靶向同源盒A10特异性干扰性小RNA序列的筛选及功能鉴定

 【摘要】　目的　筛选有效干扰同源盒（HOX）A10基因表达的特异性干扰性小RNA（siRNA）序列并鉴定其功能,为利用RNA干扰技术靶向HOXA10防治肿瘤提供实验依据。方法　设计合成3对针对HOXA10基因不同位点的siRNA序列,应用阳离子脂质体介导转染人肺腺癌A549细胞,采用反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测HOXA10 mRNA表达,以HOXA10与β-actin灰度比值（ODR）表示相对表达水平。筛选出抑制HOXA10效果最佳的siRNA序列,应用四甲基偶氮唑盐（MTT）和流式细胞术分别检测该siRNA干扰HOXA10后对A549细胞增殖和凋亡的影响。结果　3对siRNA均能抑制HOXA10的表达,其中siRNA1抑制HOXA10 mRNA的表达最为明显,ODR为（20.190±1.698）%;siRNA1对A549细胞的增殖抑制率可达（69.793±2.092）%;siRNA转染后细胞凋亡率显著提高,siRNA1诱导A549凋亡作用最为明显,凋亡率为（29.593±2.670）%。结论　筛选出的siRNA1序列可有效沉默HOXA10基因的表达,并能有效抑制A549细胞增殖、促进其凋亡。     

长链非编码RNA同源盒基因A11反义RNA在急性淋巴细胞白血病患儿骨髓中的表达及意义

目的 探讨长链非编码RNA(lncRNA)同源盒基因A11反义RNA(HOXA11-AS)在急性淋巴细胞白血病(ALL)患儿骨髓中的表达及意义.方法 选取108例初治ALL患儿及57例非肿瘤性疾病患儿,比较ALL患儿与非肿瘤性疾病患儿、不同ALL病理类型、治疗后不同疗效ALL患儿HOXA11-AS的相对表达量.实时逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测108例不同临床特征ALL患儿骨髓中HOXA11-AS的相对表达量.结果 108例初治ALL患儿骨髓HOXA11-AS的相对表达量明显高于非肿瘤性疾病患儿(P﹤0.01),其中,B-ALL型初治ALL患儿骨髓HOXA11-AS的相对表达量明显低于T-ALL型患儿(P﹤0.01).108例初治ALL患儿经2个周期的化疗后完全缓解46例,未完全缓解62例,完全缓解患儿HOXA11-AS的相对表达量明显低于未完全缓解和初治ALL患儿(P﹤0.01).BCR/ABL融合基因阳性表达初治ALL患儿骨髓HOXA11-AS的相对表达量,明显高于BCR/ABL融合基因阴性表达患儿(P﹤0.05).结论 HOXA11-AS在ALL患儿中表达上调,并与ALL分型有关,其可能参与ALL的发生发展过程.     

siMDR1重组慢病毒载体的构建及其对A549和A549／DDP细胞的影响

背景与目的:肿瘤细胞的多药耐药性(multidrug resistance,MDR)是导致化疗失败的最主要原因,也是癌症术后复发及转移的主要原因.本研究旨在探讨MDR1基因RNA干扰(RNA interference,RNAi)重组慢病毒对人肺腺癌A549细胞和对顺铂耐药的A549/DDP细胞的MDR1基因的抑制作用.方法:设计获得针对MDR1的短发卡状RNA(small hair pin RNA,shRNA)的寡核苷酸序列,退火后插入线性化的pSUPER载体(H1启动子下游).把构建获得的载体转染A549细胞,RT-PCR法检测其对MDR1的干扰作用,筛选确定MDR1基因RNAi有效靶序列;合成靶序列的01igo DNA,与含启动子和绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的PTM载体连接产生PTM-siMDR1慢病毒载体;用重组慢病毒体外感染A549和A549/DDP细胞.结果:成功构建可以表达针对MDR1的发卡状RNAi,能有效的下调MDR1的表达.成功构建获得针对MDR1基因的慢病毒载体PTM-siMDR1,包装慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为0.5×109TU/mL.感染PTM-siMDRI的A549/DDP细胞对顺铂的敏感性明显提高,逆转倍数达3.81倍.结论:siiDR1重组慢病毒载体感染A549/DDP细胞,能明显改善其对顺铂的耐药性.     

