慢病毒介导的siRNA沉默hTERT基因对宫颈癌Caski细胞增殖和凋亡的影响

目的：探讨利用慢病毒介导小干扰核糖核酸（ siRNA）沉默人体端粒酶反转录酶（ hTERT）的可行性及其对宫颈癌Caski细胞增殖和凋亡的影响。方法用前期构建的慢病毒表达载体anti-hTERT-LV 和 NC-LV转染宫颈癌 Caski细胞。实验共分3组,分别为空白对照组（ NC组）、阴性对照组（ NC-LV组）及干扰组（ anti-hTERT-LV组）。采用实时荧光定量PCR检测hTERT mRNA表达量,采用流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡情况。结果 anti-hTERT-LV组hTERT mRNA相对表达量为（0．28±0．02）明显低于NC组（1．0）及NC-LV组（0．87±0．05）（ P均＜0．05）。 anti-hTERT-LV组G1期细胞比例（71．52±0．79）％明显高于NC组（54．69±2．84）％和NC-LV组（55．70±1．31）％（P均＜0．05）;anti-hTERT-LV组S期细胞比例（18．69±1．95）％明显低于NC组（36．06±1．56）％和NC-LV组（34．16±1．09）％（P均＜0．05）。 anti-hTERT-LV组细胞凋亡率（36．45±5．39）％明显高于NC-LV组（8．75±3．75）％和NC组（9．55±2．57）％（P均＜0．05）。结论慢病毒介导siRNA可以沉默hTERT基因,高效特异地抑制宫颈癌Caski细胞hTERT基因的表达,促进细胞凋亡,抑制肿瘤细胞的生长和增殖。     

siRNA介导的NF-κB P65沉默诱导肝癌细胞SMMC7721凋亡

目的 研究siRNA介导的NF-κBP65沉默诱导肝癌细胞凋亡相关机制。方法实验以肝癌SMMC772l细胞株为材料,分为空白对照（Con）、脂质体对照（LP）以及siRNA干扰实验（siRNA）3组。以体外转录法合成dsRNA,并用脂质体转染SMMC7721细胞株;Westernblotting检测NF．KBP65表达水平,MTT检测细胞增殖情况,Annexin V-PI法检测细胞凋亡,免疫组化检测Bcl-2和Bax表达。结果与Con和LP组相比,siRNA具有抑制SMMC7721细胞NF-κBP65表达的作用,NF-κBP65表达抑制率分别达到64．74％和34．52％。siRNA明显抑制SMMC．7721细胞的增殖,并诱导细胞凋亡,晚期凋亡细胞分别是Con组和LP组的8倍和7倍。siRNA引起Bcl-2表达下调,而Bax表达上调。结论siRNA可以有效抑制NF-κBP65蛋白表达,并通过调节Bcl-2和Bax诱导SMMC7721细胞的凋亡。     

