重组新型人角质细胞生长因子异构体抗肝纤维化实验研究

角质细胞生长因子(KGF)是皮肤表层的细胞因子，已证明有二种类型即KGF-Ⅰ和KGF-Ⅱ。能促进角质细胞增生、保护黏膜细胞和肝细胞。重组新型人角质细胞生长因子变构体K102经基因工程改造而成，由大肠杆菌重组表达和制备，能抑制成纤维细胞增殖和分化，而天然KGF不具备此作用。实验目的在于评价K102对实验性肝纤维化的预防和逆转治疗作用。     

角质细胞生长因子抗大鼠肝纤维化的实验研究

角质细胞生长因子（KGF）是具有肝素结合特性、并能调节皮肤表皮角质细胞增殖和分化的功能蛋白，属于成纤维细胞生长因子家族，正常人体中有KGF-Ⅰ和KGF-Ⅱ。本实验所用新型人角质细胞生长因子是KGF-Ⅰ型经基因工程改造，应用大肠杆菌重组表达技术制备而成。本实验拟用新型KGF预防大鼠肝纤维化，为临床治疗肝硬化寻求更好的方法。     

抗Fas单克隆抗体诱导人胃癌细胞系SGC-7901细胞

目的探讨抗Ｆａｓ单克隆抗体诱导胃癌细胞凋亡的规律及在胃癌治疗中的意义．方法应用细胞形态观察、琼脂糖凝胶电泳、流式细胞光度术检测抗Ｆａｓ单克隆抗体对胃癌细胞ＳＧＣ７９０１增殖周期的影响以及对细胞杀伤作用的方式,并检测了ＳＧＣ７９０１细胞表面Ｂｃｌ２的表达情况．．结果抗Ｆａｓ单克隆抗体有阻滞细胞周期、通过诱发凋亡而抑制肿瘤细胞生长的作用．经抗Ｆａｓ单克隆抗体处理后,ＳＧＣ７９０１细胞表面Ｂｃｌ２蛋白表达无明显变化．．结论抗Ｆａｓ单克隆抗体可以诱导胃癌细胞系ＳＧＣ７９０１细胞凋亡．抗Ｆａｓ单克隆抗体诱导胃癌细胞凋亡与Ｂｃｌ２表达无关     

人肝细胞生长因子基因腺病毒重组体的构建及转染血管平滑肌细胞的表达

为探讨构建能表达肝细胞生长因子基因的腺病毒重组体的方法，以及这种腺病毒重组体能否在血管平滑肌细胞表达。将含有肝细胞生长因子基因片段的质粒用限制内切酶酶切，以琼脂糖凝胶电泳回收得到目的基因片段：将它用DNA连接酶插入至腺病毒穿梭质粒中，并用限制内切酶鉴别插入方向，得到插入方向正确的重组腺病毒穿梭质粒。用限制内切酶酶切重组腺病毒穿梭质粒和表达载体，使它们线性化；以电转化方法使它们共转化至BJ5183细胞中进行同源重组，构成肝细胞生长因子基因腺病毒重组体。以脂质体为转染介质，将肝细胞生长因子基因腺病毒重组体转染到人胚肾细胞中进行包装，使病毒复性具有感染能力。用包装后的肝细胞生长因子基因腺病毒重组体感染体外培养的大鼠主动脉平滑肌细胞；经逆转录一聚合酶链反应和蛋白印迹检测发现肝细胞生长因子呈现过表达。此外，酶切及测序发现重组腺病毒穿梭质粒和肝细胞生长因子基因腺病毒重组体是正确的；绿色荧光蛋白标记对重组体在人胚肾细胞中的包装及包装后感染大鼠主动脉平滑肌细胞进行了荧光示踪。结果提示，肝细胞生长因子基因腺病毒重组体构建成功，为血管疾病转基因治疗奠定了基础，具有一定临床价值，     

抗Fas单克隆抗体诱导人胃癌细胞系SGC-7901细胞凋亡

目的探讨抗Fas单克隆抗体诱导胃癌细胞凋亡的规律及在胃癌治疗中的意义.方法应用细胞形态观察、琼脂糖凝胶电泳、流式细胞光度术检测抗Fas 单克隆抗体对胃癌细胞SGC-7901增殖周期的影响以及对细胞杀伤作用的方式,并检测了SGC -7901细胞表面Bcl-2的表达情况..结果抗Fas单克隆抗体有阻滞细胞周期、通过诱发凋亡而抑制肿瘤细胞生长的作用. 经抗Fas单克隆抗体处理后,SGC-7901细胞表面Bcl-2蛋白表达无明显变化. .结论抗Fas单克隆抗体可以诱导胃癌细胞系SGC-7901细胞凋亡. 抗Fas单克隆抗体诱导胃癌细胞凋亡与Bcl-2表达无关.     

