黄芩和鱼腥草水煎液对肺炎克雷伯菌的抑菌作用研究

目的研究黄芩和鱼腥草两种中药水煎液对肺炎克雷伯菌(KP)被膜生成的体外抑制作用。方法采用银染法鉴定细菌被膜,改良平板法建立肺炎克雷伯菌生物被膜模型,微量稀释法测定两种药水煎液以及头孢他啶对30株肺炎克雷伯菌的最低抑菌浓度(MIC),MTT法建立肺炎克雷伯菌被膜生成标准曲线。实验根据药物分为黄芩组、鱼腥草组、头孢他啶组和空白对照组。对应上述测定菌株的药物MIC浓度,运用MTT法检测四组生物被膜的模型用药前后的活菌数。结果黄芩水煎液对肺炎克雷伯菌的MIC为8～32 mg/mL,鱼腥草水煎液为125～500 mg/mL以及头孢他啶对KP的MIC为0.125～256 mg/mL。30株生物被膜模型在黄芩和鱼腥草的作用后,黄芩组和鱼腥草组的活菌数分别为(7.49±0.08)lg CFU/mL和(7.42±0.07)lg CFU/mL,空白对照组活菌数为(8.17±0.11)lg CFU/mL,用药后活菌数明显下降,黄芩组、鱼腥草组以及空白对照组生物被膜活菌数比较,组内差异有统计学意义(P0.05)。结论黄芩与鱼腥草水煎液对肺炎克雷伯菌的生物被膜具有抑制作用。     

黄芩总黄酮提取的响应面分析及其对Hela细胞作用的研究

【目的】 采用响应面分析法优选超声波法提取黄芩总黄酮的工艺条件,为工业化生产黄芩总黄酮提供理论参考;探究提取纯化后的黄芩总黄酮对Hela细胞增殖的影响,为宫颈癌的治疗提供新的应用依据。 【方法】 采用超声波法提取黄芩总黄酮,对使用Al(NO₃)₃-NaNO₂显色法测定黄芩总黄酮进行方法学考察;选取乙醇浓度、液固比、提取时间3个影响因素进行Box-Benhnken中心组合设计,利用响应面分析法(RSM)对提取工艺参数进行优化;利用优选条件提取黄芩总黄酮后采用大孔吸附树脂法对其进行纯化,用CCK-8法检测所得产物对Hela细胞的生长抑制作用。 【结果】 方法学考察结果表明本实验室采用Al(NO₃)₃-NaNO₂显色法测定黄芩总黄酮及超声提取工艺可靠;提取黄芩总黄酮最佳提取工艺为:乙醇浓度60%,液固比40 mL/g,提取时间45 min;预测值为1.776%,实际得率为1.704%,两者吻合度较高。50~800 μg/mL各组黄芩总黄酮在72 h内均抑制Hela细胞生长,呈时间和剂量依赖性,CCK-8检测结果显示48 h黄芩总黄酮的IC50为323.79 μg/mL。 【结论】 Box-Benhnken设计结合响应面分析法对黄芩总黄酮提取工艺进行优化方便、快捷,得出的参数可信度高、实用性好;纯化后的黄芩总黄酮能显著抑制Hela细胞的生长。     

