Wnt信号分子诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化

间充质干细胞可向神经方向转化,但分子机制目前不清楚。 目的：观察Wnt3a和Wnt5a在骨髓间充质干细胞向神经细胞分化过程中的作用。 方法：体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,传代后通过形态学和流式细胞仪检测细胞表面标志物CD14,CD44,CD9,CD34,CD45表达。采用碱性成纤维细胞生长因子分别联合Wnt3a和Wnt5a的诱导方案,免疫组织化学法和RT-PCR检测Wnt3a、Wnt5a在骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化过程中的作用。 结果与结论：骨髓间充质干细胞为长梭形,表面标志物CD9,CD44高表达,CD34,CD45低表达。诱导后细胞Wnt3a诱导组巢蛋白,神经元特异性烯醇化酶呈阳性,而胶质纤维酸性蛋白无明显表达,细胞活力良好。Wnt5a诱导组巢蛋白呈弱阳性表达,而神经元特异性烯醇化酶及胶质纤维酸性蛋白阴性。RT-PCR结果显示Wnt3a诱导组巢蛋白在诱导前后均有表达,神经元特异性烯醇化酶在诱导后5 d可见明显的扩增条带,10 d后更加明显。胶质纤维酸性蛋白在诱导10 d后出现较弱的扩增条带。提示Wnt3a分子能够促进体外培养的间充质干细胞向神经元样细胞分化。     

全反式视黄酸诱导兔骨髓间充质干细胞向神经细胞的分化

背景：目前,在骨髓间充质干细胞体外向神经细胞分化的实验中,较多采用抗氧化剂法和细胞因子法,但诱导效率低。 目的：探讨全反式视黄酸在兔骨髓间充质干细胞向神经细胞分化中的作用。 方法：体外分离培养兔骨髓间充质干细胞,取第4代骨髓间充质干细胞观察细胞形态,实验组用0.4 μmol/L全反式视黄酸预诱导24 h后,改用神经细胞培养基继续培养。神经细胞培养基培养4,8,16及24 h,免疫组织化学检测巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白的表达情况,采用RT-PCR的方法检测巢蛋白和神经元特异性烯醇化酶的表达水平。 结果与结论：骨髓间充质干细胞经培养、传代后,细胞贴壁生长,呈长梭形。免疫组织化学检测结果显示：全反式视黄酸诱导组巢蛋白及神经元特异性烯醇化酶呈阳性,诱导后细胞的活力良好。RT-PCR结果显示全反式视黄酸诱导组巢蛋白在诱导前后均有表达,神经元特异性烯醇化酶在诱导后16 h可见明显的扩增条带,24 h后更加明显。提示全反式视黄酸能够在体外促进兔骨髓间充质干细胞向神经细胞分化。     

Wnt3a促进大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞的分化

背景：Wnt信号通路是细胞增殖分化的关键调控环节,但与骨髓间充质干细胞神经分化的联系并不十分明确。 目的：寻找促进骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的Wnt信号分子。 方法：首先体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞并传代,行形态学观察,并以流式细胞学方法检测细胞表型CD44,CD9,CD34和CD45。采用碱性成纤维细胞生长因子分别联合Wnt3a或Wnt5a的方案诱导分化,应用免疫组化和反转录-聚合酶链反应方法比较Wnt3a和Wnt5a对骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的影响。 结果与结论：骨髓间充质干细胞为长梭形,CD9,CD44高表达,CD34,CD45低表达。Wnt3a诱导组的巢蛋白和神经元特异烯醇化酶呈阳性,而胶质纤维酸性蛋白无明显表达,诱导后细胞的活力良好。Wnt5a诱导组巢蛋白呈弱阳性表达,而神经元特异烯醇化酶及胶质纤维酸性蛋白阴性。反转录-聚合酶链反应结果显示,Wnt3a诱导组巢蛋白在诱导前后均有表达,神经元特异烯醇化酶在诱导后5 d可见明显的扩增条带,10 d后更加明显。胶质纤维酸性蛋白在诱导10 d后出现较弱的扩增条带。Wnt5a组、对照组骨髓间充质干细胞在诱导后10 d巢蛋白有微弱表达,神经元特异烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白几乎无表达。提示Wnt3a分子能够促进体外培养的骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化。     