沉默ABCC4基因逆转人胃癌多药耐药的研究

目的 探讨胃癌耐药复发相关基因ABCC4在胃癌耐药复发中的分子机制。方法 采用免疫组织化学、Western blot、RT-PCR、流式细胞检测胃癌组织及胃癌耐药细胞中ABCC4的表达情况,利用RNA干扰技术下调ABCC4基因在胃癌耐药细胞中的表达水平。结果 ABCC4基因在多种胃癌细胞中高表达,尤其是在胃癌耐药细胞中表达增加更为显著,但在正常胃黏膜细胞中极低表达或表达缺失。RNA干扰下调ABCC4基因可导致胃癌耐药细胞发生凋亡,并且细胞周期被阻滞在G1期以内。5-Fu可以显著抑制ABCC4沉默后肿瘤细胞增殖,同时,也能明显抑制ABCC4沉默后裸鼠体内肿瘤生长。结论 ABCC4基因过度表达于胃癌耐药细胞中,下调ABCC4基因表达可抑制胃癌多药耐药细胞增殖,并且可增强其对化疗药物的敏感度。     

WT1基因异构体比例转变对白血病细胞株NB4增殖的影响

背景与目的:WT1基因编码一个锌指转录因子,在白血病细胞中高表达并与预后呈负相关。WT1基因mRNA通过2个可变性的剪切位点产生4种不同的拼接异构体,4种异构体在表达WT1的不同组织中各以其相对稳定的比例表达,白血病细胞中WT1不同异构体表达的意义尚不清楚。本研究拟用WT1基因异构体WTA转导急性早幼粒细胞性白血病细胞株NB4,以探讨WT1基因异构体对NB4细胞增殖的影响及其分子机制。方法:用电穿孔的方法将携带WT1基因异构体WTA(-17AA/-KTS)全长cDNA的重组真核表达载体及其对照质粒pCB6 转导NB4细胞,建立WT1基因异构体表达比例改变的细胞株并用有限稀释法进行单克隆化。采用台盼蓝拒染法、MTT比色法、甲基纤维素集落形成实验及细胞周期动力学检测,了解WT1基因异构体表达比例改变对NB4细胞生长的影响。用半定量RT-PCR检测NB4细胞中p53、p21、CyclinE、CyclinD1、CyclinA1基因表达的改变。结果:WT1基因异构体能够通过电穿孔方法成功转染NB4细胞,外源基因在NB4细胞中稳定整合及表达,并通过有限稀释法将永久表达细胞株单克隆化。用台盼蓝拒染法绘制细胞生长曲线,提示转染WT1基因异构体的细胞NB4/WTA生长明显慢于对照组NB4/CMV细胞及未转染的NB4细胞,NB4/WTA细胞生长曲线平缓,在第3天达平台期(78.7±18.0)×104/ml,对照组NB4/CMV细胞及NB4细胞在第4天出现生长平台期达(146.0±21.0)×104/ml。MTT法检测细胞增殖活性,结果显示,NB4/WTA细胞在各个时间段的抑制率均高于对照组,P<0.005。甲基纤维素集落形成试验中NB4/WTA克隆形成率明显下降,集落形成抑制率为46.9%。在As2O3(终浓度0.2μmol·L-1)作用后集落形成抑制更加明显。细胞周期动力学检测提示,NB4/WTA组S期细胞比例升高。RT-PCR检查提示,NB4/WTA细胞p21、CyclinA1基因的表达较对照组升高。结论:增加外源性WT1基因异构体WTA的表达将WT1基因异构体表达的比例由 17AA/ KTS优势型转变为-17AA/-KTS优势型,能抑制NB4细胞的增殖,使其克隆形成能力明显下降。这可能与p21、CyclinA1基因表达上调,细胞周期阻滞于S期有关。     

