基于同源加尾系统的4种腹泻病毒的多重RT-PCR检测方法

目的针对轮状病毒、诺如病毒、星状病毒和扎如病毒四种常见腹泻病毒,建立基于同源加尾(Homo-Tag AssistedNon-Dimer,HAND)系统的一步法四重RT-PCR检测方法。方法根据4种病毒基因组保守序列设计引物并在5’端加上同源尾巴序列。通过优化通用尾巴引物和特异性加尾引物的浓度等PCR参数构建四重RT-PCR反应体系,并系统评价其稳定性、特异性和灵敏度。结果成功建立基于HAND系统的4种腹泻病毒一步法多重RT-PCR检测方法。特异性分析显示四种病毒间无交叉反应,灵敏度分析显示轮状病毒、诺如病毒、星状病毒和扎如病毒的检测下限分别达到48、9.6、1.92和48 pg。结论所建立的基于HAND系统的4种腹泻病毒多重RT-PCR检测方法简便快速、灵敏特异稳定、成本低廉,非常适用于基层医学实验室。     

多重荧光定量PCR检测婴幼儿腹泻病毒感染及其临床应用

目的:建立一种能同时检测婴幼儿腹泻粪便中常见病毒的多重荧光定量 PCR技术。方法:根据GenBank上几种病毒基因组保守序列设计引物序列,建立多重荧光定量PCR方法,对所建立的多重荧光定量PCR方法的特异性、灵敏性及重复性进行验证;并以所建立的方法对150例婴幼儿病毒性腹泻患者粪便标本进行检测。结果:所建立的多重荧光定量PCR检测方法具有很好的特异性,灵敏性检测可达102拷贝/mL,检测不同病毒核酸浓度各自的检测 Ct 值标准差均较小,变异系数均低于1.0%,具有较好的重复性;检测150 份粪便标本,多重荧光定量 PCR 的检出率为36%,胶体金方法检出率为38.67%,两者比较差别无统计学意义（χ2= 6.91,P > 0.05）。多重荧光定量 PCR方法中轮状病毒、腺病毒、诺如病毒、星状病毒的检出率分别为12.67%、6.00%、13.33%和4.00%,测序结果与已知病毒株基因都具有高度同源性。结论:所建立的多重荧光定量PCR方法快速、特异、灵敏,可以作为临床病原诊断的一个重要工具且适用于流行病学调查研究。     

多重PCR检测婴幼儿腹泻样本中常见病毒

目的初步了解深圳地区引起临床婴幼儿急性腹泻中常见病毒的病原分布情况,为临床防治提供依据。方法采用多重RT-PCR方法检测婴幼儿急性腹泻常见病毒:轮状病毒(RV)、星状病毒(AstV)、诺如病毒(NV),采用单重PCR法筛查临床腹泻标本肠道腺病毒(EAdV)。结果在440份标本中,共检出197例至少感染一种腹泻病毒,总阳性率为44.77%(197/440),其中183例为一种病毒感染,14例(3.18%)为混合感染。4种腹泻病毒以RV感染为主,阳性率为28.64%(126/440);其次是EAdV,阳性率为8.86%(39/440);NV阳性率为5.45%(24/440);AstV阳性率为1.82%(8/440)。混合感染以RV合并其他病毒感染为主,占92.86%。结论 RV、EAdV和NV是引起深圳地区婴幼儿急性腹泻的主要病毒致病原,混合感染以RV联合其他病毒感染为主,临床上应根据所感染病原体制定有针对性的诊治措施。     

