷酶 (UNG)。抗 -HCVELISA试剂盒、常规 PCR试剂盒购自华美生物工程公司 ,…     

HCV RNA荧光定量PCR在抗HCV阳性者中的应用

本研究通过实时荧光定量PCR技术对抗HCV阳性者血清中HCV　RNA的测定，以确定抗HCV的感染状况，进一步探讨抗HCV与HCV　RNA检测之间的关系。     

荧光定量RT-PCR检测白血病多耐药基因及其临床意义

多药耐药 (ｍｕｌｔｉｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ,ＭＤＲ)导致的化疗失败是肿瘤治疗中亟待解决的问题。鉴于临床ＭＤＲ的出现常与多药耐药基因 (ｍｄｒ1)过度表达有关 ,我们在Ｌｉｇｈｔ ＣｙｃｌｅＰＣＲ仪上对ｍｄｒ1定量的技术方法和临床应用进行了探讨。1　材料和方法1 1　实验对象　 30例急性白血病患者经临床、细胞形态学、免疫学确诊 ,符合全国统一标准 ,男 14例 ,女 16例 ,年龄 12～ 5 4ｙ。正常对照组 8例 ,均为献血员 ,平均年龄 2 7ｙ。治疗缓解标准按照 1978年全国白血病防治研究协作会议拟订的白血病疗效标准规定。未达到缓…     

RT-PCR技术检测抗-HCV阴性血液结果

ＨＣＶ感染人体到抗体转阳有一个较长的窗口期,期间用ＥＬＩＳＡ检测抗－ＨＣＶ总是阴性,这是导致现阶段临床输血传染ＨＣＶ主要原因。而ＨＣＶ感染后数天ＨＣＶ－ＲＮＡ的复制即在进行,引发病毒血症,早期常能检出阳性结果。为此本站自１９９５年３月起对经ＥＬＩＳＡ...     

一步短片段RT—PCR方法检测HCV RNA

目的：为了简化传统ＲＴ－ＰＣＲ操作步骤。方法：利用Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶具有一定的反转录酶活性的特点，对ＨＣＶ ＲＮＡ短序列进行反转当，并对合成的ｃＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增。结果：本法简化了传统ＲＴ－ＰＣＲ操作步骤，提高了结果的稳定性。结论：本法可用于ＨＣＶ ＲＮＡ以及其它ＲＮＡ的临床诊断。     

荧光定量PCR检测HCV-RNA和ELISA检测抗-HCV的比较

目的分析血站开展HCVRNA检测的必要性。方法对48份抗-HCV阳性标本（s／co≥1）、19份抗-HCV灰区可疑标本（0．8≤s／co〈1）及1000份抗-HCV阴性标本（s／co〈0．8）进行FQ—PCR检测。结果三类标本HCV RNA阳性数分别为30例、5例、2例。结论在ELISA检测抗-HCV基础上加做HCV RNA核酸检测,有助于保证输血安全。     

混合血浆荧光定量PCR法筛查献血者HCV RNA的初步研究

目的 研究用荧光定量PCR方法检测混合血浆中的HCV RNA。方法 用12人份混合血浆为基本单元提取HCV RNA，逆转录，四份逆转录产物混合上样于HCV PCR扩增反应体系，用PE5700荧光定量PCR仪检测。HCV RNA质控品检测灵敏度。结果 检测4128份标本中1例HCV RNA阳性，HCV RNA冻干质控品检测灵敏度为105IU／ml。结论 48人份混合血浆荧光定量PCR法可用于血液筛查。     

HCV RNA RT—PCR测定室间质量评价的研究

目的 建立国内ＨＣＶ ＲＮＡ ＲＴ－ＰＣＲ测定的室间质量评价系统。方法：室间质量评价研究工作采用的质控血清盘由１０支冻干质控血清组成，其中包括２份强阳性、２份弱阳性，２份阴性和一个５倍位比稀释系列（４份），将血清盘寄发给各类评实验室并要求各个实验室按照规定时间检测，回报结果，然后对结果进行统计分析。结果 多数参评实验室存在不同程度的假阳性和假阴性的问题。２份强阳性标本检出率均为８７．５％，弱阳性标     

