短发夹状RNA在人细胞诱导RNA干扰

背景与目的：RNA干扰是一种通过细胞内导入双链RNA而导致特异基因表达抑制的进化保守的转录后基因沉默现象,目前RNA干扰已成为研究基因功能的重要方法。本研究旨在利用DNA载体在细胞内产生短发夹状RNA(short hairpin RNAs,shRNA),通过这些shRNA来诱导RNA干扰(RNAm interference,RNAi),为基因功能分析提供新的实验手段。方法：利用双荧光素酶报告系统来检测DNA载体在细胞内产生的shRNA诱导RNAi的效果。比较该载体产生的shRNA在不同条件下的RNA干扰效果。结果：DNA载体产生的shRNA在人细胞能诱导RNAi,序列特异地抑制基因表达。抑制效果与所选基因靶位点高度相关。结论：shRNA在人细胞能诱导RNA干扰,序列特异地抑制基因表达,这一方法可用于基因功能分析。     

短发夹状RNA使骨肉瘤细胞缺氧诱导因子HIF-1α基因沉默

目的构建低氧诱导因子HIF-1α发夹状小干涉RNA真核表达载体，观察发夹状双链小干涉RNA对骨肉瘤细胞HIF-1的转录后的基因沉默效果?方法体外合成两对互补的寡核苷酸链，分别针对缺氧诱导因子HIF-1αmRNA序列的两个靶位点。退火形成双链，插入pSilencer^TM neoU62．1真核表达载体。将构建好的载体经脂质体介导转染骨肉瘤SaOS-2细胞，观察HIF-lα基因的沉默效果。半定量RT—PCR检测HIF-1αmRNA的抑制程度，免疫荧光和免疫印迹(Western Blot)检测HIF-1α蛋白表达情况。结果测序证实成功构建HIF-1α发夹状小干涉RNA真核表达载体。转录生成的发夹状小干涉能够特异抑制HIF-1α表达。RT—PCR结果显示针对HIF-1αmRNA序列的两个靶位点的沉默效果分别为69％和92％，免疫荧光显示转染后荧光强度显著降低，免疫印迹显示两个靶位点的发夹状小干涉RNA分别使HIF-1α蛋白表达下降66％和90％。结论通过体内转录生成的发夹状小干涉RNA能够使骨肉瘤细胞缺氧诱导因子HIF-1α基因沉默。     

短发夹RNA抑制三氧化二砷耐药的白血病K562／AS2细胞MRP1基因表达的实验研究

 目的　研究短发夹RNA（shRNA）对耐三氧化二砷（As2O3）的白血病K562／AS2细胞MRP1基因表达的抑制作用。方法　设计并合成3条针对MRP1基因的shRNA序列,在脂质体的介导下转染K562／AS2细胞;用荧光实时定量PCR分析MRP1 mRNA的表达水平;流式细胞术检测MRP1蛋白表达和细胞内柔红霉素蓄积量。结果　经MRP1 shRNA作用24 h后,K562／AS2细胞株中MRP1 mRNA和蛋白表达水平明显下降,最大下调幅度分别为（79.1±0.07）% 和（62.48±0.86）%（P＜0.05）,同时细胞内柔红霉素蓄积量显著增加（P＜0.05）。结论　MRP1 shRNA可抑制As2O3耐药的白血病细胞株K562／AS2细胞MRP1基因的表达。     