结合内标的小鼠诺如病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

目的 建立一种快速、特异、敏感的荧光定量RT-PCR检测方法,用于小鼠诺如病毒（Murine Norovirus,MNV）的检测。方法 根据MNV ORF1-ORF2结合区域中保守序列设计一对特异性引物和Taqman探针,同时设计和制备了内标用于监控假阴性,建立含有内标的荧光定量RT-PCR检测体系,通过优化,得到最佳反应体系和反应条件;构建质粒标准品并以之为模板绘制标准曲线;进行特异性、敏感性和重复性试验,最后用建立的方法检测344份小鼠临床样本,验证在临床应用中的效果。结果 该方法特异性强,与小鼠肝炎病毒、小鼠脑脊髓炎病毒、仙台病毒、小鼠肺炎病毒、呼肠孤病毒Ⅲ型、出血热病毒和淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒不发生交叉反应。构建的荧光定量标准曲线Ct值与模板浓度呈良好的线性关系相关系数R2＝0.9986,可以检测到10拷贝/μL的质粒标准品,对MNV活病毒检测可检测到1.78?0-2 TCID50/mL的病毒,检测灵敏度比常规RT-PCR高10倍,比病毒分离高100倍。对5份样品进行5次批内和批间重复检测,检测结果变异系数均小于2%。通过对344份临床样品检测,检测到阳性样品103份,阳性率29.94%。有5份样本结果为假阴性。 结论 本研究建立的MNV荧光定量RT-PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好,由于加入了内标, 能有效地监控假阴性的出现,适合用于MNV日常监测、临床诊断和流行病学调查。     

荧光RT-PCR与RT-LAMP检测GⅡ4型诺如病毒的比较和应用

目的 建立在临床或疾控上可进行简单、快速、灵敏、有效的GⅡ4型诺如病毒检测方法。方法 根据GⅡ4型诺如病毒基因组保守序列建立实时荧光RT-PCR和RT-LAMP检测方法，研究两者的敏感性、特异性和灵敏度，并进行临床应用。结果 建立了GⅡ4型诺如病毒的实时荧光RT-PCR和RT-LAMP检测方法，敏感性和特异性良好，灵敏度相当。结论 实时荧光RT-PCR和RT-LAMP可在临床或疾控应用。     

ELISA法、荧光免疫法及PCR检测婴幼儿腹泻常见病毒

目的 了解不同方法学检测婴幼儿腹泻常见病毒的检测结果差异及一致性情况.方法 采用酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫荧光法(四联法)及聚合酶链式反应(PCR)技术筛查深圳市福田区引起临床婴幼儿急性腹泻的轮状病毒(RV)、肠道腺病毒(EAdV)、诺如病毒(NV)和星状病毒(AstV)的抗原,并将检测结果数据进行对比.结果酶免法与荧光免疫法检测数据对比:对RV,NV,EAdV的抗原阳性检出率差异有统计学意义(P＜0.05),对AstV抗原阳性检出率差异无统计学意义(P＜0.05);两种方法对RV的检测结果具有较好的一致性(Kappa值为0.558),对NV,EAdV和AstV的检测结果一致性较差(Kappa值分别为0.142,-0.025和0.361);ELISA法和PCR检测数据对比:ELISA法除对EAdV阳性检出率低于PCR外,对其他3种病毒的阳性检出率均高于PCR,且经x2检验显示两种方法对4种病毒的阳性检出率差异均有统计学意义(P＜0.05).两种方法对RV,NV,AstV的检测结果具有很好的一致性(Kappa值均＞0.75),对EAdV的检测结果一致性较好(Kappa值为0.537);荧光免疫法(四联法)和PCR检测数据对比:除AstV外,两种方法对其他3种病毒的阳性检出率差异均有统计学意义(P＜0.05).对RV的检测结果具有很好的一致性(Kappa值为0.764),对EAdV的检测结果一致性较好(Kappa值为0.452),NV和AstV的检测结果一致性差(Kappa值分别为0.181和-0.017).结论 ELISA法和荧光免疫法(四联法)对腹泻病毒的检测,除轮状病毒外,其它病毒检测结果的一致性较差,只可用于腹泻病原的初步筛查,确认必须进一步做培养或分子诊断;ELISA法、荧光免疫法(四联法)与PCR三者间的阳性检出率差异均有统计学意义,ELISA法与PCR检测结果的一致性明显较好.以PCR检测结果作为评估标准,ELISA法对四种腹泻病毒抗原的检测灵敏度、特异性及准确性均优于荧光免疫法,荧光免疫法检测结果的假阳性率较高.     