siRNA沉默POLE2基因表达对非小细胞肺癌细胞增殖的影响

目的:构建DNA聚合酶εB亚基(POLE2)基因重组慢病毒载体,并检测其在非小细胞肺癌(NSCLC)中的功能。方法:RT-PCR技术检测POLE2基因在A549、NCI-H1975、NCI-H1299细胞中的表达。设计并合成针对POLE2 siRNA靶序列的寡核苷酸单链,退火、酶切后产生GV115-shPOLE2慢病毒载体。该载体含有绿色荧光蛋白（GFR）,经聚合酶链式反应(PCR)筛选出阳性克隆并测序鉴定。将GV115-shPOLE2、Helper1.0、Helper2.0质粒共感染包装293T细胞,包装成假病毒颗粒并感染非小细胞肺癌A549细胞,经免疫印迹法（Western blot）检测筛选POLE2 siRNA有效靶点,从而进行细胞功能学实验。CCK-8法检测POLE2基因沉默对于细胞增殖能力的影响;克隆形成实验检测POLE2基因沉默对细胞克隆形成能力的影响;Casepase3/7检测POLE2基因沉默对细胞凋亡的影响。结果:RT-PCR结果证实POLE2基因在三株细胞中表达丰度均为高表达。PCR和测序结果显示,GV115-shPOLE2慢病毒载体构建正确,经Western blot法证明POLE2 siRNA对于POLE2的外源表达有明显沉默作用,是有效靶点。慢病毒转染A549细胞后细胞增殖明显减缓,细胞克隆数减少,凋亡细胞数增多,与转染阴性对照病毒的A549细胞组相比,差异有统计学意义（P<0.05）。结论:RNAi技术沉默POLE2基因表达后,POLE2 siRNA明显抑制了非小细胞肺癌细胞的增殖。     

靶向SMC1A基因慢病毒介导的RNA干扰对奥沙利铂治疗敏感性的影响

目的 探讨沉默结直肠癌细胞株染色体结构维持-1A（SMC1A）基因对奥沙利铂（L-OHP）敏感性的影响。方法 构建SMC1A基因的小分子RNA干扰表达质粒。与慢病毒包装质粒一起转染239T细胞制备pGCSIL-GFP／SMC1A-siRNA慢病毒载体,并将重组质粒转染结直肠癌SW480、HT-29细胞株。RT-PCR、Western blotting法检测SMC1A mRNA和蛋白的表达情况。CCK-8法检测不同浓度L-OHP对细胞的抑制作用。 结果 pGCSIL-GFP／SMC1A-siRNA慢病毒载体构建成功,RT-PCR产物为343bp。RT-PCR显示重组质粒转染的SW480、HT-29细胞SMC1A mRNA表达量明显低于其对应的未转染细胞（0.13±0.02 vs. 1.02±0.06,0.182±0.019 vs. 1.114±0.032;P＜0.05）;Western blotting 显示干扰后的细胞SMC1A蛋白表达受到明显抑制;不同浓度的L-OHP处理细胞48h后,CCK-8显示转染SMC1A-siRNA细胞生长抑制率较未转染细胞高,差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论 沉默结直肠癌细胞株SMC1A基因对奥沙利铂的敏感性显著增加,为临床进一步提高结直肠癌的疗效提供了研究基础。     

靶向人胃癌SGC7901/VCR细胞多药耐药基因1小分子干扰RNA的有效序列筛选

目的筛选靶向人胃癌SGC7901/VCR细胞多药耐药基因1(MDR1)小分子干扰RNA(siRNA)的有效序列。方法设计并体外转录靶向MDR1的4条siRNA(MDR1si326、MDR1si1513、MDR1si2631和MDR1si3071),转染SGC7901/VCR细胞。用RT PCR检测MDR1mRNA表达,免疫印迹检测P糖蛋白(P gp)表达,流式细胞仪检测细胞内阿霉素(ADR)蓄积,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞对ADR的敏感性。结果4条siRNA均能不同程度逆转SGC7901/VCR细胞MDR1介导的多药耐药。转染后48h,MDR1si326组和MDR1si2631组的mRNA表达水平分别为0.42±0.07和0.49±0.02,较MDR1si1513或MDR1si3071组明显下降(P<0.05);MDR1si326组细胞内ADR蓄积最显著,中位数为30.03,MDR1si2631组次之,MDR1si3071组较少,MDR1si1513组最少(P<0.05);MDR1si2631组对ADR耐药的相对逆转率最高,为(98.12±0.26)%,MDR1si326组次之(P<0.05),MDR1si1513组和MDR1si3071组的差别不大(P>0.05)。转染后72h,MDR1si326组蛋白质表达水平下降最明显。结论MDR1si326对人胃癌SGC7901/VCR细胞MDR1介导的耐药逆转效果最好,MDR1si2631次之,MDR1si3071较差,MDR1si1513最差。     