HER-2 RNA干扰对乳腺癌细胞及其种植肿瘤化疗敏感性的影响

目的: 观察RNA干扰（RNAi）下调HER2受体后乳腺癌细胞及其移植肿瘤对化疗药物表柔比星（epirubicin,EPI）敏感性的变化。方法: 构建能够表达HER2 siRNA 的质粒载体HER2shRNApU6,转染HER2 阳性的乳腺癌细胞SKBR3, RTPCR 与Western blotting 检测SKBR3细胞HER2 mRNA 与蛋白的表达。受转染细胞与不同浓度的化疗药物表柔比星共培养,MTT法检测细胞增殖活性及药物IC50;构建裸鼠乳腺癌模型,观察经HER2shRNApU6治疗后,肿瘤对化疗的敏感性。结果: SKBR3 细胞转染HER2shRNApU6后,HER2 mRNA及蛋白表达出现明显下调,细胞增殖活性出现明显下降（P<0.05）,治疗组肿瘤细胞对表柔比星的化疗敏感性IC50为0.25 μg/μl,而阴性对照及空白对照分别为3.46 μg/μl和3.69 μg/μl。裸鼠移植肿瘤模型中,治疗组肿瘤重量明显低于空白对照和阴性对照\[（2.17±0.58） vs (3.13±0.38)、（3.21±0.89）g\]。结论: 〗HER2的RNA干扰显著抑制乳腺癌SKBR3细胞mRNA和蛋白表达,从而明显提高肿瘤细胞及其种植瘤对表柔比星的敏感性。     

HER-2 RNA干扰对乳腺癌细胞及其种植肿瘤化疗敏感性的影响

目的:观察RNA干扰(RNAi)下调HER-2受体后乳腺癌细胞及其移植肿瘤对化疗药物表柔比星(epirubicin,EPI)敏感性的变化.方法:构建能够表达HER-2 siRNA 的质粒载体HER-2shRNApU6,转染HER-2 阳性的乳腺癌细胞SKBR-3, RT-PCR 与Western blotting 检测SKBR-3细胞HER-2 mRNA 与蛋白的表达.受转染细胞与不同浓度的化疗药物表柔比星共培养,MTT法检测细胞增殖活性及药物IC50;构建裸鼠乳腺癌模型,观察经HER-2shRNApU6治疗后,肿瘤对化疗的敏感性. 结果:SKBR-3 细胞转染HER-2shRNApU6后,HER-2 mRNA及蛋白表达出现明显下调,细胞增殖活性出现明显下降(P<0.05),治疗组肿瘤细胞对表柔比星的化疗敏感性IC50为0.25 μg/μl,而阴性对照及空白对照分别为3.46 μg/μl和3.69 μg/μl.裸鼠移植肿瘤模型中,治疗组肿瘤重量明显低于空白对照和阴性对照[(2.17±0.58) vs (3.13±0.38)、(3.21±0.89)g].结论:HER-2的RNA干扰显著抑制乳腺癌SKBR-3细胞mRNA和蛋白表达,从而明显提高肿瘤细胞及其种植瘤对表柔比星的敏感性.     

靶向VEGF发夹状RNA对宫颈癌HeLa细胞抑制作用的研究

目的:运用RNAi技术下调血管内皮生长因子(VEGF)在HeLa细胞中的表达,观察其对肿瘤细胞凋亡的影响,为人宫颈癌治疗提供理论依据。方法:设计并构建针对VEGF的携带绿色荧光蛋白(GFP)发夹状RNA(shRNA)质粒表达载体(PGPU6/GFP/Neo-shRNA),脂质体法转染HeLa细胞;荧光显微镜观察GFP的表达,并计算转染效率;RT-PCR检测HeLa细胞VEGF的表达,筛选出靶序列;再用流式细胞仪法检测细胞凋亡。结果:构建的PGPU6/GFP/Neo载体成功转入HeLa细胞;转染48h后,HeLa-shVEGF1组HeLa细胞VEGFmRNA表达的抑制率为75.0%;与HeLa组和HeLa-shNC组相比,HeLa-shVEGF1组HeLa细胞凋亡率明显增加,P<0.01。结论:本研究构建的PGPU6-shRNA表达载体携带GFP便于观察细胞的转染情况,且不影响U6启动子的转录,同时有效沉默了VEGF基因,明显增加HeLa细胞的凋亡,为未来肿瘤的治疗提供新途径。     