川芎嗪诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞：最佳诱导剂量筛选☆

背景：目前用于体外诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的诱导剂众多,但多数化学诱导剂具有毒性不适合用于人体。 目的：观察中药川芎嗪对大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的影响,并寻找川芎嗪诱导分化的最佳浓度。 方法：SD大鼠麻醉后无菌条件下取出股骨和胫骨,离心后弃上清液,加入含体积分数为15%胎牛血清的L-DMEM培养基重新悬浮细胞并转入培养瓶培养传代,用免疫细胞化学方法检测第5代骨髓间充质干细胞CD44、CD45的表达;取含1.00,1.25,1.50 g/L 3种剂量盐酸川芎嗪注射液的无血清L-DMEM培养基对体外培养的第5代骨髓间充质干细胞进行诱导。倒置相差显微镜下观察细胞形态变化,免疫细胞化学方法检测已诱导细胞巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白的表达,比较3种剂量盐酸川芎嗪注射液诱导神经元样细胞抗原表达率。 结果与结论：①原代细胞接种3 d后多数细胞贴壁,传代后细胞贴壁速度和增殖更快,第5代基本纯化为骨髓间充质干细胞,细胞呈放射状或漩涡状排列。②第5代骨髓间充质干细胞(98.02±0.81)%CD44表达阳性,CD45表达阴性。③诱导后细胞出现类似神经元细胞样形态;免疫细胞化学方法检测显示多数细胞巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶阳性表达,1.25 g/L浓度组细胞的神经元特异性烯醇化酶阳性表达率最高。提示川芎嗪可诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞,1.25 g/L为最适诱导剂量。     

人骨髓间充质干细胞诱导向多巴胺能神经元的分化

背景：体内外研究发现人骨髓间充质干细胞分化为神经元的比率都明显低于胶质细胞,并且这为数不多的神经元会逐渐死亡,而最终存活的细胞中神经元的数量更少。 目的：观察人骨髓间充质干细胞体外诱导分化为多巴胺能神经元的潜能。 方法：分离纯化和扩增人骨髓间充质干细胞,在体外先用碱性成纤维细胞生长因子和表皮细胞生长因子进行预诱导后,以胶质细胞源性神经营养因子和血管紧张素Ⅱ联合诱导人骨髓间充质干细胞向神经元和多巴胺能神经元分化。观察分化过程中细胞的形态变化,利用免疫组织化学检测神经元和多巴胺能神经元特异性标志物的表达情况。 结果与结论：人骨髓间充质干细胞经诱导后的细胞呈现双极、多极和锥形的典型神经元细胞的形态,明显表达抗人神经巢蛋白[(55.7±4.3)%]和神经元特异性烯醇化酶[(78.2±6.7)%],而且大部分人骨髓间充质干细胞表达酪氨酸羟化酶[(48.5±5.6)%],不表达神经胶质细胞标记物胶质纤维酸性蛋白。提示在适宜的条件下,人骨髓间充质干细胞可分化成神经元和多巴胺能神经元样细胞。     