应用荧光定量ＰＣＲ技术对献血员进行ＨＣＶ ＲＮＡ检测

目前，血液系统利用ＥＬＩＳＡ法检测抗—ＨＣＶ对丙型肝炎进行筛查。敏感性和特异性不断提高的抗—ＨＣＶ的ＥＬＩＳＡ检测试剂虽然大大降低了输血及血液制品带来的病毒感染，但因输血导致的丙型肝炎病毒感染仍时有发生，这主要是因为窗口期的存在，在窗口期之内，已经感染病毒的献血者体内尚未产生足够的、可以检测到的特异性抗体，因此ＥＬＩＳＡ试剂的抗—ＨＣＶ检测结果显示为阴性。用高度敏感的荧光定量的ＰＣＲ技术直接检测病毒核酸，就可以大幅度地缩短窗口期，减少病毒传播的可能性。为了解ＥＬＩＳＡ常规筛查合格的献血者中ＨＣＶＲＮＡ检出率的情况，在２００１年２月收集了重庆市血液中心的部分抗—ＨＣＶ阴性血进行了ＨＣＶＲＮＡ检测，现将结果报道如下。     

荧光定量PCR检测HBV—DNA的临床意义

本文采用荧光定量ＰＣＲ法对本院临床和门诊血清标本2 0 0份进行ＨＢＶ ＤＮＡ含量测定 ,探讨ＨＢＶ ＤＮＡ含量与肝病变发展的关系。1　材料和方法1 1　材料　标本取自确诊或怀疑乙肝的患者及无症状体检者 ,共检测 2 0 0例。试剂∶荧光定量ＨＢＶ ＤＮＡ试剂盒由匹基公司提供。仪器∶ＰＥ5 70 0ＰＣＲ仪。1 2　方法　ＨＢＶ ＤＮＡ定量分析采用荧光定量ＰＣＲ法。按操作说明书进行。1 3　统计学方法　各组ＨＢＶ ＤＮＡ含量均数比较采用ｔ检验。遇有阴性结果不参加平均值的统计。2　结果2 1　ＨＢＶ ＤＮＡ、ＦＱ ＰＣＲ标准曲线　ＨＢＶ …     

实时荧光定量RT-PCR技术检测siRNA对HBV复制的干扰效果

目的 运用实时荧光定量RT-PCR的方法,检测小RNA分子（small interfering RNAs,siRNA）对乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）复制的抑制作用.方法 在HepG2.2.15细胞内导入筛选的三条特异抗HBV的siRNA分子,用实时荧光定量RT-PCR的方法,检测干扰后HBV的mRNA表达水平.结果 导入特异siRNA分子的细胞中HBV的mRNA表达量明显降低.结论 实时荧光定量RT-PCR技术能准确可靠的检测mRNA的表达水平,对siRNA分子干扰效果的评价有很好的应用价值.     

实时荧光定量PCR检测血清miR-375表达及临床应用

目的建立ploy(A)聚合酶加尾的SYBR GreenⅠ实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测血清miR-375,并进行临床初步应用。方法用Trizol试剂提取血清总RNA。miR-375ploy(A)聚合酶加尾逆转录获得cDNA,进行SYBR GreenⅠ实时定量PCR扩增检测。制作C.elegans-miR-39模拟物浓度梯度稀释的标准曲线,绝对定量血清中miR-375的表达水平。结果该方法能定量检测血清miR-375表达水平,熔解曲线呈单峰,PCR扩增产物特异,在103~106 copy/μL范围内有良好的线性关系(r2=0.997),并且检测重复性好。糖尿病患者血清中miR-375表达水平明显高于健康体检者,差异有统计学意义(P0.05)。结论所建立的ploy(A)聚合酶加尾SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR能敏感、特异地检测血清中miR-375的表达水平,为下一步临床应用研究奠定了方法学基础。     