短发夹RNA抑制喉癌细胞hTERT基因表达及诱导细胞凋亡

目的:探讨DNA载体途径的RNA干扰技术抑制人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因表达及诱导喉癌细胞Hep-2凋亡的作用。方法:构建靶向hTERTmRNA的质粒pshRNA1、pshRNA2及对照质粒pshRNA3、pEGFP,并将其分别转染喉鳞癌Hep-2细胞。共聚焦荧光显微镜观察质粒转染及表达情况;RT-PCR测定hTERTmRNA表达;Western印迹测定hTERT蛋白表达;末端重复片断扩增-酶联免疫吸附(TRAP-ELISA)方法测定细胞端粒酶活性;MTT法研究细胞增殖活性变化;原位细胞凋亡(TUNEL)及透射电子显微镜研究细胞凋亡。结果:①共聚焦荧光显微镜下见大量的细胞呈现绿色荧光,与其他组比较,pshRNA1、2组呈现荧光的死亡细胞显著增加。②pshRNA1、2转染细胞后hTERTmRNA及hTERT蛋白表达显著降低;其端粒酶活性明显受到抑制:转染后2 d pshRNA1组活性为:0.159±0.039、pshRNA2组活性为0.163±0.028,与空白对照组1.523±0.076比较,差异有非常显著性(P<0.005)。③pshRNA1、2转染细胞后可显著抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡。这两组细胞透射电镜可见典型细胞凋亡特征。结论:DNA载体途径的RNA干扰技术能有效抑制hTERT基因的表达及端粒酶活性并诱导癌细胞凋亡,此法可能成为抑制肿瘤细胞的新途径。     

短发夹RNA抑制肝癌细胞HepG2 COX-2基因表达的探讨

目的：研究shRNA对肝癌细胞株HepG2中COX-2基因表达的抑制作用,同时检测对细胞周期和细胞生长的影响。方法：设计、合成一对环氧化酶-2（COX-2）基因编码的反向重复序列,中间间隔9个核苷酸序列,定向克隆至质粒载体pGenesil-1,构建抑制COX-2基因的短发夹RNA（short hairpin RNA shRNA）的重组表达质粒pshRNA-COX-2,用脂质体Lipofectamine^TM2000转染肝癌细胞HepG2,经RT-PCR和Westernblot分别检测pshRNA-COX-2重组表达质粒对COX-2mRNA和蛋白抑制效应,流式细胞仪检测细胞周期、细胞计数检测细胞生长变化。结果：pshRNA-COX-2重组表达质粒能够抑制COX-2基因表达。与未转染肝癌细胞HepG2相比,pshRNA-COX-2重组表达质粒转染肝癌细胞后,COX-2 mRNA和蛋白表达明显降低,抑制率分别为69.9%和50.3%;G0-G1期细胞由55.4%上升为77.9%,S期细胞由31.1%下降为16.2%;细胞生长明显减慢。结论：构建的pshRNA-COX-2重组表达载体能够显著抑制COX-2基因表达;引起G0-G1期细胞增多,S期细胞减少,从而阻止肝癌细胞生长。     

MDR1短发夹RNA表达质粒的构建及其功能的初步研究

目的构建在哺乳动物细胞中表达MDR1短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)的表达质粒,并初步探讨其对耐药肝癌细胞MDR1 mRNA的抑制作用及抗肿瘤药物耐药性的影响.方法根据Genbank中MDR1 mRNA设计的两条多聚核苷酸序列,退火形成双链DNA,再与经双酶切后的载体PGE-1连接,构建pshRNA-MDR1重组质粒,在脂质体的介导下转染肝癌细胞株BEL-7402/ADM,RT-PCR分析MDR1 mRNA的表达,MTT法检测阿霉素对细胞的半数抑制浓度(IC50).结果PCR和DNA测序证实了表达质粒构建成功,并能明显地抑制BEL-7402/ADM MDR1 mRNA的表达,对阿霉素的耐药指数降低了17.5倍(299.2/17.1).结论构建的pshRNA-MDR1表达质粒能有效地抑制转染细胞MDR1 mRNA,从而提高肿瘤细胞的药物敏感性.     

短发夹RNA抑制三氧化二砷耐药的白血病K562/AS2细胞MRPI基因表达的实验研究

目的 研究短发夹RNA(shRNA)对耐三氧化二砷(As2O3)的白血病K562/AS2细胞MRPI基因表达的抑制作用.方法 设计并合成3条针对MRPI基因的shRNA序列,在脂质体的介导下转染K562/AS2细胞;用荧光实时定量PCR分析MRPI mRNA的表达水平;流式细胞术检测MRPI蛋白表达和细胞内柔红霉素蓄积量.结果 经MRPI shRNA作用24 h后,K562/AS2细胞株中MRPImRNA和蛋白表达水平明显下降,最大下调幅度分别为(79.1±0.07)%和(62.48±0.86)%(P<0.05),同时细胞内柔红霉素蓄积量显著增加(P<0.05).结论 MRPI shRNA可抑制As2O3耐药的白血病细胞株K562/AS2细胞MRPl基因的表达.     