札如病毒实时荧光RT-PCR的建立与应用

目的 建立一种可快速、全面、准确检测人感染札如病毒的TaqMan探针荧光实时RT-PCR方法。方法 利用Bioedit2.0、MAGE6.0软件对可感染人的GⅠ、GⅡ、GⅣ、GⅤ基因群札如病毒进行保守序列比对,应用Primer6.0、Primer Express 3.0进行引物和TaqMan探针的设计与评价,分别设计了两套引物及TaqMan探针,克隆相应靶基因并构建阳性标准品,建立及优化一步法实时荧光RT-PCR反应体系,并进行灵敏度、特异度、临床标本验证试验。结果 根据基因序列比对分析,札如病毒ORF1与ORF2连接区具有相对高保守序列,针对GⅠ、GⅡ、GⅣ及GⅤ设计了一条共用的下游引物、以及两套上游引物和TaqMan探针,能覆盖当前GenBank可见的感染人的札如病毒基因型,在同一反应管中建立了同时检测札如病毒四个基因群的实时荧光RT-PCR,并可将GⅤ与GⅠ、GⅡ、GⅣ进行初步分型,对人柯萨奇病毒、诺如病毒、轮状病毒、腺病毒等非靶标病原体无扩增,仅对札如病毒有特异扩增,最低检测下限为10拷贝/反应。结论 本研究建立了札如病毒一步法实时荧光RT-PCR反应体系,可将GⅤ与GⅠ、GⅡ、GⅣ区分开来,为腹泻疫情防控和风险评估提供快速、准确的病原学依据。     

液相芯片检测轮状病毒和诺如病毒方法的建立

目的建立一种多重PCR结合液相芯片技术同时检测A型轮状病毒、GI型诺如病毒和GII型诺如病毒的方法。方法建立多重PCR扩增方法,将PCR产物与偶联核酸探针的微球混合物进行杂交,利用Luminex 200液相芯片检测仪来检测杂交结果。对建立的A型轮状病毒、GI型诺如病毒和GII型诺如病毒液相芯片检测方法进行灵敏度、干扰性分析,并应用该方法对68份粪便样品的核酸进行检测。结果灵敏性实验结果表明,该方法对GII型诺如病毒的检测灵敏度较高,检出限为10 pg/PCR;对轮状病毒的检出限为100 pg/PCR;该方法对GI型诺如病毒的检测灵敏度较低,检出限为1 ng/PCR。干扰性实验结果表明,轮状病毒、GI型诺如病毒和GII型诺如病毒的液相芯片检测,当病毒之间的模板量不同时(1∶1、1∶2、2∶1、1∶5、5∶1、1∶10、10∶1、1∶100、100∶1),仍能够准确检测;对68份临床粪便样品的核酸进行检测,检测出A型轮状病毒样品19份,GI型诺如病毒样品1份,GII型诺如病毒样品18份;轮状病毒和GII型诺如病毒混合感染1份,GI和GII型诺如病毒混合感染1份。结论本研究建立的轮状病毒和诺如病毒液相芯片检测方法通...     