黄芩原药材、药渣的黄芩苷含量测定及体外抗菌活性研究

【目的】测定黄芩原药材、药渣中黄芩苷含量,并探讨其体外抗菌作用。【方法】采用紫外—分光光度法测定黄芩原药材、药渣1(复方提取)、黄芩药渣2(单方提取)的黄芩苷含量,二倍稀释法、纸片法分别测定黄芩原药材、黄芩药渣1、黄芩药渣2对副溶血弧菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌的最低抑菌浓度、抑菌圈直径。【结果】黄芩原药材、黄芩药渣1、黄芩药渣2的黄芩苷含量分别为4.91%、2.05%、2.25%;黄芩原药材对副溶血弧菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌的最低抑菌浓度分别为0.98、3.91、62.5 mg/mL,抑菌圈直径分别为17.5、15.5、9.0 mm;黄芩药渣1对副溶血弧菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌的最低抑菌浓度分别为31.25、125、250 mg/mL,抑菌圈直径分别为11.0、0、0 mm;黄芩药渣2对副溶血弧菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌的最低抑菌浓度分别为31.25、250、250 mg/mL,抑菌圈直径分别为10.0、0、0 mm;阳性对照药中药复方NZ对副溶血弧菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌的最低抑菌浓度分别为0.24、1.95、31.25 mg/mL,抑菌圈直径分别为22.0、22.0、21.0 mm。【结论】复方和单方提取黄芩药渣中黄芩苷含量及MIC值相差不大,以黄芩苷含量为指标来看,提取后的黄芩药渣仍有很好的利用价值。复方和单方黄芩药渣对不同菌株的MIC差异显著不同,与原药材相比有39倍差距之大。     

呼吸系统感染肺炎克雷伯菌中Ⅰ类整合子基因盒的相关研究

【目的】 肺炎克雷伯菌是医源性感染的重要致病菌之一,随着临床大剂量抗生素的不规范使用,肺炎克雷伯菌多重耐药菌株日趋增多,常导致治疗的失败和病程迁延。I类整合子是肺炎克雷伯菌中分布最普遍的整合子,其携带的耐药基因盒在细菌耐药性方面起关键作用,且整合子的分布及携带的基因盒存在明显的地区差异性。目前尚未见青岛地区肺炎克雷伯菌整合子的研究报道,本研究旨在探讨I类整合子的分布、基因盒的组成及其与耐药表型的关系,明确青岛地区肺炎克雷伯菌中I类整合子及其携带的基因盒流行情况,为临床合理应用抗生素提供可靠依据。 【方法】 收集2011年至2013年青岛市立医疗集团分离鉴定的呼吸系统感染的非重复肺炎克雷伯菌82株,采用美国临床和实验室标准协会(CLSI)推荐的K-B法测定细菌对16种常用抗菌药物的敏感性;提取细菌基因组DNA,PCR检测整合子保守区的整合酶基因;对保守区阳性的菌株进行可变区基因的PCR扩增,将回收纯化的PCR产物克隆至pMD18-T载体,经琼脂糖凝胶电泳及PCR鉴定后,重组克隆送往华大基因公司进行测序,通过在线Blast和DNA Star软件进行同源性比对分析,确定I类整合子携带的耐药基因盒。 【结果】 82株肺炎克雷伯菌对16种常用抗菌药物的耐药率为2.3%~72.1%,其中对头孢唑林、哌拉西林和头孢呋辛类药物的耐药率达60%以上;I类整合子的阳性率为76.82%,I类整合子可变区扩增片段大小从750~2 500 bp不等,测序结果显示其携带的11种基因盒主要包括编码氨基糖苷类耐药性的aad 家族(aadA1、aadA2、aadA5、aadB)、aac 家族(aacA4)、编码磺胺类耐药性的dfr家族(dfrA1、dfrA5、dfrA12)、编码氯霉素耐药性的catB8 基因及功能不明的orfF及orfC 基因,共组成7种不同的基因盒排列组合(已向GeneBank申请登录)。 【结论】 青岛地区呼吸系统感染肺炎克雷伯菌中I类整合子的阳性率较高,其携带的耐药基因盒主要赋予细菌对氨基糖苷类和磺胺类的耐药性,这些耐药基因盒的不同排列组合构成了肺炎克雷伯菌多重耐药的物质基础。     

清肺消炎丸体外抗菌活性研究

目的 观察清肺消炎丸对9种肺炎常见病原菌的体外抗菌作用。方法 采用琼脂稀释法,测定清肺消炎丸对9种药敏质控菌株的最低抑菌浓度（MIC）及最低杀菌浓度（MBC）。结果 清肺消炎丸对肺炎链球菌、化脓性链球菌、金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌的MIC分别为6.25、25、25、50 mg/mL,相应的MBC分别为12.5、25、50、50 mg/mL;对大肠杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、变形杆菌及白色念珠菌均无明显体外抑菌活性。结论 清肺消炎丸对肺炎链球菌、化脓性链球菌、金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌具有体外抗菌作用,其中对链球菌的抗菌活性较高。     