沉默survivin基因以增加骨髓瘤细胞对阿霉素敏感性的研究

背景与目的:Survivin是凋亡抑制蛋白家族成员之一,在多种恶性肿瘤中高表达,但在正常成人分化组织中无表达。其表达与多种肿瘤的预后及肿瘤对放、化疗的耐受有关。本研究采用RNA干扰技术下调survivin基因在人骨髓瘤细胞系KM3中的表达,观察其诱导KM3细胞凋亡的作用,及是否增加KM3细胞对阿霉素的敏感性。方法:针对survivinmRNA体外化学合成小干扰RNA(siRNA),采用脂质体介导转染KM3细胞,以RT-PCR和Westernblot方法检测转染后24h、48h和72hKM3细胞survivinmRNA和蛋白的表达,荧光显微镜观察干扰前后细胞的凋亡情况,细胞毒分析方法比较转染前后对阿霉素敏感性的变化。结果:转染survivinsiRNA后24h、48h和72h,与阴性对照组相比,KM3细胞survivinmRNA水平分别下调了(47.0±4.3)%、(81.4±6.2)%和(49.1±7.9)%,蛋白质表达下调了(39.6±3.8)%、(56.4±6.7)%和(68.2±5.1)%。荧光显微镜下可见转染survivinsiRNA48h后的KM3细胞,凋亡率为(28±7)%,明显高于转染阴性对照siRNA的细胞。转染后细胞对阿霉素的敏感性增加,IC50由(1.12±0.14)μmol/L下降至(0.31±0.03)μmol/L。结论:以siRNA下调survivin的表达可有效诱导KM3细胞凋亡,并增加其对阿霉素的敏感性。     

BCAR1基因与乳腺癌抗雌激素药物耐药的相关研究

乳腺癌抗雌激素药物耐药是导致雌激素受体阳性患者内分泌治疗失败的重要原因之一。BCAR1／p130Cas蛋白能在活体外诱导雌激素依赖性乳腺癌细胞对抗雌激素药物产生耐药,是内分泌治疗的重要耐药因子,其诱导机制尚不能确定。但研究表明检测BCAR1／p130Cas蛋白表达水平可以提示乳腺癌临床内分泌治疗的效果。     

survivin基因与肿瘤多药耐药

肿瘤多药耐药是多种复杂机制共同作用的结果。大量研究表明survivin基因参与了细胞凋亡和细胞有丝分裂的调控,与肿瘤多耐药密切相关。     

低毫安(10mA)电化学治疗对人乳腺癌细胞耐药性的逆转作用

目的:研究低毫安(10mA)电化学治疗对人乳腺癌细胞阿霉素耐药株(MCF-7/ADR)多药耐药(MDR)性的逆转作用及其机制.方法:用MTT法测定电化学治疗对细胞的生长抑制作用,荧光分光光度法检测细胞内阿霉素(ADR)的浓度,流式细胞术检测细胞p-糖蛋白(P-gp)的表达.结果:低毫安电化学治疗(0.1C-2C)能不同程度降低ADR对MCF-7/ADR细胞的IC5o;2C的电化学治疗能显著提高ADR在MCF-7/ADR细胞内的浓度,降低MCF-7/ADR细胞P-gp的表达.结论:电化学治疗能逆转MCF-7/ADR细胞的MDR,其机理可能是抑制了P-gp的功能表达,增加了细胞内ADR的积累.     

