艰难梭菌A毒素受体结合区基因在乳链菌中的表达

目的：在乳链菌内表达艰难梭菌A毒素受体结合区并检测其活性．方法：提取艰难梭菌标准株基因组DNA,扩增编码艰难梭菌毒素A毒素受体结合区的羧基未端基因重复序列（14CDTA）,分别连接到乳链菌表达载体pNBC1000及pNBC2000,转化乳链菌,蛋白电泳及Western—blot检测蛋白定位表达情况．结果：成功构建了14CDTA乳链菌表达载体,并在乳链菌内表达了艰难梭菌受体结合区蛋白,分泌表达的艰难梭菌受体结合区蛋白大小约39．2ku,膜锚定表达的受体结合区蛋白大小约为55．1ku,所表达的蛋白均可与艰难梭菌A毒素多克隆抗体发生免疫印迹反应．结论：表达艰难梭菌受体结合区蛋白的重组乳链菌可以识别艰难梭菌A毒素多克隆抗体,为研制防治艰难梭菌疫苗的口服生态活菌亚单位疫苗奠定了一定基础．     

重组hGM-CSF乳酸链球菌的构建及初步验证

目的 运用基因克隆技术将自行合成的人粒-巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)转化于乳酸链球菌.并筛选获得高表达重组hGM-CSF的乳酸链球菌稳定株.方法 将经过优化适合在乳链菌表达的hGM-CSF基因克隆于含有P59启动子、USP45蛋白信号肽、终止密码子的pNBC1000载体,得到重组质粒pNCSF,然后将pNCSF进一步克隆于穿梭载体pTR1001c,获得乳链菌表达载体pTRCSF,通过电穿孔转化于乳链菌,并通过聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳验证hGM-CSF的表达.结果 获得了重组质粒pNCSF并经酶切鉴定和测序证实.酶切鉴定显示构建乳链菌表达载体pTRCSF及重组hGM-CSF乳链菌成功,蛋白电泳初步验证获得了高表达重组hGM-CSF的乳链菌株LL-CSF.结论 运用基因克隆技术成功构建了重组乳酸链球菌LL-CSF,为进一步研究重组hGM-CSF的生物学特性及评价其潜在临床.应用价值打下了基础.     

PstS1-卡介苗重组疫苗的构建

目的：构建结核分支杆菌分泌蛋白磷酸盐特异转运系统1（PstS1）的重组卡介苗。方法:以结核分支杆菌H37Rv基因组为模板,通过PCR扩增获得PstS1基因序列;将PstS1基因与大肠杆菌-卡介苗穿梭表达质粒PMD31重组,得到S-PMD31重组质粒,对S-PMD31重组质粒进行HindⅢ、BanHⅠ双酶切及测序鉴定,转化大肠杆菌,用IPTG对工程菌株进行诱导表达,并通过电穿孔技术将S-PMD31重组质粒导入卡介苗中构建重组卡介苗。结果：用引物P1、P2对结核分枝杆菌H37R_V基因组进行PCR扩增获得长为1 100 bp的PstS1基因序列,S-PMD31重组质粒的HindⅢ、BanHⅠ双酶切及测序鉴定证实：PstS1基因正确插入载体PMD31中,并能在大肠杆菌中诱导表达。通过质粒提取及PCR扩增表明重组质粒正确导入卡介苗中。结论：成功地构建了PstS1重组卡介苗,预期能提高卡介苗的免疫原性和保护力。     

乳酸乳球菌介导的细粒棘球绦虫重组LL-Eg95疫苗的构建、鉴定及表达

目的 构建乳酸乳球菌(Lactococcus lactis, LL)为载体的细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus, Eg)重组LL-Eg95(rLL-Eg95)疫苗,并研究其表达效率。方法 以pCD-Eg95为模板扩增Eg95基因,采用XbaⅠ和HindⅢ双酶切后插入pMG36e,构建重组质粒pMG36e-Eg95,转化大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞,抽提质粒进行双酶切鉴定;电穿孔转化乳酸乳球菌MG1363株,构建细粒棘球绦虫重组LL-Eg95疫苗,抽提质粒进行PCR鉴定。结果 重组质粒用双酶切鉴定可切出预期大小的片段,以具有罗红霉素抗性的重组LL中抽提的质粒为模板进行PCR可扩增出471 bp的Eg95基因;SDS-PAGE显示重组LL可表达相对分子质量为16.5×10³的Eg95蛋白,表达蛋白约占菌体总蛋白的17%;免疫印迹表明表达蛋白可被细粒棘球蚴感染的鼠血清识别。结论 成功构建了细粒棘球绦虫重组LL-Eg95疫苗,表达的Eg95具有特异的抗原性。     