茶多酚对肺炎克雷伯菌抑菌作用的研究

目的探讨茶多酚对肺炎克雷伯菌的杀菌作用,及其与常用抗菌药物联合使用的抑菌疗效,并初步探讨其作用机制。方法采用VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定系统对临床分离的20株肺炎克雷伯菌进行细菌鉴定;K-B法检测常见药物亚胺培南、哌拉西林/他唑巴坦、头孢吡肟、头孢噻肟和头孢他定的敏感性;琼脂稀释法检测茶多酚的最低抑菌浓度(MIC);同时检测0.5 MIC(512μg/mL)茶多酚与常用抗菌药物联合使用后试验药物抑菌环直径的变化,并判断茶多酚联合常用抗菌药物对多重耐药肺炎克雷伯菌抑制作用的可行性。使用结晶紫染色法、刚果红染色方法检测茶多酚对细菌生物膜形成和胞外黏液样物质(slime)产生的影响。结果 20株肺炎克雷伯菌对常用抗菌药物均耐药,K-B值为6～15 mm;茶多酚对20株多重耐药肺炎克雷伯菌的MIC均值为1024μg/mL;与常用试验药物联用:0.5 MIC(512μg/mL)茶多酚能使亚胺培南、哌拉西林/他唑巴坦、头孢吡肟、头孢噻肟和头孢他定的抑菌环直径增加3～28 mm不等,能明显与受试抗生素产生显著的协同作用,并且能逆转部分试验药物从耐药变为敏感。亚抑菌浓度下茶多酚能显著抑制肺炎克雷伯菌生物膜和胞外黏液样物质(slime)的产生。结论茶多酚与常用抗菌药物(亚胺培南、哌拉西林/他唑巴坦、头孢吡肟、头孢噻肟和头孢他定)联合使用对多重耐药肺炎克雷伯菌具有协同杀菌作用,并且影响其细菌生物膜形成和胞外黏液样物质(slime)的产生。     

抗碳青霉烯类产酸克雷伯菌的耐药机理

【立论依据】 肠杆菌科细菌是寄居肠道的一大类正常菌群,已成为病人医院获得性感染的主要来源。产酸克雷伯菌是肠杆菌科克雷伯氏菌属的一个种,2011年度卫生部全国细菌耐药监测网肠杆菌科细菌耐药监测结果显示,产酸克雷伯菌对碳青霉烯类抗生素的耐药率在5% 以上。有研究在产酸克雷伯菌耐药基因的检测中发现了碳青霉烯酶基因blaKPC。 【设计思路】 本课题对临床抗碳青霉烯类产酸克雷伯菌染色体或质粒介导的耐药基因进行研究,初步明确菌株的耐药机理及发生院内感染的可能,为临床监测该细菌的耐药变化和预防或控制院内感染提供依据。 【实验内容】 (1)筛选耐碳青霉烯类产酸克雷伯菌菌株;(2)菌株的形态结构、生理生化和分子(16S rDNA)鉴定;(3)菌株染色体、质粒耐药基因提取克隆;(4)同或异属、种敏感和耐药菌株进行遗传物质的人为干预,推测耐药菌株发生院内感染的潜能。 【材料】 菌株来源:临床标本(痰液、血液、脑脊液等)分离得到13株耐药菌株;抗菌药物:亚胺培南、厄他培南、美罗培南纸片;培养基:营养琼脂培养基;仪器:VITEK-32全自动微生物鉴定/药物分析系统,低速高速离心机,PCR仪,电泳仪,凝胶成像系统,—20℃低温冰箱;试剂:D3H2O,PCR引物,等电聚焦电泳用聚丙烯酰胺凝胶,TaqMix(含KC1、Tris-HC1、MgC1 、dNTP混合物、Pfu DNA聚合酶、溴酚蓝、其它增强剂与稳定剂),GelRed核酸电泳染液,PCR DNA Loading Buffer(1 000 bp)。 【可行性】 (1)研究路线在理论和实践上都是可行的,相关的技术都比较成熟;(2)湖北医药学院具备所有相关实验条件;(3)本课题指导教师有20余年的微生物代谢产物及基因组研究经历,且已完成十堰地区三家三甲医院近十年来临床耐药菌株的流行病学调查和耐药性分析;(4)现已获得耐药菌株K.oxytoca,正在进行其染色体DNA携带耐药基因的筛查。 【创新性】 国内外对产酸克雷伯菌耐碳青霉烯类机理的研究刚刚起步,本课题拟提取耐药株质粒DNA,分析耐药基因,预测产酸克雷伯菌院内感染的可能。目前,国内相关报道很少,本课题为较早开展的研究。     