上海市浦东新区2012-2013年病毒性腹泻检测情况分析

目的 了解上海市浦东新区2012-2013年间常见病毒性腹泻的病原学特征,为腹泻病的防控提供依据.方法 收集2012-2013年上海市浦东新区14家监测医院腹泻患者的粪便标本,采用实时荧光定量-聚合酶链式反应(real-time PCR)检测轮状病毒、诺如病毒GⅠ型、诺如病毒GⅡ型、星状病毒、扎如病毒和肠腺病毒.结果 共检测粪便样本4 214份.1 255份样本检出至少1种病毒核酸,核酸阳性检出率为29.78％.轮状病毒、诺如病毒GⅠ型、诺如病毒GⅡ型、扎如病毒、星状病毒以及肠腺病毒的检出率分别为7.6％、1.4％、18.6％、1.6％、1.5％和1.1％.各年龄组均有病毒检出,其中年龄最小的为1岁,最大为92岁,分别为感染轮状病毒和诺如病毒.病毒性腹泻感染不存在男女差异,但不同年龄组的病毒性腹泻感染有差异.不同病毒病原的感染存在不同的高峰期,但主要集中在秋冬季.结论 诺如病毒和轮状病毒是浦东地区病毒性腹泻的主要病原.应该加强对病毒性腹泻的监测,尤其是诺如病毒和轮状病毒.     

东莞市病毒性腹泻病原学分析

目的了解东莞市病毒性腹泻的病原学分布情况。方法收集2010年7月至2012年9月东莞市东华医院感染性腹泻患者的粪便样品,采用ELISA方法检测轮状病毒,采用Realtime RT-PCR方法检测诺如病毒,采用RT-PCR方法检测星状病毒,采用Realtime PCR方法检测腺病毒。结果检测粪便样品共224份,诺如病毒、轮状病毒、腺病毒、星状病毒检测阳性率分别为17.9%、11.6%、4.5%,0.4%,总检测阳性率为31.3%。对其中22份轮状病毒阳性样品进行血清分型,结果G血清型中,G1型10株,G2型1株,G3型8株,G9型3株。P血清型中,P6型1株,P8型12株,9株未能分型。40株诺如病毒全部为GⅡ型。1株星状病毒经测序分析为1型。结论东莞市腹泻病毒主要感染3岁以下的婴幼儿,诺如病毒和轮状病毒为主要病原体,轮状病毒的分布呈多样性,以G1型为主。     

婴幼儿腹泻的病毒学检测分析

目的:了解婴幼儿秋冬季腹泻中轮状病毒、星状病毒及肠道腺病毒的感染情况.方法:对2006年10月至2007年3月的182例急性水样腹泻婴幼儿的粪便标本,采用金标快速试剂盒检测轮状病毒抗原;采用酶免疫吸附测定法(EIA)检测星状病毒抗原及肠道腺病毒抗原.结果:182例标本中轮状病毒检出率35.2%(64/182);星状病毒检出率5.5%(10/182),4例合并轮状病毒感染:肠道腺病毒检出率3.3%(6/182),2例合并轮状病毒感染.结论:轮状病毒仍是婴幼儿秋冬季腹泻最主要致病原;星状病毒感染是婴幼儿病毒性腹泻的第二位病因;有混合性病毒感染发生.     

东莞市2010—2016年病毒性腹泻监测及分析

目的 了解东莞市病毒性腹泻的病原体谱构成及流行情况,为东莞市病毒性腹泻防治提供资料依据。方法 2010年7月开始,每周从监测点医院采集感染性腹泻患者的粪便样品,采用 ELISA方法检测轮状病毒抗原,荧光PCR方法检测诺如病毒、腺病毒、星状病毒核酸。结果 2010—2016年共检测粪便样品5 026份,全部检测轮状病毒和诺如病毒,其中600份检测腺病毒和星状病毒。4种病原体的阳性率分别为15.96%(802/5 026)、14.56%(732/5 026)、5%(30/600),1.33%(8/600),总检测阳性率为 30.18%。轮状病毒、诺如GⅡ型病毒、腺病毒、星状病毒发病集中在2岁以下低龄儿童,各病原体2岁以下儿童感染比例分别为69.10%、62.26%、82.14%、71.43%。轮状病毒每年有1个流行高峰,每年12月份至次年1月达高峰。诺如GⅡ型病毒每年有2个流行高峰,3月和8月达高峰。结论 监测的4种病原体中,轮状病毒和诺如病毒为病毒性腹泻的主要病原体,两者的阳性率相近。诺如病毒以GⅡ型为主。轮状病毒、诺如GⅡ型病毒、腺病毒和星状病毒主要感染2岁以下的婴幼儿,轮状病毒和诺如GⅡ型病毒感染有较强的季节性。     