嗜肺军团菌ip基因的克隆及其原核表达

目的克隆嗜肺军团菌主要免疫原蛋白ip基因,构建重组质粒pET-ip,并在原核系统中表达。方法采用聚合酶链反应(PCR),从嗜肺军团菌基因组DNA中扩增军团菌主要免疫原蛋白ip基因,并将其定向克隆至原核表达载体pET-32a( ),构建原核表达重组质粒pET-ip,经限制性内切酶鉴定、PCR及测序分析后,转化宿主菌大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,产物进行SDS-PAGE电泳、免疫印迹分析鉴定。结果扩增出了792 bp完整的ip基因,构建的原核表达重组质粒pET-ip表达出49 kDa Trx-IP的融合蛋白质,Western-blot证实获得蛋白为所需要的目的蛋白。结论成功构建了军团菌ip基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中得到了高效表达。     

抑制NGF表达的pSUPER-H1 RNAi系统的构建

目的 构建抑制神经生长因子活性的siRNA表达载体。方法构建含有PolⅢ H1启动子的pSUPER-H1质粒，化学合成2对编码短发夹RNA的寡核苷酸序列，各64个碱基。退火、克隆到经BgiⅡ、HindⅢ酶切处理的pSUPER-H1质粒PolⅢ H1启动子下游，获得重组pSUPER-H1质粒。转化感受态大肠杆菌．挑选阳性克隆，抽取重组质粒，EcoRⅠ、Hind Ⅲ双酶切电泳、测序鉴定。结果重组pSUPER-H1质粒成功转化感受态大肠杆菌。经EcoRⅠ、HindⅢ双酶切琼脂糖凝胶电泳分析，表明64个碱基的寡核苷酸成功插入到预计位点，经测序鉴定，表明序列完全一致。结论重组pSUPER-H1载体的成功构建，为进一步研究神经生长因子活性打下基础。同时开展了质粒介导在体内表达siRNA的方法。     

1型人类免疫缺陷病毒tat基因重组分泌型真核表达载体的构建

目的构建人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)tat基因分泌型真核表达载体。方法聚合酶链反应(PCR)法从缺失pol基因的重组HIV-1基因组pNL4-3中扩增tat基因;将PCR获得的tat基因片段和pSecTag2B分泌型真核表达载体分别用Hind III酶切;pSecTag2B载体片段经小牛碱性磷酸酶去磷酸化后,用T4 DNA连接酶将tat基因与pSecTag2B载体片段连接过夜并转化感受态大肠杆菌DH5α,提取阳性克隆质粒进行Hind III酶切鉴定,并利用Nco I酶切鉴定克隆的tat基因反向。最后选取正向tat基因克隆质粒送基因测序。结果 PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶上约320bp位置出现条带,与预期的324bp大小一致;经Hind III和Nco I分别酶切鉴定,获得2个正向克隆;正向克隆经测序,克隆的tat基因序列与Genbank中登记的HIV-1 tat基因100%同源。结论本研究方法可以成功地构建HIV-1 tat基因分泌型真核表达载体。     

大鼠血红素加氧酶-1基因在乳酸乳球菌中的表达

目的:在乳酸乳球菌中表达大鼠血红素加氧酶-1(HO-1)基因。方法:采用RT-PCR技术从大鼠脾总RNA中分离扩增血红素加氧酶HO-1基因,将该基因克隆进pGEM-Teasy质粒中,转化大肠杆菌DH5α提取质粒,鉴定HO-1基因。酶切后与pSEC质粒连接,经电击转化,将重组质粒转入乳酸乳球菌NZ9000中,转化子在含有氯霉素的脑心浸液培养基上培养。用nisin诱导HO-1表达,SDS-PAGE、Westernblot鉴定表达产物,并采用分光光度法测定HO-1活性。结果:表达产物相对分子量约为32kU,表达量约为7.0mg/L,HO-1活性为2.386U/(mg·h)。结论:乳酸乳球菌能够表达具有生物活性的大鼠HO-1。     