草决明对临床耐药金葡菌的抗菌作用及生物膜形成的影响

目的探讨草决明对耐药金葡菌的抗菌作用及其对细菌生物膜的抑制作用。方法以临床耐药菌株为研究对象,微量肉汤稀释法测定其最低抑菌浓度(MIC),96孔板法测定草决明对金葡菌生物膜的抑制作用,以氯化钠和蒸馏水测定草决明处理菌细胞壁渗透能力。结果草决明醇提液抗菌作用较强,其对金葡菌标准菌株和临床菌株的最低抑菌浓度分别为25μg/mL、6.25μg/mL,1/2~1/4MIC的草决明醇提液均可明显抑制耐药菌株生物膜的形成;1/2~1/8MIC草决明醇提液处理耐药金葡菌后,其细胞壁渗透力并无明显改变。结论草决明醇提液对耐药金葡菌具有抗菌作用,对耐药菌生物膜形成具有明显的抑制作用。     

黄芪对铜绿假单胞菌毒力因子调控表达及菌体运动的影响

[目的] 观察黄芪对铜绿假单胞菌相关毒力因子表达及菌体运动的影响,探讨黄芪对铜绿假单胞菌的作用机制。[方法] 不同浓度黄芪与对数生长期铜绿假单胞菌共培养,弹性蛋白-刚果红降解实验检测细菌分泌的弹性蛋白酶活性,紫外分光光度法测定绿脓菌素分泌量,结晶紫染色法观察生物被膜形成量,在含黄芪琼脂平板中检测菌体集群运动与泳动能力。[结果] 黄芪在终浓度25、12.5、6.25 g/L条件下对弹性蛋白酶、绿脓菌素表达有显着抑制,并能抑制生物被膜形成。在低于12.5 g/L时对细菌增殖无显着影响。细菌在12.5 g/L条件下泳动能力与集群运动均受到显着影响。[结论] 黄芪对铜绿假单胞菌增殖和毒力因子表达的抑制程度不一致,提示黄芪抑菌可能通过多种途径发挥抑菌功能,并可能在低浓度下便对密度感应系统造成显着抑制。     

肺炎克雷伯菌生物膜形成及调控机制的研究进展

生物膜是细菌生长的动态过程,其产生的胞外成分可增强细菌对宿主防御机制和抗生素的抵抗力。耐药细菌生物膜的形成将是临床感染治疗与控制的一大挑战。肺炎克雷伯菌是临床常见的致病菌,高毒力型肺炎克雷伯菌与耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌可引起严重的感染性疾病,难以治愈,其生物膜的形成使这种情况更加严峻。对肺炎克雷伯菌生物膜形成及其调控机制的深入研究可为临床抗感染治疗与控制带来新的思路。本文主要从菌毛、多糖、群体感应系统和外排泵对肺炎克雷伯菌生物膜形成的作用及调控机制的最新研究进展进行综述。     