血府逐瘀注射液诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的最佳剂量筛选

背景：目前大量研究证明传统中药可以诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞。 目的：观察中药血府逐瘀注射液对大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的影响,并寻找血府逐瘀注射液诱导分化的最佳浓度。 设计,时间及地点：细胞对照观察实验。实验于2009-07/2010-04在 广东医学院附属医院神经病学研究室及中心实验室完成。 材料： 4周龄SPF级SD雄大鼠,体质量约100g;血府逐瘀注射液的主要中药成分为红花、赤芍、川芎、丹参、当归。 方法：SD大鼠麻醉后无菌条件下取出股骨和胫骨,离心后弃上清液,加入含体积分数为15%胎牛血清的L-DMEM培养基重新悬浮细胞并转入培养瓶培养传代,用免疫细胞化学方法检测第5代骨髓间充质干细胞CD44、CD45的表达;取含1.00,3.00,5.00,10.00 g/L 4种剂量血府逐瘀注射液的无血清L-DMEM培养基对体外培养的第5代骨髓间充质干细胞进行诱导。倒置相差显微镜下观察细胞形态变化,免疫细胞化学方法检测已诱导细胞巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白的表达,比较4种剂量血府逐瘀注射液诱导神经元样细胞抗原表达率。 主要观察指标：骨髓MSCs生长情况和形态观察,骨髓MSCs表面标志物的表达情况及诱导分化后神经细胞特异性标志物的表达。 结果与结论：①原代细胞接种3 d后多数细胞贴壁,传代后细胞贴壁速度和增殖更快,第5代基本纯化为骨髓间充质干细胞,细胞呈放射状或漩涡状排列。②第5代骨髓间充质干细胞(96.18±1.65)% CD44表达阳性,CD45表达阴性。③诱导后细胞出现类似神经元细胞样形态;免疫细胞化学方法检测显示多数细胞巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶阳性表达,3.00 g/L浓度组细胞的巢蛋白和神经元特异性烯醇化酶阳性表达率最高。提示血府逐瘀注射液可诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞,3.00 g/L为最适诱导浓度。     

体外培养大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化：Wnt3a信号分子的诱导作用**★

背景：Wnt信号通路是细胞增殖分化的关键调控环节。已有证据显示此通路参与了对神经前体细胞增殖、分化以及决定细胞命运的调控。目前有关Wnt信号通路对间充质干细胞向神经元样细胞分化的作用还少见报道。 目的：寻找促进间充质干细胞向神经元样细胞分化的Wnt信号分子。 方法：采用密度梯度离心法在体外分离培养SD大鼠股骨间充质干细胞并培养。传代后通过形态学和流式细胞学检测细胞表面标志物CD29、CD44、CD34、CD45,筛选并鉴定培养细胞。采用神经营养因子碱性成纤维细胞生长因子分别联合Wnt3a和Wnt5a诱导方案，通过免疫组化和RT-PCR的方法比较Wnt3a、Wnt5a在间充质干细胞向神经元样细胞分化过程中的作用，以碱性成纤维细胞生长因子单独培养为对照。 结果与结论：间充质干细胞经培养、传代后，细胞贴壁生长，形态均一，呈长梭形，流式细胞学检测细胞表面标志物CD29、CD44高表达, CD34、CD45低表达。Wnt3a诱导后细胞巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶呈阳性，胶质纤维酸性蛋白无明显表达，诱导后细胞的活力良好；Wnt5a诱导组及对照组巢蛋白呈弱阳性表达，神经元特异性烯醇化酶及胶质纤维酸性蛋白阴性。RT-PCR结果显示，Wnt3a诱导组巢蛋白在诱导前后均有表达，神经元特异性烯醇化酶在诱导后5 d可见明显的扩增条带，10 d后更加明显；胶质纤维酸性蛋白在诱导10 d后有比较弱的扩增条带出现。结果说明Wnt3a分子能够促进体外培养的间充质干细胞向神经元样细胞分化。     