定量RT—PCR检测穿孔素mRNA方法的建立与临床初步应用

目的　建立检测穿孔素mRNA的定量RT PCR方法。方法　用限制性内切酶制备竞争性模板 ,建立定量RT PCR方法 ,检测正常人及部分肿瘤病人外周血的穿孔素mRNA水平。结果　 6例正常人的外周血穿孔素mRNA含量为 0 5 1± 0 40pmol/ml,消化道肿瘤患者的穿孔素mRNA水平与正常相比 ,有显著差异 (P <0 .0 1) ,乳腺肿瘤及白血病患者的穿孔素mRNA水平与正常人相比 ,没有差异。结论　穿孔素mRNA水平的降低可能是肿瘤发生的一个重要原因 ;除穿孔素途径以外 ,还存在别的抗肿瘤的效应机制。     

实时荧光定量聚合酶链反应技术检测解脲脲原体生物群的研究

目的建立解脲脲原体生物群Taqman荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测方法。方法根据解脲脲原体生物群MBA基因差异,分别设计并合成引物和探针。优化引物和探针浓度及试验条件,并进行试验的灵敏度、特异性和重复性评价。结果生物1群最适缓冲体系:25μL反应体系中包含2.5U Taq酶,Mg2+2.5mmol/L,上、下游引物0.1pmol/L,TaqMan探针0.2pmol/L,模板DNA 2μL。生物2群最适缓冲体系:25μL反应体系中包含2.5UTaq酶,Mg2+2.5mmol/L,上、下游引物0.2pmol/L,TaqMan探针0.3pmol/L,模板DNA2μL。PCR反应条件:95℃2min;95℃10s;55℃(检测荧光信号)20s,循环40次。该方法线性范围在1.0×102～8 copy/mL之间,检测限达到100～200copy/mL,特异性达到100%,CV值为2.5%。结论 本研究建立的TaqMan荧光PCR检测解脲脲原体生物群线性范围宽、灵敏度高、特异性及重复性好,能够快速进行解脲脲原体生物群检测。     

酶免疫法检测丙型肝炎病毒RNA的聚合酶链反应产物

目的建立一灵敏、快速的检测丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）ＲＮＡ逆转录－套式聚合酶链反应（ＰＣＲ）产物的酶免疫法。方法对第２次ＰＣＲ所用的引物进行双标记，使扩增产物同时被修饰有生物素和荧光素（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）成分，再经过固相的链亲合素进行捕获、辣根过氧化物酶标记的抗－ｆｌｕｏｒｅｓ－ｃｅｉｎ反应后显色测定。结果所建立的方法与常规聚丙烯酰胺凝胶电泳法相比灵敏、快速、准确，结果判断客观，重复性也较好；所测结果可反映ＰＣＲ产物量的多少，但不能准确表示模板量的大小。结论建立的方法可取代电泳法而成为ＨＣＶＲＮＡ常规ＰＣＲ反应产物的检测技术。     

实时荧光定量PCR法与基因芯片法检测HPV的比较

目的 比较基于PCR的基因芯片方法和实时荧光定量PCR方法检测女性子宫颈脱落细胞HPV DNA的相关性. 方法 收集2050份样本采用基因芯片法和实时荧光定量PCR方法进行比对试验,两者结果不符的进行测序验证,并对检测结果进行一致率及阳性率统计分析. 结果 两种方法总一致率、阳性一致率及阴性一致率都在95.0%以上;荧光定量PCR法检测HPV16阳性率50.0%,HPV18阳性率13.9%. 结论 两种方法检测的一致性良好,本实验中所使用的新型12＋2高危型人乳头状瘤病毒核酸检测试剂盒适合应用于育龄期妇女的宫颈癌筛查及随访.     