MicroRNA-340在肝细胞肝癌中抑制细胞增殖并促进凋亡

目的 探讨微RNA-340(miR-340)在肝细胞肝癌中的表达特点及其对细胞生物学行为的影响.方法 收集重庆医科大学附属第一医院肝胆外科2015年3月至2016年9月收治的40例肝细胞肝癌患者手术后切除的癌组织和癌旁组织标本.通过qPCR检测组织标本中miR-340的表达,并分析miR-340表达与临床病理学指标的关系.分别培养肝癌细胞株Hep3B、Bel-7402、HepG2和SMMC-7721以及正常肝细胞株HL-7702,48 h后使用qPCR检测5种细胞中miR-340的表达水平.通过转染增加或抑制SMMC-7721细胞中miR-340的表达,然后分别于细胞培养24、48、72 h后采用CCK-8法检测SMMC-7721细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡.通过生物信息学软件预测miR-340的靶基因,并使用qPCR和蛋白质印迹法进一步验证miR-340对靶基因的作用.结果 癌组织中miR-340的表达低于癌旁组织(P＜0.01),并且miR-340的表达与乙肝表面抗原、HBV DNA载量、肿瘤大小以及临床TNM分期有关(P＜0.01).正常肝细胞HL-7702内miR-340的表达高于4种肝癌细胞Hep3B、Bel-7402、HepG2和SMMC-7721(P＜0.05,P＜0.01).增加miR-340表达可抑制SMMC-7721细胞的增殖(P＜0.05,P＜0.01),而抑制miR-340的表达则促进SMMC-7721细胞的增殖(P＜0.05,P＜0.01);增加miR-340的表达可促进SMMC-7721细胞的凋亡(P＜0.01),而抑制miR-340则减少凋亡(P＜0.01).生物信息学分析显示S期激酶相关蛋白2(SKP2)基因是miR-340下游的一个靶基因.qPCR和蛋白质印迹分析结果显示增加SMMC-7721细胞中miR-340的表达可抑制SKP2的mRNA和蛋白表达,抑制miR-340表达则增加SKP2的mRNA和蛋白表达.结论 miR-340的异常表达可能与乙肝病毒的感染有关,其异常表达有助于评价病情以及预后.在肝癌细胞系SMMC-7721细胞中,miR-340能够抑制细胞增殖并促进凋亡,这一作用结果可能是通过miR-340对SKP2的抑制而实现的.     

siRNA介导的MAPKp42沉默诱导HeLa细胞凋亡

目的应用siRNA沉默HeLa细胞MAPKp42,研究其对细胞存活的影响。方法体外合成靶向MAPKp42的siRNA-1和siRNA-2,并用脂质体转染HeLa细胞,Western印迹法和免疫组织化学法检测p42^MPAK的表达;电镜观察,TUNEL法测定细胞凋亡,Annexin-PI法测定不同凋亡时期细胞的分布。结果siRNA-1和siRNA-2均可使HeLa细胞MAPK p42沉默,使p42^MAPK表达下调,与阴性对照组相比分别降低2、5倍和3．2倍。电镜观察证实,siRNA-1和siRNA-2转染组部分细胞丧失表面微绒毛,细胞内空泡增加,细胞核染色质边集。处理组HeLa细胞早期凋亡率显著增加,其中siRNA-1组晚期凋亡率也明显增加。结论siRNA介导的MAPKp42沉默可以诱导HeLa细胞凋亡。     

慢病毒介导的Clusterin基因沉默抑制肾癌786-O细胞增殖并促进细胞凋亡

【目的】 应用慢病毒介导的RNA干扰技术,检测clusterin(CLU)基因沉默在人肾癌786-O细胞的干扰效果及其对人肾癌786-O细胞增殖?迁移和凋亡的影响?【方法】 构建靶向CLU基因的慢病毒干扰载体,利用包装细胞293T获得重组慢病毒,感染人肾癌786-O细胞株?实验分5组:CLU-RNAi-LV1(KD1)?CLU-RNAi-LV2(KD2)?CLU-RNAi-LV3(KD3)为加入靶向CLU基因的慢病毒感染的肾癌细胞组,未处理的慢病毒感染的肾癌细胞组(NC组),肾癌786-O细胞为空白对照组(CON组)?应用Real time-PCR及Western blot检测不同组别干扰前后CLU mRNA及蛋白表达的变化?用细胞划痕实验?MST-1?流式细胞仪等方法检测CLU沉默后肾癌786-O细胞在增殖?迁移?凋亡等生物学行为的改变?【结果】 成功构建CLU shRNA慢病毒载体clu-RNAi-LV并获得相应慢病毒?Real time-PCR显示不同感染复数CLU-RNAi-LV处理的KD1?KD2?KD3组CLU mRNA表达水平与对照组相比分别下调69.4%~96.5%和0?Western blot结果显示KD1?KD2?KD3组CLU蛋白表达水平与CON组相比分别下降35.24%?46.26%和58.91%,KD3能显著抑制786-O细胞中CLU基因的表达?划痕实验显示24 h时 KD3(si-CLU)组细胞迁移相对距离(408.43 ± 25.92)小于NC组(101.35 ± 6.05)和CON组(68.13 ± 6.64,P < 0.05)?WST-1法检测转染后72 h KD3(si-CLU)组细胞生长速度较NC组及CON组明显下降(P < 0.05),各组间差异(P < 0.05),均有统计学意义?流式细胞仪检测KD3(si-CLU)组与NC组?CON组细胞凋亡率分别为(6.23 ± 2.51)%?(1.05 ± 0.30)%和(1.17 ± 0.29)%,KD3(si-CLU)组与NC组?CON组相比凋亡率增加(P < 0.05),差异有统计学意义?肾癌786-O细胞的增殖?迁移受到抑制,而凋亡率增加?【结论】 筛选出能稳定干扰CLU基因表达的siRNA序列和肾癌786-O细胞株?CLU慢病毒干扰载体可有效沉默肾癌786-O细胞的内源性CLU基因,抑制肾癌786-O细胞的增殖?迁移并促进细胞凋亡?     