不同来源人羊膜间充质干细胞的混合培养

背景：人羊膜间充质干细胞可诱导分化为神经样细胞,但在培养过程中发现干细胞增殖的数量不足。 目的：为了获得足够数量的人羊膜间充质干细胞,观察人羊膜间充质干细胞混合培养的生长情况及经碱性成纤维细胞生长因子诱导人羊膜间充质干细胞向神经样细胞的分化情况。 方法：将两个不同胎盘来源的羊膜分离培养、混合,采用细胞分离和培养技术获取人羊膜间充质干细胞,分离人羊膜间充质干细胞后传代培养,加入碱性成纤维细胞生长因子诱导分化。当细胞传至第3代时,随机取培养的6份人羊膜间充质干细胞(半量)为A组,6份人羊膜间充质干细胞(半量)为B组,将A、B组各剩余的半量人羊膜间充质干细胞混合为C组。3组细胞浓度均为1.0×107 L-1。以活细胞计数和MTT比色法比较3组细胞扩增数量,以免疫组织化学法检测羊膜间充质干细胞神经胶质细胞标志物、神经元特异性烯醇化酶和巢蛋白的表达。 结果与结论：混合人羊膜间充质干细胞之间有互相促增殖的作用。人羊膜间充质干细胞具有较强的可朔性,经碱性成纤维细胞生长因子诱导的人羊膜间充质干细胞可表达神经胶质细胞标志物、神经元特异性烯醇化酶和巢蛋白。     

体外大鼠骨髓间充质干细胞多向分化潜能的研究

目的研究体外大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞等不同组织细胞多向分化的潜能。方法从SD大鼠股骨骨髓中获得间充质干细胞,原代培养后1∶2传代,传至第5代后分为普通传代培养组、神经细胞诱导组、成骨细胞诱导组和脂肪细胞诱导组。倒置相差显微镜下观察各组细胞生长情况、形态变化以及矿化结节和脂肪细胞的形成;流式细胞检测第5代大鼠骨髓间充质干细胞表面抗原CD29、CD44、CD90、CD31、CD34、CD45;免疫组织化学检测普通传代培养组和神经细胞诱导组细胞巢蛋白、微管相关蛋白-2、胶质纤维酸性蛋白和神经元特异性烯醇化酶等神经细胞相关蛋白的表达情况。结果大鼠骨髓间充质干细胞呈贴壁生长,细胞扩增至第5代时形态趋于一致,呈梭形。大鼠骨髓间充质干细胞表面抗原CD29(99.83%)、CD44(99.77%)、CD90(99.86%)均呈阳性表达,CD31(0.83%)、CD34(1.78%)、CD45(2.90%)无表达。在体外,普通传代培养细胞仅巢蛋白呈阳性表达;由神经细胞诱导的细胞巢蛋白、微管相关蛋白-2、胶质纤维酸性蛋白和神经元特异性烯醇化酶均呈阳性表达,且形态类似神经细胞;由成骨细胞诱导的细胞质内可见矿化结节形成;由脂肪细胞诱导的细胞质内出现多个猩红色呈簇状的脂肪滴。结论大鼠骨髓间充质干细胞易于提取、纯化和扩增,可于体外自发表达神经干细胞标志蛋白,并可通过诱导向神经细胞、成骨细胞及脂肪细胞分化。提示骨髓间充质干细胞不仅具有多向分化潜能,而且可能具有自发向神经干细胞分化的特性。     

无血清培养条件诱导人脐血间充质干细胞向神经细胞的分化

于2005-06/2007-09在南昌大学第二附属医院江西省分子医学重点实验室拟建立一种在无血清培养条件下诱导脐血间充质干细胞向神经细胞分化的方法。所用无血清培养基血清替代物是将纯化人转铁蛋白直接溶于DMEM培养基中,再将去毒后的BSA、超声波粉碎后的胆固醇、胰岛素及过氧化氢酶直接加入DMEM培养基中稀释至所需浓度。体外分离的脐血单个核细胞以1×109 L-1接种,加入含氢化可的松、纤维连接蛋白的无血清培养基,7 d后消化传代。取传至2,5,8代的脐血间充质干细胞,达60%~70%融合时以含β-巯基乙醇、丁化羟基苯甲醚的无血清培养基诱导其向神经细胞分化。结果在无血清条件下能培养扩增出大量脐血间充质干细胞,融合后可继续传代扩增;不表达CD34、CD13和CD45,强表达CD166、CD29、CD105,较强表达CD54,80%以上细胞处于G0/G1期;脐血间充质干细胞经诱导后,能形成具有典型神经元形态的神经细胞,神经元特异性烯醇化酶、神经丝蛋白、神经胶质元纤维酸性蛋白均呈阳性表达。提示在自行研制的无血清培养条件下可成功诱导脐血间充质干细胞向神经细胞分化。     