黄芪、穿心莲单独或与抗菌肽LL-37联合应用对铜绿假单胞菌生物膜的影响

【目的】探讨黄芪、穿心莲对铜绿假单胞菌(PA)生物膜的抑制作用及与抗菌肽LL-37联合应用是否有协同作用。【方法】培养铜绿假单胞菌野生菌株PAO1生物膜,并采用紫外分光光度法进行鉴定。采用微量肉汤稀释法分别检测黄芪、穿心莲和抗菌肽LL-37对铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度(MIC)。采用紫外分光光度法检测20、50、100 g/L黄芪,20、50、100 g/L穿心莲单独用药或分别与32、64μg/mL抗菌肽LL-37联合应用对PAO1生物膜的作用。【结果】成功构建体外PAO1生物膜模型。黄芪、穿心莲在3.125～200 g/L浓度范围内对PAO1无抑制作用。抗菌肽LL-37对PAO1的MIC为256μg/mL。黄芪、穿心莲单独用药对PAO1生物膜早期形成均具有抑制作用(P0.05),呈现浓度依赖性。黄芪/穿心莲与抗菌肽LL-37联合用药对PAO1生物膜的形成及对成熟生物膜的清除作用不明显,不具有协同作用。【结论】黄芪、穿心莲均能够早期抑制PAO1生物膜的形成并且在一定程度上对成熟生物膜结构有一定的破坏作用;与抗菌肽LL-37联合应用时,不具有协同作用。     

黄芩素对金黄色葡萄球菌生物膜抑制作用的体外研究

目的研究黄芩素(Baicalein)对金黄色葡萄球菌(S.a)早期、成熟生物膜(biofilm,BF)的抑制作用。方法以编号为17546金黄色葡萄球菌为实验菌株,构建体外BF模型。分为空白对照组、实验组(黄芩素组),二倍稀释法测定最低抑菌浓度(MIC);荧光显微镜观察载体表面BF形态;连续稀释法行活菌计数。结果建模3 d,荧光显微镜发现黄芩素终浓度分别为128μg/mL、64μg/mL、32μg/mL的实验组形成BF明显少于空白对照组,载体表面活菌计数(x±s,log10CFU/mL)分别为4.00±0.27、4.24±0.31、5.26±0.45,均少于空白对照组活菌计数5.69±0.18(P<0.05);建模7 d荧光显微镜观察,黄芩素终浓度分别为128μg/mL、64μg/mL、32μg/mL的实验组仅见少许散在生物膜,BF结构较空白对照组明显稀薄,其BF内细菌活菌计数(x±s,log10CFU/mL)分别为4.04±0.12、4.69±0.41、5.63±0.10亦均少于空白对照组活菌计数6.08±0.10(P<0.05)。结论黄芩素在体外可以抑制金黄色葡萄球菌生物膜的形成。     

KPC-2基因在克雷伯菌属中传播机制研究

目的 研究克雷伯菌属对亚胺培南耐药机制以及KPC-2基因在克雷伯菌属中传播机制。方法 收集四川大学华西医院两个阶段（2009～2010年和2012～2013年）分离的对亚胺培南耐药的克雷伯菌属细菌。琼脂稀释法测定亚胺培南最低抑菌浓度(MIC),CARB ChromID平板和改良Hodges试验检测碳青霉烯耐药表型,PCR检测细菌的KPC-2基因表达。质粒接合试验检测质粒传播性。随机引物扩增多态性DNA（RAPD）方法和肠杆菌基因间重复一致序列聚合酶链反应（ERIC-PCR）技术分别用于分析质粒和菌株的同源性。结果 第一阶段筛选并确证耐亚胺培南的3株产酸克雷伯菌首先获得碳青酶烯类抗生素耐药性,第二阶段筛选并确证耐亚胺培南的7株肺炎克雷伯菌出现相同的获得性耐药。PCR显示10株细菌均携带KPC-2型基因。质粒接合试验显示产酸克雷伯菌中携带KPC-2基因的质粒可以传递到受体菌,且与KPC-2基因阳性的肺炎克雷伯菌中携带的质粒具有同源性。ERIC-PCR结果显示7株KPC-2基因阳性的肺炎克雷伯菌具有同源性。结论 四川大学华西医院分离的对亚胺培南耐药的肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌主要耐药机制是产生KPC-2型碳青霉烯酶。产酸克雷伯菌中携带KPC-2基因质粒,该质粒具有传递性且与肺炎克雷伯菌携带质粒相同。肺炎克雷伯菌中耐药株的传播形式为同一克隆传播,而在克雷伯菌属中不同菌种间耐药传播途径为同一质粒的水平传播。     