凋亡抑制因子反义寡核苷酸对肝癌细胞生物学作用

目的: 探讨survivin反义寡核苷酸对人肝癌细胞凋亡、增殖、化疗药物敏感性的影响. 方法: 设计合成特异性survivin的反义寡核苷酸(ASODN). 以高表达survivin基因的人肝癌细胞系(SMMC-7721)为靶细胞、ASODN为阻断剂,Western blot法检测细胞survivin表达情况, 通过MTT试验观察ASODN对该细胞系的生长抑制作用, 倒置显微镜观察细胞形态变化, 流式细胞仪分析细胞增殖周期, MTT法检测survivin表达抑制前后细胞对紫杉醇敏感性影响. 结果: ASODN明显抑制了SMMC-7721肝癌细胞的生长, 细胞分裂阻滞在分裂期的中期,并诱导细胞发生凋亡, 而各对照组细胞生长良好; 各ASODN药物组细胞凋亡指数明显高于各对照组(P<0.05)且细胞增殖指数明显低于各对照组(P<0.05); 紫杉醇药物组细胞IC50低于对照组(16.2±2.2) μg/L vs (35.5±4.3) μg/L, P<0.01. 结论: survivin ASODN能下调其蛋白表达, 诱导人肝癌细胞凋亡, 抑制细胞增殖,增加肝癌细胞对化疗药物的敏感性.     

下调MCT1表达抑制宫颈癌Hela细胞增殖并促进其凋亡

［摘要］ 目的探讨下调单羧酸转运蛋白1(monocarboxylate transporter 1,MCT1)表达对宫颈癌Hela细胞增殖和凋亡的影响及其机制。 方法将体外培养的Hela细胞分为未转染组、阴性对照组和MCT1-siRNA组,Western blot检测Hela细胞中MCT1、Bcl-2和Bax蛋白表达水平,MTT法检测Hela细胞增殖活力,流式细胞仪检测Hela细胞周期分布和凋亡率。 结果与未转染组比较,阴性对照组Hela细胞中MCT1、Bcl-2、Bax蛋白表达水平和细胞增殖、周期分布以及细胞凋亡率差异均无统计学意义（P＞0.05）,MCT1-siRNA组细胞中MCT1和Bcl-2蛋白表达水平、细胞增殖活力和细胞在S期所占百分比均明显降低,Bax蛋白表达水平、细胞在G0/G1期所占百分比和细胞凋亡率均明显升高（P＜0.05）。 结论下调MCT1表达可通过诱导细胞周期阻滞抑制Hela细胞增殖,并通过上调Bax和下调Bcl-2蛋白表达促进Hela细胞凋亡。     