人脐带间充质干细胞体外扩增和向神经元样细胞定向诱导分化的研究

目的探讨人脐带间充质干细胞(MSCs)的体外分离、纯化、扩增和向神经元样细胞的定向诱导分化,以期为脐带MSCs的神经移植提供理论依据。方法无菌条件下收集剖宫产新生儿脐带,酶消化法获取MSCs,进行培养。用流式细胞仪检测MSCs的表面标志。取扩增3,5,10代的MSCs分别向神经元样细胞诱导,用免疫组化和RT-PCR法检测神经元样细胞特异性标志。结果脐带富含MSCs,且脐带MSCs(UCMSCs)强表达CD13、29、CD44、CD105,弱表达CD106,不表达CD34、CD11a、CD14、CD33、CD45。神经条件培养基诱导后的细胞平均有70%左右呈现典型的神经元样表型。免疫组化法检测发现不同代数的MSCs经诱导后均表达nestin,NSE,NeuN,NF-M,弱表达GFAP。RT-PCR显示诱导后NSEmRNA表达增加。结论MSCs存在于人脐带中,并且在体外有较强的增殖能力,特定条件下能够分化为神经元样细胞。     

川芎嗪联合创伤性脑组织匀浆液诱导骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化

背景：川芎嗪和创伤性脑组织匀浆液均可诱导骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化。 目的：探讨川芎嗪与创伤性脑组织匀浆液诱导骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化的联合效应。 方法：分离培养Wistar大鼠骨髓间充质干细胞后分为4组,加入不同的诱导培养基分别干预：空白对照组、川芎嗪诱导组、创伤性脑匀浆液诱导组和川芎嗪联合创伤性脑匀浆液诱导组。诱导后采用倒差显微镜观察细胞形态变化,并统计不同时段四组细胞分化率。分别取部分细胞进行神经元特异性烯醇化酶染色,胶质纤维酸性蛋白免疫细胞化学与免疫荧光细胞化学双标检测。 结果与结论：川芎嗪及受损大鼠脑匀浆液上清液可诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化,随诱导时间的延长,诱导分化率越高,具有较重要的应用价值,而神经元特异性烯醇化酶与胶质纤维酸性蛋白在其分化信号中起重要作用。     

依达拉奉体外定向诱导人间充质干细胞向神经元样细胞的分化

背景：依达拉奉作为新型氧自由基清除剂,一般用于抑制脂质过氧化反应,减轻脑水肿,保护神经细胞。 目的：观察依达拉奉体外定向诱导人骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的可行性。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2007-12/2008-09广东医学院附属医院中心实验室完成。 材料：骨髓来源于创伤所致闭合性股骨骨折的成年患者,由广东医学院附属医院骨科提供。依达拉奉由南京先声药业生产,批号P2007123144254453。 方法：无菌抽取的骨髓经肝素化后,采用密度梯度离心法及贴壁筛选法分离获得人骨髓间充质干细胞,传至第5代按1× 108 L-1接种于6孔板内,设立2组,依达拉奉组细胞达50%融合时用含碱性成纤维生长因子、胎牛血清的L-DMEM预诱导24 h,PBS洗涤后再用20 mg/L依达拉奉无血清L-DMEM诱导24 h;空白对照组始终用含体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM培养,不加任何预诱导剂和诱导剂。 主要观察指标：诱导分化后细胞形态变化,SP法免疫细胞化学鉴定神经元烯醇化酶、巢蛋白、胶质纤维酸性蛋白及微管相关蛋白2的表达。 结果：体外诱导1 h后,依达拉奉组胞体收缩,2 h后形成较长突起,5 h后呈典型神经元样细胞;空白对照组细胞仍呈对称的梭形,无突起形成。免疫组化结果显示,诱导6 h后依达拉奉组神经元样细胞的胞体及部分突起呈棕黄色,强表达神经元烯醇化酶,弱表达胶质纤维酸性蛋白和巢蛋白,不表达微管相关蛋白2;空白对照组上述4种特异性抗原均呈阴性表达。 结论：人骨髓间充质干细胞经依达拉奉体外诱导后,所分化的细胞具有神经元表型,但还不够成熟,处于向成熟神经元分化的中间阶段。     