培养法和PCR法用于实验大、小鼠细菌检测的比较分析

目的 比较培养法和PCR法对实验大、小鼠的细菌检测效果。方法 分别采用传统细菌分离培养结合生化鉴定方法和PCR方法, 对78只SPF级大鼠和422只SPF级小鼠进行检测, 对两种方法的检测结果进行比较分析。结果 78只SPF级大鼠均未检测出阳性。422只SPF级小鼠, 培养法检测阳性率7.11%(30/422), 其中金黄色葡萄球菌10只, 绿脓杆菌22只, 肺炎克雷伯杆菌2只。PCR法检测阳性率7.58%(32/422), 其中金黄色葡萄球菌10只, 绿脓杆菌25只, 肺炎克雷伯杆菌2只。结论 PCR法的敏感性高于培养法, 操作简便、快捷, 适用于实验动物细菌的快速诊断和大规模的质量筛查。     

丹参提取液对球形红细菌生长的影响

目的 考察丹参提取液对球形红细菌（光合细菌）生长的影响。方法 通过添加不同质量浓度的常规培养基和丹参提取液,培养球形红细菌,考察球形红细菌的活菌数、生长曲线、脱氢酶活性及光合色素吸收光谱,研究丹参提取液对球形红细菌生长的影响。结果 培养基中添加丹参提取液后可使球形红细菌活菌数增加到之前的1.6倍,并缩短球形红细菌生长的延迟期,提前进入指数期及稳定期,可使球形红细菌脱氢酶活性提高到之前的6.6倍。低质量浓度丹参提取液基本不影响球形红细菌中光合色素的形成,高质量浓度时吸收均变低,且影响类胡萝卜素的形成,其红外光谱855 nm处红移至863 nm。结论 培养基中添加丹参提取液可影响球形红细菌生长,缩短球形红细菌生长周期,提高球形红细菌的活力,高质量浓度时影响光合色素的形成。     

肺炎克雷伯菌KbvR调控因子对细菌生物膜与荚膜形成能力的影响

目的构建肺炎克雷伯菌LuxR家族KbvR基因缺失突变株与回补株,分析KbvR在肺炎克雷伯菌生长、生物膜形成及荚膜 生成中的作用。方法通过自杀载体pKO3-Km质粒构建KbvR基因敲除株,然后扩增出包含KbvR基因编码区、启动子结合区及 转录终止区的基因片段,克隆至pGEM-T-easy质粒上构建KbvR基因回补株。绘制不同菌株生长曲线,了解KbvR对细菌生长的 影响。通过结晶紫定量实验检测KbvR基因对细菌生物膜形成的影响,拉丝实验、离心试验及RT-PCR检测KbvR基因对细菌荚 膜形成的影响。结果成功获得KbvR基因缺失突变株及回补株,RT-PCR结果显示KbvR基因在缺失突变株中不表达,在回补株 中重新表达。KbvR基因不影响细菌的生长速度,基因敲除株后细菌生物膜形成及荚膜生成能力下降。体外试管静止培养48 h, 与野生株相比基因缺失突变株生物膜形成能力明显下降,而KbvR基因回补株在液体培养基表面能形成明显生物膜。结晶紫染 色定量实验发现,基因缺失突变株生物膜形成能力显著低于野生株（P<0.01）。超粘性实验和RT-PCR结果均显示,KbvR基因缺 失突变株荚膜形成能力明显下降,说明KbvR基因影响肺炎克雷伯菌生物膜和荚膜的形成。结论KbvR基因作为密度感应系统 LuxR孤儿调控转录因子,正调控肺炎克雷伯菌生物膜的形成。荚膜是细菌生物膜形成的重要因素,KbvR基因可通过影响荚膜 形成而调控生物膜的形成。     