短发夹RNA沉默促肝细胞再生磷酸酶-3基因表达对乳腺癌MCF-7细胞生长和侵袭能力的影响

目的构建以促肝细胞再生磷酸酶-3（PRL-3）为靶基因的短发夹状小干扰RNA（short hairpin RNA,shRNA）表达载体,并探讨PRL-3-shRNA表达载体对人乳腺癌MCF-7细胞增殖、凋亡和侵袭能力的影响。方法 构建PRL-3基因特异性shRNA表达载体,使用脂质体法将PRL-3-shRNA表达载体转染入MCF-7细胞。采用Real-ti me PCR和Western blot分别检测转染后MCF-7细胞中PRL-3基因mRNA和蛋白的表达;运用四甲基偶氮唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）比色法检测转染后MCF-7细胞的增殖水平,用流式细胞仪检测细胞凋亡的情况;采用Transwell小室法检测细胞侵袭力变化。计量资料采用单因素方差分析或重复测量方差分析。结果 酶切鉴定和测序分析证实PRL-3-shRNA表达载体成功构建。转染成功后,shRNA-1~3组PRL-3基因mRNA表达分别为（0.31±0.27）、（0.15±0.14）和（0.31±0.03）,与空白组和阴性组（1.00±0.00、0.98±0.18）相比,差异有统计学意义（P〈0.05）。PRL-3-shRNA-2组PRL-3蛋白的表达量明显低于阴性组和空白组（0.50±0.02比0.91±0.03和0.89±0.02,P〈0.05）;PRL-3-shRNA-2转染入MCF-7细胞后能明显降低其增殖水平（P〈0.05）;PRL-3-shRNA-2组凋亡率明显高于空白组和阴性组[（8.37±1.85）%比（1.60±1.58）%和（0.16±0.05）%,P〈0.05];Transwell小室侵袭实验显示,PRL-3-shRNA-2组穿膜细胞数明显低于阴性组和空白组（P〈0.05）。结论 沉默PRL-3基因表达可抑制MCF-7细胞的增殖,促进凋亡,抑制其侵袭能力     

siRNA干扰MT1H基因对A549/DDP细胞耐药性的逆转

目的：探讨siRNA干扰金属硫蛋白1H（metallothionein 1H,MT1H）基因逆转A549/DDP细胞耐药的可行性。方法：采用RT-PCR方法检测MT1H基因在A549和其顺铂耐药株A549/DDP细胞中的表达;将针对MT1H的siRNA导入A549/DDP细胞;用RT-PCR和斑点印迹方法分析MT1H基因表达情况;MTT法观察细胞顺铂耐药性;TUNEL、流式细胞术检测顺铂诱导细胞凋亡率;免疫细胞化学分析凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达。结果：MT1H在A549/DDP细胞中高表达但不在A549细胞中表达;A549/DDP细胞转染48 h后,与对照组比较,MT1HsiRNA转染组MT1H mRNA和蛋白表达均明显下调,细胞对DDP的药物敏感性明显提高,DDP诱导凋亡率明显增加,Bcl-2表达明显下降,Bax表达无变化。结论：MT1H基因沉默能降低Bcl-2表达,增强顺铂对A549/DDP细胞凋亡诱导作用,有效逆转A549/DDP细胞耐药。     

Combination gene therapy using multidrug resistance (MDR1) gene shRNA and herpes simplex virus-thymidine kinase

The current study was designed to evaluate the anti-tumor effects of MDR1 shRNA in combination with herpes simplex virus-thymidine kinase/ganciclovir (HSV-tk/GCV) suicide gene therapy system. Introduction of an MDR1-targeted small hairpin RNA (shMDR) markedly enhanced the intracellular accumulation of and increased sensitivity to drugs transported by P-glycoprotein. Functional TK-eGFP fusion protein expression was confirmed by Western blot analysis and ganciclovir uptake assay. Compared with GCV or doxorubicin alone, the combination of anti-cancer drug chemotherapy with GCV administration displays additive cytotoxicity in shMDR1-TK-eGFP expressing cells. These results for the first time suggest the potential of combination gene therapy using suicide gene therapy and RNAi-based gene therapy in vitro.     