RNA干扰HOXA9基因对人类急性单核细胞白血病U937细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨小干扰RNA（siRNA）沉默HOXA9基因对人类急性单核细胞白血病U937细胞株增殖、凋亡的影响。方法设计合成针对HOXA9的特异性siRNA寡核苷酸链,应用阳离子脂质体介导瞬时转染U937细胞。实验分为3组：实验组（脂质体转染靶向HOXA9的siRNA）、阴性对照组（脂质体转染阴性对照siRNA）和细胞对照组（仅加等量细胞及培养液）。利用反转录．聚合酶链反应法、Western blot法分别检测各组细胞HOXA9 mRNA、蛋白的表达;四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡。结果转染靶向HOXA9的siRNA后,实验组、阴性对照组、细胞对照组mRNA相对表达水平分别为、（22.980±0．548）％、（82．371±1．517）％、（8d．637±2．252）％（P〈0．05）,蛋白相对表达水平分别为（50．377±2．773）％、（102．275±3．898）％、（107．510±3．905）％（P〈0．05）;siRNA转染后实验组U937细胞增殖明显受抑制且细胞凋亡率显著增高,24、48、72h增殖抑制率分别为（41．909±4．333）％、（54．470±3．756）％、（65．835±1．024）％,凋亡率为（26．800±2．081）％,与细胞对照组、阴性对照组比较差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论靶向HOXA9的siRNA可有效沉默U937细胞HOXA9基因表达,明显抑制细胞的增殖并促进细胞凋亡,为临床白血病HOXA9基因靶向治疗提供了实验依据。     

甲异靛对急性早幼粒细胞白血病细胞系NB4体外作用的研究

目的 探讨甲异靛对NB4细胞系的抑制增生、诱导凋亡和分化的作用。方法 用锥虫蓝染色方法进行活细胞计数;用NBT还原实验和CD11a、CD11b的表达判定促分化作用;光镜和电镜细胞形态学、TUNEL标记和Sub-G1测定观察细胞凋亡,RT-PCR和流式细胞术分析法检测凋亡调控基因mRNA及蛋白水平表达。结果 20μmol／L和30μmol／L甲异靛可明显抑制NB4细胞的增生,诱导细胞凋亡并下调bcl-2表达,使细胞停滞在G0／G1期。5μmol／L和10μmol／L时NB4细胞的NBT还原能力明显升高,CD11a,表达明显升高。结论甲异靛通过诱导细胞凋亡和使细胞停滞在G0／G1期这两种机制显著抑制NB4细胞增生,此外,还有部分诱导细胞分化的作用。     

反义核酸与维甲酸对NB4和HL-60细胞生长分化的影响

目的：急性早幼粒细胞白血病染色体ｔ（１５；１７）易位形成的ＰＭＬ－ＲＡＲα融合基因作为早幼粒细胞白血病的标志与ＡＰＬ的发病及维甲酸诱导分化效应密切相关。本研究将针对ＰＭＬ－ＲＡＲα基因的反义核酸和维甲酸对ＮＢ４细胞和ＨＬ－６０细胞生长分化的影响加以比较，探讨ＰＭＬ－ＲＡＲα基因对维甲酸诱导分化作用的影响。方法：用反义核酸来封闭ＰＭＬ－ＲＡＲα融合基因的表达并用ＲＴ－ＰＣＲ的方法检测。ＮＢ４细胞的生长、分化及功能通过细胞生长曲线、形态学、细胞表面标志及ＮＢＴ还原试验加以判定，细胞周期应用流式细胞仪进行分析。结果：①反义核酸仅能够抑制ＮＢ４的生长，促进ＮＢ４细胞的分化，具有特异性；②维甲酸能够同时影响ＮＢ４和ＨＬ－６０细胞的生长分化；③反义核酸能够降低ＮＢ４细胞Ｓ期细胞百分比，而维甲酸不能。结论：ＡＳＯＤＮ和维甲酸影响ＡＰＬ细胞的生长分化作用机制可能不同，而且反义核酸作用特异性强，作用时相早。     