铜绿假单胞菌中c-di-gmp相关的突变菌株的研究

【立论依据】 作为一种新型而广泛存在的第二信使,环鸟苷二磷酸(c-di-GMP)调控细菌的运动性、生物膜合成、细菌毒性、细胞周期等多种生理过程;而这些功能均与细菌的致病性及耐药性密切相关。在细菌中,环鸟苷二磷酸的代谢及胞内水平是由两种催化功能相反的酶共同起作用:鸟苷酸环化酶(diguanylate cyclase, DGCs)将两分子GTP转化生成一分子c-di-GMP; 而环鸟苷二磷酸特异的磷酸二酯酶 (phosphodiesterase,PDEs)则将c-di-GMP分解为pGpG,并最终水解为GMP。鸟苷酸环化酶具有高度保守的GGDEF蛋白结构域, 环鸟苷二磷酸特异的磷酸二酯酶则具有EAL结构域或较为少见的HD-GYP结构域,这些蛋白统称为环鸟苷二磷酸代谢蛋白(c-di-GMP metabolizing proteins)。铜绿假单胞菌模式菌株PAO1中有多达38个含GGDEF及EAL结构域的蛋白;然而,环鸟苷二磷酸是水溶性的小分子化合物;细胞内却存在如此多的担负环鸟苷二磷酸代谢功能的基因,这些具有“重叠性”的基因功能及其相互协调的机制完全不清楚。 【设计思路】 基因突变将导致表型变化,由此将表型与基因型相联系,从而使得对特定基因功能进行分析成为可能。 【实验内容】 本项研究利用细菌表型分析及PCR手段,比较不同的基因在细菌的生物膜合成及泳动性中的作用。 【材料】 以课题组拥有的多个GGDEF及EAL结构域突变的铜绿假单胞菌突变菌株为主要研究对象。 【可行性】 (1)已经拥有多个环鸟苷二磷酸代谢相关的突变菌株,实验材料有所保证;(2)涉及到的实验方法,例如细菌培养及PCR,均较为规范和易于掌握。 【创新性】 本项研究中涉及到的多个基因均未见详细的分析、鉴定;我们将以野生型为对照,在确定基因型的基础上,对突变体菌株的表型进行较为精细的分析、比较,由此为未来进一步的研究工作奠定基础。     

青岛地区大肠埃希菌中整合子与耐药性的分析

【立论依据】 大肠埃希菌是临床常见的条件致病菌,耐药率有逐年上升的趋势。近年研究表明,整合子在细菌多重耐药性的形成和水平传播中发挥重要作用,且整合子的分布及其携带的基因盒存在明显的地区差异性。因此,检测不同地区大肠埃希菌中整合子的分布及耐药基因盒,对于控制细菌耐药及合理应用抗菌药物具有重要的指导意义。 【设计思路】 本研究通过检测青岛地区临床分离的大肠埃希菌中I类、II类及III类整合子的分布及携带的耐药基因盒,分析整合子与耐药表型的关系,旨在探讨整合子在介导大肠埃希菌耐药中的作用。 【实验内容】 琼脂纸片扩散法进行药敏试验;分别设计针对I、II、III类整合子整合酶基因及可变区的PCR引物,PCR检测整合子的整合酶基因,对整合酶基因阳性菌株进行可变区基因的PCR扩增,回收纯化的PCR产物克隆至T载体,将筛选鉴定的重组子送往华大基因公司测序,测序结果经在线Blast及DNAstar软件进行同源性比对分析,确定整合子携带的耐药基因盒。应用SPSS 21.0统计软件分析大肠埃希菌耐药性与整合子的相关性。 【材料】 78株大肠埃希菌分离自青岛市立医疗集团住院患者的各类标本,细菌DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司,PCR引物由Invitrogen公司合成,pMD18-T载体购自大连TaKaRa公司。 【可行性】 前期研究结果表明:78株大肠埃希菌对环丙沙星、左氧氟沙星、头孢唑林、头孢呋辛、复方新诺明、氨曲南、头孢曲松及哌拉西林的耐药率均超过70%;I类整合子的携带率为53.89%,其中I类整合子阳性菌株对复方新诺明的耐药率明显高于整合子阴性菌株,差异有统计学意义(P<0.05);I类整合子可变区检测出3种不同长度的片段:2株750 bp片段不携带耐药基因盒,8株1 800 bp片段携带dfrA17-aadA5 基因盒,1株1 200 bp片段为aadA22基因盒;I类整合子阳性菌株中携带耐药基因盒的菌株占61.90%,对复方新诺明的耐药率明显高于基因盒阴性菌株(P<0.01)。 【创新性】 首次研究青岛地区大肠埃希菌中整合子的分布及其携带的耐药基因盒,探讨整合子与大肠埃希菌耐药性的关系。     