朝阳地区腹泻儿童病毒感染情况分析

目的了解朝阳地区腹泻儿童中轮状病毒、诺如病毒、肠道腺病毒病原体的流行病学特点。方法收集朝阳市第二医院儿科2011年5月-2012年5月因急性腹泻住院的415例患儿（排除细菌性腹泻）,用胶体金法进行轮状病毒、诺如病毒、肠道腺病毒病原体的检测,并对检测阳性的标本进行对比分析。结果单纯的轮状病毒、肠道腺病毒及诺如病毒感染腹泻患儿的年龄中位数,不同性别和不同居住地的检出率相似,P〉0.05表示差异无统计学意义。三种病毒的感染率由高到低分别为轮状病毒、肠道腺病毒、诺如病毒和混合感染,检出率分别为64.8%、26.5%、10.8%、2.2%,P〈0.05,差异有统计学意义。各年龄段的病毒病原体分布中,〈6个月的患儿阳性率较低,6~23个月患儿阳性率增高并达到高峰,〉24个月龄患儿减低。结论朝阳市儿童病毒性腹泻的病原体呈多样性,以轮状病毒最为多见,肠道腺病毒次之,诺如病毒最少,且出现了各种病原体混合感染现象。     

小鼠诺如病毒荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立小鼠诺如病毒(murine norovirus,MNV)实时荧光定量PCR检测方法,为建立MNV规范化检测方法提供依据。方法根据NCBI公布的60个MNV病毒株核酸序列设计特异性引物,构建标准阳性质控品,建立MNV实时荧光定量PCR方法,并进行特异性、灵敏度、重复性及稳定性评价。用该方法对766只送检小鼠的盲肠内容物样品进行检测,初步了解北京地区实验小鼠MNV感染状况。结果成功建立MNV实时荧光定量PCR检测方法,该方法特异性好,与同种属人类诺如病毒(Hu No Vs)、猫杯状病毒(FCV)均无交叉反应,检测灵敏度可达101copies/μL。批内及批间CT值变异系数均小于2%。应用该方法在766份小鼠盲肠内容物样品中检出301份MNV核酸阳性样品,阳性率39.3%。结论建立的MNV实时荧光定量PCR检测方法特异性好,灵敏度高,重复性好,可以用于MNV的快速定量检测。     

朝阳地区腹泻儿童病毒感染情况分析

目的了解朝阳地区腹泻儿童中轮状病毒、诺如病毒、肠道腺病毒病原体的流行病学特点。方法收集朝阳市第二医院儿科2011年5月-2012年5月因急性腹泻住院的415例患儿(排除细菌性腹泻),用胶体金法进行轮状病毒、诺如病毒、肠道腺病毒病原体的检测,并对检测阳性的标本进行对比分析。结果单纯的轮状病毒、肠道腺病毒及诺如病毒感染腹泻患儿的年龄中位数,不同性别和不同居住地的检出率相似,P>0.05表示差异无统计学意义。三种病毒的感染率由高到低分别为轮状病毒、肠道腺病毒、诺如病毒和混合感染,检出率分别为64.8%、26.5%、10.8%、2.2%,P<0.05,差异有统计学意义。各年龄段的病毒病原体分布中,<6个月的患儿阳性率较低,6~23个月患儿阳性率增高并达到高峰,>24个月龄患儿减低。结论朝阳市儿童病毒性腹泻的病原体呈多样性,以轮状病毒最为多见,肠道腺病毒次之,诺如病毒最少,且出现了各种病原体混合感染现象。     

昆明市幼儿病毒性腹泻病原学监测分析

目的 了解云南省昆明市病毒性腹泻的病原谱特征,探索其流行规律,以期为病毒性腹泻患儿临床治疗及制定有针对性的防控措施提供参考.方法 采集2018年1月至2019年12月因腹泻就诊的昆明市5岁以下患儿粪便标本,用实时荧光定量PCR方法进行核酸检测,检测轮状病毒、诺如病毒、腺病毒、星状病毒及札如病毒,并分析各种病毒的流行病学...     