槲皮素在体外对NB4细胞形态及VEGF分泌的影响

目的 探讨槲皮素对NB4细胞的形态、血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响。方法 以NB4细胞为研究对象,采用Wright染色法观察细胞形态学;Annecxin V标记检测细胞凋亡率;采用ELISA法检测VEGF含量水平。结果 （1）经槲皮素处理后,细胞形态学上出现凋亡特征性改变;（2）槲皮素处理后,NB4细胞凋亡率明显增加;（3）槲皮素处理后,NB4细胞显著降低VEGF的分泌水平。结论 槲皮素在体外能抑制白血病细胞NB4生长并诱导其凋亡;槲皮素可抑制白血病细胞分泌VEGF。     

HOXA13 在非小细胞肺癌组织中的表达及其对A549 细胞和移植瘤生长的影响

[摘要] 目的：探讨HOXA13 在非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）组织中的表达及沉默HOXA13 基因表达对A549 细胞和移植瘤生长的影响。方法：收集2014 年3 月至2016 年4 月在焦作煤业集团有限责任公司中央医院胸外科接受手术切除治疗的112 例NSCLC癌组织和相对应的癌旁组织。qPCR实验检测NSCLC癌和癌旁组织中HOXA13 表达。培养A549 细胞并分为siRNA-HOXA13 组、阴性对照组和对照组,qPCR实验检测A549 细胞中HOXA13 表达,CCK-8 法检测细胞增殖能力,Transwell法检测细胞侵袭能力。建立裸鼠移植瘤模型,观察裸鼠生长情况,5 周后处死,称瘤体质量并计算抑瘤率;qPCR实验检测瘤体组织中HOXA13 表达水平。结果：NSCLC 癌组织中HOXA13 mRNA相对表达量明显高于癌旁组织（1.83±0.13 vs 1.12±0.10,t=47.008,P=0.000）,其相对表达量与TNM 分期、分化程度和淋巴结转移相关（P<0.05）。siRNA-HOXA13 组细胞中HOXA13 mRNA相对表达量低于阴性对照组和对照组（均P<0.05）;siRNA-HOXA13 组24、48、72、96 h 时细胞增殖水平（D值）明显低于阴性对照组和对照组（F=30.727、5.427、13.816 和24.454,均P<0.05 或P<0.01）;siRNA-HOXA13 组侵袭细胞数低于阴性对照组和对照组（均P<0.05）;siRNA-HOXA13 组裸鼠移植瘤5 周时瘤体质量小于阴性对照组和对照组,而抑瘤率高于阴性对照组（均P<0.05）;siRNA-HOXA13 组裸鼠移植瘤组织中HOXA13 mRNA相对表达量低于阴性对照组和对照组（均P<0.01）。结论：NSCLC癌组织中HOXA13 呈高表达,且与肿瘤发生、进展及转移有关;特异性沉默HOXA13 基因表达可抑制细胞增殖和侵袭力,并抑制裸鼠移植瘤生长。     

干扰GTPBP4基因对食管癌EC9706细胞放射敏感性影响

目的:探讨沉默GTPBP4基因对人食管癌EC9706细胞系放射敏感性影响。方法:通过GEO数据库分析食管癌患者组织中GTPBP4的表达情况。利用重组质粒载体介导的RNA干扰(RNAi)技术转染食管癌EC9706细胞系,使细胞中GTPBP4基因沉默,观察GTPBP4基因沉默对EC9706细胞增殖、凋亡及放射敏感性影响。通...     