不动杆菌的分离与鉴定

【目的】 鲍曼不动杆菌是一类非发酵、专性需氧的革兰阴性球杆菌,是临床常见的条件致病菌之一。近年来鲍曼不动杆菌感染率不断上升,其耐药率也逐年增强。鲍曼不动杆菌几乎对所有抗生素呈现高度耐药,给临床治疗带来极大困难。噬菌体是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒,具有严格的宿主特异性,只能在活的微生物细胞内复制、增殖。毒性噬菌体在宿主菌内复制增殖,并最终裂解细菌,其特殊的生物学特性有望成为临床上治疗细菌感染新的有效手段。温和噬菌体能将基因组整合于宿主菌染色体中,不产生子代噬菌体,不裂解细菌,使菌体处于溶原状态。本课题通过分离鉴定鲍曼不动杆菌噬菌体,研究噬菌体对耐药性的鲍曼不动杆菌的影响。 【方法】 采集污水,人及动物上呼吸道内和医院ICU环境的标本,经CaCl₂处理后,离心取上清液,细菌滤器滤过,将滞留在滤膜上的细菌进行分离传代培养,纯化;染色镜检,观察细菌形态、排列,初步生化试验筛选、ATB生化鉴定菌种;药敏试验选择耐药菌株;经噬斑试验,分离或诱导毒性噬菌体;负染色法制备电镜标本,观察其超微结构。 【结果】 ICU环境中,特别是呼吸机导管可分离到鲍曼不动杆菌,鲍曼不动杆菌表面存在温和噬菌体,呈多边形,细菌耐药性明显,为多重耐药。 【结论】 耐药的鲍曼不动杆菌菌体表面存在温和噬菌体,未裂解细菌,可能将基因整合于宿主菌体,研究噬菌体与不动杆菌耐药性的相关性,通过诱导毒性噬菌体,裂解细菌,可治疗和控制细菌性感染,将为防治鲍曼不动杆菌引起的医院感染带来希望。     

细菌性肝脓肿病原菌检测及抗菌药物使用分析

目的 探讨细菌性肝脓肿病原学分布、抗菌药物的敏感性特点及使用情况。方法 对我院安亭院区2015年10月至2017年4月收治的125例细菌性肝脓肿患者的临床资料进行分析,调研细菌培养结果及耐药情况,分析抗菌药物的使用情况。结果 94例患者行病原菌检查,其中51例患者的62个样本细菌培养阳性。共检出62株细菌,其中革兰阴性菌53株（85.48%）,主要为肺炎克雷伯菌（33株）、大肠埃希菌（10株）;革兰阳性菌9株（14.52%）,主要为金黄色葡萄球菌（2株）、屎肠球菌（2株）和粪球肠菌（2株）。肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌中产超广谱β-内酰胺酶菌分别占6.06%（2/33）和60.0%（6/10）。头孢曲松钠、头孢哌酮/舒巴坦钠、亚胺培南/西司他丁钠用药频度较大且药物利用指数>1。结论 细菌性肝脓肿主要致病菌为革兰阴性菌,其中以肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌为主。为减少耐药菌的产生,应加强抗菌药物使用的管理,尽早明确病原菌,并根据药物敏感试验结果选用抗菌药物。