补肾健脾方含药血清对人肝癌细胞株SMMC-7721细胞增殖和细胞凋亡的影响

目的：探讨中药补肾健脾方含药血清对人肝癌细胞株SMMC-7721细胞增殖和细胞凋亡的影响。方法：制备补肾健脾方含药血清,分为高、中、低浓度组;另设复方斑蝥组和甲状腺素组作为阳性对照组,并以空白细胞组作为空白对照组。培养人肝癌细胞株SMMC-7721进行体外实验,用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测各组培养24、48、72 h时细胞增殖抑制率,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果：各药物组含药血清对人肝癌细胞株SMMC-7721的抑制作用与浓度呈负相关、与作用时间呈正相关,在5%浓度、48 h作用下达到抑制率的高峰。中药干预组细胞凋亡率呈现浓度依赖性,高浓度组显著高于低浓度组（P〈0.05）;复方斑蝥组的细胞凋亡率略低于中药高浓度组（P〉0.05）,甲状腺素片组略高于中药低浓度组（P〉0.05）。结论：补肾健脾方含药血清可抑制人肝癌细胞株SMMC-7721细胞的增殖,具有诱导人肝癌细胞株SMMC-7721细胞凋亡的趋势。     

抑制Hsp90对肝癌细胞增殖和凋亡的影响

目的原发性肝癌恶性程度高，病情发展迅速，难以治愈，因此，寻找新的治疗手段十分必要。而分子伴侣Hsp90是维持一系列恶性肿瘤中起重要作用的蛋白质，特别是其在信号转导系统中所起的作用。如本实验通过特异性抑制剂格尔德霉素(Geldanamycin，GA)抑制Hsp90功能的方法研究Hsp90在肝癌细胞中的作用。方法培养人肝癌细胞株HepG2，采用Western印迹杂交法检测GA作用后HepG2细胞内蛋白激酶B／Akt磷酸化状态的变化、MTT法检测细胞和活力，并应用流式细胞术分析细胞周期与凋亡；MTT法检测单独应用丝裂霉素(mitomycin，MMC)或者将其与GA联合应用时对HepG2细胞的抑制情况、计算两药相互作用指数，同时采用流式细胞术分析这两种情况下细胞凋亡率的变化。结果400．mol／L的GA处理细胞后，HepG2细胞内磷酸化AKT的水平明显下降(24h为对照组的66．03％，48h为对照组的34．02％)；经过GA的作用，细胞呈现G2／M期阻滞，48h可见到凋亡率显著增加；同时MTT法显示GA对HepG2细胞有生长抑制作用，用药时间越长抑制率越高，24h和48h的抑制率分别为4．09％和21．74％。400．mol／L GA可以增强MMC对HepG2细胞的抑制作用，两药相互作用指数小于1。单独应用15．mol／L MMC细胞的凋亡率为7．65％，将400．mol／L GA与15．mol／L MMC联合使用，凋亡率上升到21．34％。结论在肝癌细胞中Hsp90可以通过增强信号转导系统中蛋白激酶的稳定性而维持癌细胞的生长优势，抑制Hsp90功能能够明显抑制肝癌细胞的生长并促进其凋亡，同时增强常用化疗药物对肝癌细胞杀伤效应，Hsp90可以成为肝癌治疗中的一个新靶点。     

PDE5基因沉默对肾透明细胞癌细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨PDE5基因对肾透明细胞癌细胞株786-O细胞增殖和凋亡的影响.方法 设计、合成PDE5 siRNA序列,按照HiPerFect转染试剂盒操作手册转染786-O细胞.采用实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative PCR)和Western blot法检测转染后PDE5 基因的表达,通过WST-1法检测细胞增殖情况,caspase-3活性检测试剂盒检测caspase-3活性.结果 与空白对照组和阴性对照组相比较,PDE5 siRNA转染组的mRNA及蛋白表达水平显著降低,786-O细胞增殖能力明显受到抑制,caspase-3活性明显增加,差异均具有统计学意义(P<0.05).结论 siRNA干扰PDE5基因表达可抑制肾透明细胞癌细胞株786-O细胞的增殖并促进凋亡.     