长程多柔比星化疗富集乳腺肿瘤干细胞

目的:探讨长程多柔比星( adriamycin,ADR)作用乳腺癌细胞株MCF-7对富集肿瘤干细胞的可能性.方法:采用长程ADR诱导的方法建立ADR耐药细胞株MCF-7/ADR'.ALDEFLUOR法检测亲本MCF-7细胞及ADR耐药细胞MCF-7/ADR'中乙醛脱氢酶1(aldehyde dehydrogenase 1,ALDH1)阳性的肿瘤干细胞亚群的比例,然后采用无血清悬浮培养和裸鼠成瘤实验分别检测两者在体外形成干细胞微球体和体内成瘤能力的差异.结果:MCF-7和MCF-7/ADR'细胞中ALDH1+肿瘤干细胞亚群的比例分别为(0.82±0.77)％和(8.21±2.38)％,两者差异有统计学意义(P＜0.05);两者经无血清悬浮培养形成干细胞微球体的比例分别为(2.17±0.70)％和(7.87±1.39)％,差异有统计学意义(P＜0.05).MCF-7/ADR'细胞在裸鼠体内的成瘤能力明显强于MCF-7细胞.结论:长程ADR作用MCF-7后可富集肿瘤干细胞.     

Activation of fibronectin/PI-3K/Akt2 leads to chemoresistance to docetaxel by regulating survivin protein expression in ovarian and breast cancer cells

The purpose of this study was to investigate the possible role of PI-3K/Akt2 pathway in docetaxel-induced apoptosis. Here we showed that transfection of full-length Akt2 into breast and ovarian cancer cells could provoke Akt phosphorylation and induce an enhanced resistance to docetaxel. FN adhesion promoted Akt phosphorylation in highly metastatic cancer cells A2780 and MDAMB231, and further brought on significant protection for tumor cells against docetaxel-induced apoptosis. Inhibition of Akt2 activity by co-transfection with two shRNA vectors targeting the same Akt2 mRNA or simply by administration with PI 3-Kinase inhibitor Ly294002 counteracted the ability of FN to protect cells from undergoing apoptosis induced by docetaxel. We further showed that Akt2 activation protected against docetaxel-induced apoptosis by regulating survivin levels in a PI 3-Kinase-dependent manner. We conclude that FN/PI-3K/Akt2 pathway might play an important role in inducing resistance to docetaxel in breast and ovarian cancer cells. Our results therefore indicate that the activation of Akt2, promoted by FN attachment, might be critical in determining whether cells survive or undergo apoptosis. Targeting the PI-3K/Akt2 pathway might be a promising strategy for enhancing sensitivity to docetaxel in breast or ovarian cancer.     

CAV1基因沉默增强MCF-7多细胞球对多柔比星的敏感性

背景与目的:肿瘤细胞形成多细胞球后,对许多化疗药物的耐受性明显增强,这种现象被称为“多细胞耐药”.其发生机制可能与细胞黏附引起的信号通路活性的改变有关.细胞质膜微囊蛋白-1 (caveolin-1,CAV1)是一个细胞膜蛋白,在细胞膜信号通路的调节中发挥重要作用.本研究旨在探讨CAV1基因沉默是否能增强MCF-7多细胞球对多柔比星的敏感性,并初步探讨其机制.方法:用liquid overlay技术培养获得MCF-7多细胞球,用脂质体转染法把特异针对CAV1基因的双链小RNA干扰片段导入MCF-7细胞中,采用台盼蓝拒染法检测多柔比星对MCF-7的细胞抑制率,分别用RT-PCR和免疫印迹法检测CAV1 mRNA水平及蛋白水平,用免疫印迹法检测细胞总黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)及磷酸化FAK (p-FAK)蛋白水平.结果:与单层细胞相比,多细胞球组的多柔比星细胞抑制率明显降低,FAK相对磷酸化水平增加2.64倍(t=7.32,P＜0.01);CAV1基因沉默后,MCF-7多细胞球生长缓慢,球体较松散,与未转染组相比,干扰组多细胞球多柔比星(1 μ mol/L)的细胞抑制率增加了1.07倍(t=5.77,P＜0.01),FAK相对磷酸化水平下降68.7％(t=6.57,P＜0.01).结论:多细胞球的形成可以增强MCF-7细胞对多柔比星的耐受性;CAV1基因沉默能逆转MCF-7多细胞球对多柔比星的耐药现象,FAK相对磷酸化水平的下调可能是其重要机制.