蛋白酶体抑制剂联合亚砷酸对白血病细胞株NB4的凋亡诱导效应

目的 观察蛋白酶体抑制剂硼替佐米(BOR)联合急性早幼粒细胞白血病(APL)凋亡诱导剂亚砷酸(ATO)对NB4细胞株的作用.方法 BOR单独及联合ATO作用于NB4细胞,应用MTT法观察细胞的生长抑制效应;流式细胞术检测细胞周期变化及凋亡率;RT-PCR方法检测survivin mRNA的表达.结果 MTT法显示BOR对NB4细胞具有生长抑制作用,且能增强ATO对细胞的杀伤作用;流式细胞仪检测可见明显凋亡峰及G2/M期细胞周期阻滞;RT-PCR检测发现两药单独应用均能下调survivin mRNA的表达,联合作用时具相加效应.结论 ATO与BOR联合作用较单独作用有更强的细胞杀伤及诱导细胞凋亡活性,细胞周期G2/M期的阻滞及survivin mRNA表达的下降是蛋白酶体抑制剂及亚砷酸对白血病细胞株联合诱导凋亡的可能机制.     

黄芪及其与柔红霉素联用对白血病NB4细胞株增殖的影响

背景与目的蒽环类药物对心脏的毒性不同程度的限制了其临床应用,中药黄芪对心肌细胞有一定的保护作用,而黄芪对白血病细胞的干预情况了解甚少。本实验旨在了解黄芪以及与柔红霉素(DNR)联合应用时对培养的人白血病细胞株NB4增殖的影响。方法以NB4细胞株为实验模型,实验细胞分为4组空白对照组(不加任何药物)、黄芪组、DNR组及黄芪+DNR组。分别于24、48和72h3个时相收集细胞分析,应用Annexin V+碘化丙锭双染色法观察细胞凋亡情况,以及激光共聚焦显微镜(LSCM)对细胞内DNR蓄积情况进行定性和定量分析检测。结果3个时相收集细胞,黄芪组细胞凋亡率分别为(4.11±0.45)%、(4.68±0.59)%和(6.76±0.85)%,空白对照组为(3.58±0.48)%、(4.81±0.62)%和(5.88±0.82)%,两组差异无显著性(P>0.05);DNR组为(24.31±4.21)%、(39.74±5.26)%和(53.99±7.20)%,黄芪+DNR组为(25.13±4.82)%、(38.92±5.40)%和(60.48±7.89)%,两组差异无显著性(P>0.05)。LSCM检测DNR在细胞内的蓄积情况显示,3个时相DNR组荧光强度分别为112.87±31.68、173.54±38.15和179.33±40.95,黄芪+DNR组为146.67±42.47、148.87±50.28和157.04±43.67,两组差异无显著性(P>0.05)。而DNR组、黄芪+DNR组与空白对照组相比,差异均有显著性(P<0.05)。结论黄芪对NB4细胞的增殖无明显促进或抑制,与DNR联用时,不会影响DNR对白血病细胞的抑制作用。     

RNA干扰技术失活Rad51基因增加肿瘤细胞放射敏感性的研究

目的 研究RNA干扰技术（RNAi）能否失活Rad51基因，从而使肿瘤细胞的放射敏感性增加。方法 应用Psilencer U6-1．0质粒为载体在人纤维肉瘤HTl080细胞内表达短链干扰RNA（siRNA）。RNAi效应在蛋白水平用Westernblot方法评价；在细胞水平用成克隆分析及放射诱导的凋亡来评价。结果 所选3个靶序列均起到失活Rad51的作用，放射诱导的Rad51高表达也能被RNAi抑制。成克隆分析表明实验组存活分数在照射2、4、6、8Gy后，分别是对照组的80．5％、78．6％、69．0％、57．7％（P=0．020）；实验组放射诱导的凋亡在放射后0、6、18、24、48h分别是对照组的1．03、1．43、1．19、1．29、1．33倍（P=0．017）。结论 RNAi技术能够使内源性Rad51基因及放射诱导的Rad51高表达失活，从而使人纤维肉瘤HT1080细胞放射敏感性增加；RNAi技术是一种新的研究基因功能和放射增敏的方法。