siRNA介导垂体瘤转化基因沉默抑制人泌乳素型垂体瘤凋亡的研究

目的探讨垂体瘤转化基因(PTTG)对人泌乳素型垂体瘤(HPA)细胞凋亡的影响。方法设计并合成针对PTTG的特异性siRNA序列,通过siPORTTM NeoFXTM转入原代培养HPA细胞,Western blot法检测siRNA作用后PTTG蛋白表达,DNA ladder和annexin V/PI染色法检测PTTG沉默对细胞凋亡的影响。结果siRNA转染组细胞内PTTG蛋白表达减弱;在CDDP诱导后,对照组和siRNA组均出现细胞凋亡,siRNA组DNA ladder形成不明显,Annexin V染色凋亡细胞数目减少,对照组细胞凋亡率为18.6%,而siRNA组仅为8.7%。结论垂体瘤转化基因对人泌乳素型垂体瘤细胞具有促进凋亡作用。     

细胞凋亡与肝癌

细胞凋亡（Apoptosis）是指在一定生理和病理情况下,机体为维护内环境的稳定,通过基因调控而使细胞主动消亡的过程。它有别于组织坏死。有关细胞凋亡的一般性知识已有不少文献进行了论述。本文仅就细胞凋亡在肝癌发生发展中的作用研究近况作一综述。1肝癌细胞凋亡现象无论是在体外培养的肝癌细胞还是体内发生的肝癌,都存在细胞凋亡现象。TeSSitohe等在大鼠肝癌的组织切片上观察到了凋亡的特征性改变：染色质浓聚和凋亡小体。核酸电泳亦出现了DNA阶梯条带。FuKuda等在体外培养的MCARH7777肝癌细胞株中也发现了类似的凋亡特征性改变…     

原发性肝癌的细胞凋亡及其调节因子的研究进展

<正>在实体肿瘤中,瘤细胞的死亡通常有两种形式,一类是小结中心的团块样细胞坏死;一类是散布于整个肿瘤组织的细胞凋亡.在肝细胞癌中,同样存在着这两种细胞死亡形式.近年来的研究表明,肝细胞凋亡的过度受抑制作为主要病理机制之一参加肝癌的发生发展.诱导肝癌细胞凋亡的治疗将是未来肝癌内科治疗的研究方向之一.1 肝脏致病因子与细胞凋亡1.1病毒感染与肝细胞凋亡 肝炎病毒、腺病毒、疱疹病毒、黄热病毒和砂粒病毒均可引起肝细胞凋亡.这种凋亡可能是宿主对病毒感染的一种防疫反应-被感染的细胞通过凋亡来防止病毒复制.病毒感染后宿主细胞发生凋亡既可以是病毒的直接效应,也可以是宿主免疫反应的结果.Ando等用转基因小鼠模型研究证明,乙肝病毒感染鼠肝细胞后,在细胞毒性T细胞作用下,     

Survivin基因在肝癌细胞增殖、凋亡过程中的表达及意义

目的 探索Survivin基因在肝癌细胞增殖和凋亡过程中的表达及其临床意义.方法 将肝癌细胞分为空白组(A组)、载体病毒组(B组)、shRNA-Survivin慢病毒组(C组),使用MTT法分别检测三组肝癌细胞转染后HepG2肝癌细胞增殖率、使用AV-PI凋亡试剂盒分别检测三组肝癌细胞凋亡抑制率、使用RT-qPCR检测...     