荧光定量PCR检测弓形虫基因方法的建立

目的　建立荧光定量PCR检测弓形虫基因的方法,并进行实验室方法学评价。方法　PCR扩增弓形虫 529bp重复序列,经TA克隆后转化入大肠杆菌DH5α中;提取重组质粒鉴定后,作为模板建立荧光定量PCR标准曲线,并做重复性试验和临床标本检测。结果　用重组质粒制作的标准曲线循环阈值与模板浓度有良好的线性关系,相关系数 0. 995,平均试验间变异系数 3. 28%,无非特异性扩增。临床标本检测阳性率为 43. 3%。结论　建立了检测弓形虫基因的荧光定量PCR方法,快速、灵敏、特异的特点适合临床实验室的应用。     

实时定量逆转录PCR检测慢性淋巴细胞白血病MDM4基因mRNA的表达及其临床意义

本研究旨在探讨慢性淋巴细胞白血病(CLL)患者鼠双微体4(MDM4)基因mRNA的表达情况及其在CLL预后中的意义.采用SYBRGreenⅠ荧光染料行实时定量逆转录PCR(qRT-PCR)方法检测66例CLL患者白血病细胞MDM4 mRNA的表达,以β-actin为内参照物,以2(-△Ct)方法计算MDM4的相对定量值...     

荧光定量PCR在乙型肝炎患者检测中的临床应用

目的　探讨荧光定量 PCR( fluorescence quantitative polymerase chain reaction,FQ-PCR)定量检测血清HBV-DNA的临床应用价值。方法　采用 FQ-PCR和 ELISA法检测 1 76例乙型肝炎患者血清 HBV DNA含量和 HBV血清学标志物 ,并进行比较分析。结果　 HBs Ag、HBe Ag和抗 -HBc三项阳性 ,HBs Ag、抗 -HBe、抗 -HBc三项阳性 ,HBs Ag、HBe Ag两项阳性 ,HBs Ag、抗 -HBc阳性的样品中 ,HBV DNA阳性率分别为 95 .1 %、83 .3 %、1 0 0 .0 %、81 .8% ,DNA拷贝数/ml分别为 2 .2 9× 1 0 7、1 .2 3× 1 0 6 、8.5 1× 1 0 6 、6.61× 1 0 5,其中以抗 -HBc-Ig M阳性组 DNA拷贝数为最高。结论　 FQ-PCR法检测 HBV DNA具有灵敏度高、结果可靠的优点 ,可检测 HBV感染和复制状态 ,对于乙肝的早期诊断、传染性判断和疗效考核具有重要的指导意义。     

国产和进口荧光定量PCR试剂检测HBV-DNA的比对分析

目的分析国产和进口实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)试剂检测乙型肝炎病毒(HBV)-DNA的相关性,探讨国产和进口试剂在临床应用中的差异。方法使用国产和进口试剂平行检测262例乙型肝炎(乙肝)患者血浆当中的HBV-DNA水平,国产试剂采用手工提取标本,罗氏LightCycler480Ⅱ(LC480Ⅱ)进行核酸扩增;进口试剂则采用罗氏COBAS AmpliPrep(CAP)和COBAS Taqman48(CTM)进行标本提取和扩增;对HBV-DNA病毒载量数据进行对数转换(log10),并将两组数据进行相关分析。结果国产和进口试剂检测结果,经线性拟合,R2=0.814 3。HBV-DNA浓度在10~103 IU/mL的标本,R2=0.300 6;浓度在104~105 IU/mL的标本,R2=0.411 8;浓度在106~108 IU/mL的标本,R2=0.801 7。进口试剂阳性检出率为75.57%(198/262),明显高于国产试剂阳性检出率[65.65%(172/262)]。结论国产试剂和进口试剂相比,相关性良好。HBV-DNA浓度在106~108IU/mL时,相关性最高;浓度在104~105 IU/mL时,相关性一般;浓度在10~103 IU/mL时相关性较差,国产试剂与进口试剂有明显差异,灵敏度有待进一步提高。