表皮角质细胞与血管内皮细胞共培养对血管内皮生长因子水平的影响

目的探讨人表皮角质细胞与血管内皮细胞共同培养对血管内皮生长因子(VEGF)作用的机制。方法购制人表皮角质细胞和血管内皮细胞进行体外培养,采用双腔通透性测定试剂盒建立细胞共培养模型,应用浓度为15 ng/ml的重组人血管内皮生长因子(VEGF)121和VEGF165作为对照组。利用荧光酶标仪测定不同时间段FITC-dextran量变化,观察血管内皮细胞单层通透性的改变。采用Griess法测定血管内皮细胞产生氧化氮(NO)的变化。结果共培养模型中,血管内皮细胞、表皮角质细胞生长良好,以连续单层形式存在;内池中VEGF121水平在5、30 min、1、2、3、4、5、6 h显著高于VEGF165(P0.05);在0、1、5、10 min,共培养模型内池中NO的含量低于VEGF121刺激组(P0.05),但高于VEGF165刺激组(P0.05)。结论 (1)表皮角质细胞分泌VEGF有时间依赖性,其中VEGF121含量较VEGF偏多。(2)表皮角质细胞分泌物可诱导NO产生,其能力介于VEGF121和VEGF165,因此考虑表皮角质细胞分泌物中引起NO产生增加的主要成分为VEGF。(3)表皮角质细胞分泌物可引起血管内皮通透性增加,其能力介于VEGF121和VEGF165,且数值接近于VEGF121,因此考虑表皮角质细胞分泌物中VEGF121较VEGF165含量高,且VEGF121较VEGF165引起血管通透性能力强。     

抗胰岛素样生长因子-Ⅱ单克隆抗体对胃癌细胞株BGC-823的抑制作用

目的探讨抗胰岛素样生长因子-Ⅱ（IGF-Ⅱ）单克隆抗体（单抗）对胃癌细胞株BGC-823的抑制作用。方法在体外培养人胃癌细胞株BGC-823,实验组分别加入抗IGF-Ⅱ单抗5、10、20μg/ml作用24、48 h,对照组加入二甲基亚砜,用噻唑蓝法检测两组细胞生长抑制情况;在显微镜、透射电镜下观察细胞形态和超微结构,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果不同浓度及作用时间抗IGF-Ⅱ单抗对BGC-823细胞的抑制作用各异,显微镜及电镜下可见细胞凋亡现象。与对照组比较,实验组细胞培养24、48 h时的吸光度值及细胞凋亡率均有统计学差异（P〈0.05或〈0.01）。结论抗IGF-Ⅱ单抗对胃癌BGC-823细胞有明显抑制作用,且呈一定的剂量、时间依赖性。     

表皮生长因子受体单克隆抗体抗人结肠癌LST174的作用

结肠癌在我国不断增多,其晚期治疗仍极困难。我们探讨表皮生长因子受体单克隆抗体(EGFRmAb)抗人结肠癌作用的实验研究,为探索肿瘤治疗提供新途径。     

鼠抗人醛脱氢酶1A1单克隆抗体的制备与鉴定

醛脱氢酶1A1（ALDH1A1）是醛脱氢酶家族的成员之一，以同源四聚体的形式存在，定位于细胞质，在肝脏、胰腺、生殖器和皮肤成纤维细胞中高表达。ALDH1A1具有视网膜脱氢酶、醛脱氢酶（NAD）、氧化还原酶活性，参与体内多种醛类代谢，氧化不同的脂肪族醛和芳香族醛变成相对应的羧基酸，并具有电子传递及药物解毒的功能。目前市售的抗ALDH1A1抗体均为多克隆抗体，我们在成人抗肝脏胞质蛋白单克隆抗体（mAbs）库的建立过程中，应用细胞质总蛋白免疫BALB／c小鼠得到多株mAbs，其中1株经鉴定确认为鼠抗人ALDH1A1单克隆抗体，并对其特异性进行了鉴定，为进一步研究ALDH1A1的功能提供了特异性检测工具。[第一段]     