红豆杉细胞提取物抑制肿瘤细胞增殖及诱导凋亡的实验研究

目的 研究红豆杉细胞提取物对肝癌细胞SMMC-7721的生长抑制作用及其机制。方法 运用台盼蓝拒染法测定肿瘤细胞生长曲线，流式细胞仪和Giemsa染色分析肿瘤细胞周期和细胞凋亡。结果 红豆杉细胞二氯甲烷提取物对肝癌细胞SMMC-7721的生长有明显的抑制作用，流式细胞仪分析发现G2／M期肿瘤细胞数量增多，经Giemsa染色发现肿瘤细胞有凋亡发生。结论 红豆杉细胞提取物可以通过诱导细胞发生凋亡而抑制肝癌细胞SMMC-7721的生长。     

靶向STAT5的siRNA诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡

目的 采用RNA干扰技术阻断STAT5基因的表达,观察其对人肝癌SMMC-7721凋亡的影响.方法 构建3种靶向STAT5的小干扰RNA(siRNA)真核表达载体,采用LipofectamineTM2000转染肝癌细胞SMMC-7721;分别采用半定量RT-PCR、Western blot技术检测转染前后SMMC-7721细胞STAT5 mRNA和蛋白质表达的变化;采用透射电镜技术观察细胞形态变化;流式细胞术检测细胞凋亡率.结果 3条靶向STATS的序列特异性的siRNA可以有效地抑制SMMC-7721细胞STATS mRNA和蛋白质表达,STAT5 mRNA表达抑制率分别为70.43%、43.02%、45.07%,STAT5蛋白表达抑制率分别为67.45%、37.36%、41.86%;转染靶向STAT5的siRNA真核表达载体48 h后出现凋亡细胞的典型形态学变化,并诱导25.61%的SMMC-7721细胞发生凋亡.结论 靶向STAT5的siRNA真核表达载体可以有效、特异地阻断SMMC-7721细胞STAT5基因的表达,并能够诱导SMMC-7721细胞凋亡,STAT5 siRNA在人肝癌的基因治疗中可能具有潜在的应用价值.     

细胞凋亡与肝癌

1细胞凋亡 细胞凋亡(apoptosis)又称程序性细胞死亡(programmed cell death,PCD),是活体内单个细胞或小团细胞的死亡,是机体为维护自身稳定在基因调控下细胞发生主动消亡的过程.     

肝癌细胞凋亡相关基因分析

目的 克隆肝癌细胞凋亡相关基因。分析已知基因同源的cDNA序列，探讨三氧化二砷（As2O3)诱导肝癌细胞凋亡的分子机制。方法 用As2O3诱导人肝癌HCC-9204细胞凋亡，应用抑制性消减杂效技术克隆凋亡细胞中的差异表达cDNA，测序并与Genebank中的已知基因序列进行同源性比较。结果 克隆到18个与已知基因高度同源的cDNA序列，包括与抗氧化损伤，线粒体跨膜运输，细胞骨架系统相关的基因，细胞凋亡相关核蛋白PHLDA1基因，核糖体蛋白L37基因，溶酶体ATP酶基因以及与Ibd1,SMT3,DKFZP434J154pro-tein等基因高度同源的序列。结论 As2O3诱导的肝癌细胞凋亡后，大量基因表达上调，这些基因大多与As2O3处理肝癌细胞后的应激反应和细胞凋亡有关，提示细胞凋亡是一个有多基因参与调控的复杂过程。     

siRNA介导表皮生长因子受体基因沉默导致HepG2凋亡

目的：研究含有与EGFR基因序列相同的19nt序列RNAi质粒针对HepG2细胞表皮生长因子受体的RNA干扰效果。方法：用pSIREN-hE转染细胞,其质粒骨架为RNAi-Ready pSIREN-Shuttle Vector,含有可以被U6启动子转录成shRNA的寡核苷酸链,大小为69nt,含有2段19nt的寡核苷酸,用于编码EGFR基因的RNA干扰的siRNA的正义链及反义链,评价该RNAi质粒对人肝细胞癌细胞株（HepG2）EGFR基因的mRNA表达抑制效果及对细胞凋亡的作用。结果：HepG2细胞EGFR基因的mRNA被明显抑制并伴有凋亡增加。结论：含有与EGFR基因序列相同序列RNA质粒对EGFR基因的RNA干扰可能是治疗肝细胞癌的一种有效手段。