血红素加氧酶-1重组乳酸乳球菌灌胃对内毒素诱导大鼠急性肺损伤的作用

目的:利用基因工程原理合成携带血红素加氧酶-1(HO-1)基因的乳酸乳球菌,给正常大鼠灌胃后,观察其对内毒素诱导大鼠急性肺损伤的保护效应。方法:随机将30只健康清洁级SD大鼠分为对照组(LPS组,n=10)、携带HO-1的乳酸乳球菌灌胃组(HO组,n=10,LPS模型建立前24 h灌胃)、拮抗剂组[锌原卟啉(ZnPP)组,n=10,HO灌胃24 h后,LPS模型建立前1 h腹腔注射ZnPP 10μmol/kg];LPS模型建立后4 h取材,比较各组动物支气管灌洗液(BALF)中髓过氧化物酶(MPO)活性、中性粒细胞(PMN)计数、肺组织湿干重比(W/D)、肺组织MPO活性,并在光镜下观察肺组织病理学改变。结果:与LPS组比较,HO组BALF中MPO、PMN计数和肺组织W/D均降低(P<0.05),肺组织病理学损伤减轻;与HO组比较,ZnPP组BALF中MPO、PMN计数和肺组织W/D均升高(P<0.05),肺组织病理学损伤加重;ZnPP组与LPS组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:预先给大鼠用携带HO-1基因的乳酸乳球菌灌胃,可对内毒素诱导急性肺损伤大鼠产生一定的保护作用。     

Non-Fusion and Fusion Expression of β-Galactosidase from Lactobacillus bulgaricus in Lactococcus lactis

Objective To construct four recombinant Lactococcus lactis strains exhibiting high β-galactosidase activity in fusion or non-fusion ways, and to study the influence factors for their protein expression and secretion. Methods The gene fragments encoding β-galactosidase from two strains of Loctobacillus bulgaricus, wch9901 isolated from yogurt and 1.1480 purchased from the Chinese Academy of Sciences, were amplified and inserted into lactococcal expression vector pMG36e. For fusion expression, the open reading frame of the β-galactosidase gene was amplified, while for non-fusion expression, the open reading frame of the β-galactosidase gene was amplified with its native Shine-Dalgarno sequence upstream. The start codon of the β-galactosidase gene partially overlapped with the stop codon of vector origin open reading frame. Then, the recombinant plasmids were transformed into Escherichia coli DH5α and Lactococcus lactis subsp, lactis MG1363 and confirmed by determining β-galactosidase activities. Results The non-fusion expression plasmids showed a significantly higher β-galactosidase activity in transformed strains than the fusion expression plasmids. The highest enzyme activity was observed in Lactococcus lactis transformed with the non-fusion expression plasmids which were inserted into the β-galactosidase gene from Lactobacillus bulgaricus wch9901. The β-galactosidase activity was 2.75 times as high as that of the native counterpart. In addition, β-galactosidase expressed by recombinant plasmids in Lactococcus lactis could be secreted into the culture medium. The highest secretion rate （27.1%） was observed when the culture medium contained 20 g/L of lactose. Conclusion Different properties of the native bacteria may have some effects on the protein expression of recombinant plasmids. Non-fusion expression shows a higher enzyme activity in host bacteria. There may be a host-related weak secretion signal peptide gene within the structure gene of Lb. bulgaricus β-galactosidase, and its translation pr     

小鼠白细胞介素-12基因在乳酸乳球菌中的表达

目的 在乳酸乳球菌中表达小鼠白细胞介素-12基因.方法 用Nsi Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切pGEM-IL-12质粒后,与经同样酶切的含有乳链杆菌肽A(nisA)启动子的pSEC-E7质粒连接,从而构建成pSEC-IL-12质粒;经电击转化,将重组质粒转入乳酸乳球菌NZ9000中,转化子在含有氯霉素的脑心浸液培养基上培养.用乳链杆菌肽(nisin)诱导白细胞介素-12表达,SDS-PAGE、Western blot鉴定表达产物;用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测IL-12的量.结果 建立了白细胞介素-12乳酸菌基因表达系统.在nisin的诱导下,NZ9000能够产生并分泌白细胞介素-12约80 ng/L.结论 乳酸乳球菌能够表达一定数量的小鼠白细胞介素-12.