Umbilical cord-derived mesenchymal stem cells retain immunomodulatory and anti-oxidative activities after neural induction

The immunomodulatory and anti-oxidative activities of differentiated mesenchymal stem cells contribute to their therapeutic efficacy in cell-replacement therapy. Mesenchymal stem cells were isolated from human umbilical cord and induced to differentiate with basic fibroblast growth factor, nerve growth factor, epidermal growth factor, brain-derived neurotrophic factor and forskolin. The mesenchymal stem cells became rounded with long processes and expressed the neural markers, Tuj1, neurofilament 200, microtubule-associated protein-2 and neuron-specific enolase. Nestin expression was significantly reduced after neural induction. The expression of immunoregulatory and anti-oxidative genes was largely unchanged prior to and after neural induction in mesenchymal stem cells. There was no significant difference in the effects of control and induced mesenchymal stem cells on lymphocyte proliferation in co-culture experiments. However, the expression of human leukocyte antigen-G decreased significantly in induced neuron-like cells. These results suggest that growth factor-based methods enable the differentiation of mesenchymal stem cell toward immature neuronal-like cells, which retain their immunomodulatory and anti-oxidative activities.     

人脐血间充质干细胞向类肝细胞分化*

背景：研究表明共培养条件下,骨髓间充质干细胞可向心肌细胞、肝样细胞等方向分化。 目的：探讨人脐血间充质干细胞与人肝细胞在体外共培养条件下,诱导人脐血间充质干细胞分化为类肝细胞的可行性。 方法：无菌条件下采集新生儿脐带血,采用密度梯度离心法与贴壁法分离纯化脐血间充质干细胞,待细胞融合至80%时胰蛋白酶消化传代。应用具有微孔滤膜的插入式细胞培养皿和培养板构建人脐血间充质干细胞-肝细胞共培养模型,脐血间充质干细胞按1×107 L-1密度接种于下层6孔板内,LO2人肝细胞按1×105 L-1密度接种到上层插入式培养皿中。以上、下两层均接种人脐血间充质干细胞作为对照组。采用流式细胞仪检测贴壁细胞的表面标志,倒置相差显微镜观察共培养后细胞形态变化,RT-PCR法检测肝细胞表面抗原mRNA的表达。 结果与结论：贴壁细胞呈长梭形,强表达CD44和CD29,不表达造血细胞表型CD34和CD45。共培养组5 d时长梭形细胞数量减少,随共培养时间的延长,不规则圆形或多角形的细胞逐渐增多,与肝细胞形态相似;对照组培养4周时,人脐血间充质干细胞仍呈形态均一的长梭形。共培养组5 d时甲胎蛋白mRNA呈阳性表达,其余均为阴性;14 d时细胞角蛋白19 mRNA、白蛋白mRNA开始表达,随着时间延长有增强趋势,甲胎蛋白mRNA表达则较前减弱;对照组各抗原的表达均呈阴性。提示与LO2人肝细胞共培养后,人脐血间充质干细胞可诱导分化为类肝细胞。