重组人表皮生长因子用于治疗糖尿病足溃疡疗效观察

将26例DF溃疡随机分为两组，观察组13例、对照组13例。观察组用重组人表皮生长因子换药。对照组创面外科清创后，用1％碘伏湿敷。结果：有效率，观察组92．3％，对照组53．8％。观察组疗效明显优于对照组，差异具有显著性（P〈0．05）。结论：应用重组人表皮生长因子治疗DF溃疡效果良好。     

羊布鲁杆菌M5-90 BP26抗原单克隆抗体的制备及鉴定

目的 制备高亲和性的羊布鲁杆菌M5-90 BP26抗原单克隆抗体,并对抗体进行鉴定.方法 将质粒pET-28a-BP26转化感受态大肠埃希菌(E.coli)BL21 (DE3),构建原核表达质粒pET-28a-BP26,用镍离子金属螯合亲和层析法(Ni-NTA)纯化、重组BP26蛋白(rBP26).将纯化后的rBP26蛋白与弗氏完全佐剂等体积混合成乳化抗原,接每只100 μg/0.1 ml在BALB/c小鼠皮下多点注射进行初次免疫;2周后,按每只50μg/0.1ml 在小鼠皮下多点注射进行再次免疫.再次免疫后2周,小鼠尾静脉取血测效价,检测免疫效果;在细胞融合前3天,将乳化抗原按每只小鼠50μg腹腔注射加强免疫.将小鼠骨髓瘤SP2/0细胞与脾细胞按1∶5比例在聚乙二醇( PEG) 1450作用下进行细胞融合,置于37℃、5％CO2培养箱中培养;10 d后取细胞培养上清液,用间接酶联免疫吸附法(ELISA)测定,筛选分泌抗rBP26抗体的杂交瘤细胞;再经过反复3次克隆,筛选出单克隆全阳性的杂交瘤细胞建株,用杂交瘤细胞株制备BP26抗原单克隆抗体,并以初始杂交瘤细胞克隆导命名.利用羊布鲁杆菌M5 -90疫苗株制备膜蛋白提取物(NMP),采用免疫印迹法(Western)及斑点间接酶联免疫吸附法(Dot-ELISA)对筛选的单克隆抗体进行免疫学特性鉴定,用单克隆抗体亚型试剂盒进行抗体分型和Kappa (κ)和Lambda(λ)轻链鉴定.结果 成功地获得2株能稳定分泌抗rBP26抗原的高亲和性杂交瘤3C3和5A5单克隆抗体,并能与羊布鲁杆菌M5-90疫苗株上的NMP结合,构建成M5-90 BP26抗原单克隆抗体,抗体亚型分别为IgG1和IgG2b,轻链均为κ链.结论 鉴定结果表明,成功制备2株羊布鲁杆菌BP26抗原的高亲和性单克隆抗体,抗体具有识别M5-90疫苗株的膜蛋白构象表位的能力,优势表位的识别可为羊布鲁杆菌M5-90疫苗株的改造提供实验依据.     

Expression of keratinocyte growth factor and its receptor in adaptive changes of ileorectal pouch mucosa

Objective: Total proctocolectomy with formation of an ileo-anal pouch is a well-established surgical procedure for patients with ulcerative colitis (UC) or familiar adenomatous polyposis (FAP). The pouch mucosa undergoes adaptive changes, with inflammation of the ileal reservoir being the most common complication. The aetiology is unknown. The keratinocyte growth factor (KGF) has not only been shown to promote intestinal wound healing and re-epithelialization but also to have some immunomodulatory properties. This study was designed to investigate a putative involvement of KGF in observed histomorphological changes in the pouch mucosa. Material and methods. Multiple biopsies were obtained from age-matched and sex-matched patients. Biopsies were stained with H&E and scored for inflammation and morphological changes. mRNA expression levels of KGF and KGF-receptor (KGFR) were determined using competitive RT-PCR, protein expression and phosphorylation was analyzed by Western blotting. KGF and KGFR were localized in tissue samples by immunohistochemistry. Results. Expression of KGF and KGFR was significantly increased in inflamed and adapting mucosa. Patterns of expression did not significantly differ in pouch mucosa from UC or FAP patients. Protein expression correlated with the mRNA results and KGFR was shown to be activated in adapting pouch mucosa. KGF was detected on subepithelial cells, mainly on fibroblasts, whereas expression of KGFR was restricted to epithelial cells. Conclusion. Expression of KGF and KGFR is significantly increased in the pouch mucosa, suggesting an involvement of this growth factor in tissue repair and adaptive changes. Topical application of KGF might alleviate the inflammatory and promote the adaptive process in the ileo-anal pouch mucosa.     