一起病毒性腹泻聚集性事件的调查分析

目的确定1起引起学校聚集性腹泻事件的病原。方法采集接报当日12例腹泻病例的肛拭标本,采用实时荧光定量方法检测诺如病毒、扎如病毒、轮状病毒、星状病毒以及肠道腺病毒,确定病原。对继发病例、生活老师及工作人员的肛拭标本进行确认检测。结果在当日的12份标本中,有2份检出诺如病毒阳性,在继发的38例患者肛拭标本中,又有12例为诺如病毒阳性。结论本次聚集性腹泻事件是由诺如病毒引起的。     

4株蚊媒病毒多重RT-PCR快速检测方法的建立

目的建立登革1、2型病毒、黄热病毒及流行性乙型脑炎病毒的多重RT-PCR快速检测方法。方法参照病毒核酸序列设计多重RT-PCR引物,并检索GenBank国际基因序列数据库初步验证其特异性,随后对Mg2+、dNTP及引物浓度,RT-PCR反应条件进行优化,建立稳定、特异的多重RT-PCR快速检测4株病毒方法 ,并以同属于黄病毒科的登革3型病毒、登革4型病毒及甲病毒属基孔肯亚病毒、辛德毕斯病毒为对照,验证其特异性。结果应用多重RT-PCR反应体系,对引物的相关性实验结果表明引物之间不会因相互干扰而出现假阳性结果 ;采用多重RT-PCR引物对登革1、2型病毒、黄热病毒及流行性乙型脑炎病毒进行扩增,分别获得574、251、879、422 bp片段,与设计相符,而对照病毒组均无非特异性扩增条带。结论实验证明,所建立的多重RT-PCR方法能够快速地检测登革1、2型病毒、黄热病毒及流行性乙型脑炎病毒,为其检测提供了一种方便易行的方法 。     

阿尼昂尼昂病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

目的 建立阿尼昂尼昂病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法.方法 针对阿尼昂尼昂病毒nsP1基因设计特异性引物和探针,以珠海国际旅行卫生保健中心之前构建的MS2病毒样颗粒为标准品,采用一步法建立实时荧光定量RT-PCR检测方法,并对该方法的检测下限、特异性、精密度、抗干扰能力、符合率进行评价.结果 建立的阿尼昂尼昂病毒实...     

牛病毒性腹泻病毒RT-PCR方法的建立及应用

目的建立用于牛源样本中牛病毒性腹泻病毒(BVDV)双重RT-PCR检测方法。方法选择已发表的BVDV 1型和BVDV 2型包含5’UTR区高保守区域基因作为靶基因,分别设计合成引物,建立双重BVDV RT-PCR方法,并对方法的特异性、敏感性、稳定性等进行方法学评价。同时用建立的RT-PCR方法检测了小牛血清、小牛血清去蛋白提取液、脾多肽注射液等41批次牛源性样本和64份牛血浆样本。牛源样本和64份牛临床样本。结果建立的BVDV RT-PCR检测方法与牛副流感病毒III型(BPIV3)、猪瘟病毒(CSFV)、乙型脑炎病毒(JEV)均无交叉反应;检测BVDV 1型和BVDV 2型DNA模板最低浓度分别为每微升8.87×10~2拷贝和6.31×10~2拷贝,BVDV 1型和2型c DNA在-30℃冰箱放置12个月仍可检测出目的条带。应用建立的BVDV RT-PCR方法检测41批次牛源样本和64份牛血浆样本,核酸阳性率分别为14.6%和29.7%。结论建立的BVDV RT-PCR检测方法具有快速、特异、敏感及稳定的特点,可用于牛源样本携带BVDV核酸的检测。