2株重组弓形虫P30抗原单克隆抗体的制备和鉴定

目的制备重组P30抗原单克隆抗体,研究其生物活性。方法重组质粒pET28b-P30经BL21（DE3）表达,纯化、复性后免疫BALB/c小鼠,运用杂交瘤技术制备单克隆抗体。ELISA筛选阳性克隆,经亚克隆建株。体内诱生腹水法制备抗体,测定其亚类、效价,Western blot分析其特异性,双单抗夹心-ELISA测定其敏感度。双单抗夹心-ELISA法检测弓形虫感染鼠血清中的CAg。结果筛选出2株抗重组P30的单克隆抗体9D7、2H9,抗体重链分别为IgG2a、IgG1,轻链均为κ链,Western blot显示2株单抗均能识别弓形虫速殖体天然P30抗原。双单抗夹心-ELISA检测抗原量为0.5μg/ml;同法检测鼠血清中的CAg,感染第4、6、8 d的阳性率分别为20%、60%、60%。结论制备的P30抗原单克隆抗体具有较高的敏感性和特异性,为其应用研究打下了基础。     

KGF对人卵巢癌CAOV3细胞增殖及其ERK活性的影响

目的观察角质细胞生长因子（KGF）对人卵巢癌CAOV3细胞增殖及其细胞外调节信号激酶（ERK）活性的影响。方法体外培养CAOV3细胞,MTT比色法测定不同浓度KGF对该细胞增殖的影响;免疫沉淀法纯化蛋白,ERK1／2试剂盒测定ERK活性;Western—Blot测定ERK蛋白（p-ERK）。结果KGF能显著促进CAOV3细胞增殖,增强其ERK活性及p-ERK表达。结论KGF可以促使人卵巢癌CAOV3细胞的增殖,其机制与增强ERK活性及p-ERK表达有关。     

抗旋毛虫成虫单克隆抗体的制备和保护性免疫的初步研究

目的：获得抗旋毛虫成虫的单克隆抗体（单抗）并初步研究其保护性免疫作用，方法：利用杂交瘤技术，用旋毛虫抗原免疫的Balb/c小鼠脾细胞与小鼠骨瘤细胞SP2／0进行细胞融合。用免疫双扩散鉴定单抗亚类，免疫印迹鉴定单抗的特异性。小鼠尾静脉接种单抗进行被动免疫保护实验。结果：建立了1株稳定分泌抗旋毛虫成虫单抗的细胞株，杂交瘤细胞培养上清液效价为1：6400，诱生腹水ELISA效价达1：204800，经鉴定单克隆抗体类型为IgM,可以识别旋毛虫成虫，肌幼虫及新生幼虫，相对分子质量约为40000蛋白，并且不与猪蛔虫，血吸虫，包虫，囊虫抗原发生交叉反应。单抗被动免疫后的减虫率为55．63％，结论：获得1株具种特异性，保护性的单克隆抗体，为筛选能诱导保护性免疫功能的旋毛虫抗原分子提供了有力的工具。     

Analysis of the cellular basis of keratinocyte growth factor overexpression in inflammatory bowel disease

BACKGROUND: Keratinocyte growth factor (KGF) stimulates gastrointestinal epithelial cells in vivo, and is protective against gastrointestinal injury and colitis. Endogenous KGF is increased in inflammatory bowel disease (IBD), and may be an important mediator of mucosal repair. KGF is expressed by mesenchymal cells and activated intraepithelial lymphocytes (IEL). AIMS: To investigate the relative contributions of these cellular sources of KGF expression in IBD. METHODS: IELs and lamina propria lymphocytes (LPL) were isolated from inflamed and uninflamed IBD tissues. mRNA expression was determined by ribonuclease protection assay. In situ hybridisation was combined with immunohistochemistry to determine whether KGF mRNA was expressed by specific cell types in vivo. RESULTS: Low levels of KGF mRNA expression were detected in three of five IEL samples derived from inflamed tissue, but not in two IEL samples from uninflamed tissue. No KGF expression was detected in LPLs from either inflamed or uninflamed tissue. In contrast, KGF was expressed by primary cultures of human intestinal fibroblasts, and was induced by treatment with interleukin 1. CONCLUSIONS: The major source of KGF expression in IBD was lamina propria cells of non-immune origin, most likely fibroblasts and/or smooth muscle cells. Compared with these cell types, relatively little KGF synthesis was associated with IELs in inflamed IBD tissue.