TNF-α/HIF-1α/VASP途径在肺癌A549细胞增殖和粘附中的作用研究

【目的】 肺癌是目前世界癌症导致死亡排名第一的肿瘤,其中肿瘤细胞的增殖和转移与肺癌的死亡率密切相关。最近的调查显示肿瘤坏死因子-α(TNF-α)与肿瘤的侵袭和转移相关,但是具体的机制仍不清楚。本实验旨在以肺癌A549细胞作为模型,研究TNF-α/HIF-1α/VASP途径在肺癌A549细胞的增殖和粘附中的作用。 【方法】 常规培养A549细胞,用MTT法和adhesion assay分别检测不同浓度的TNF-α对A549细胞增殖和粘附的影响。在随后的实验中采用高浓度的TNF-α刺激(120 ng/mL)作为刺激因素,分别用sh-RNA和pEGFP-C1-VASP敲除或过表达VASP、用siRNA和pEGFP-C1敲除或过表达HIF-1α,MTT法和adhesion assay分别检测细胞增殖和粘附水平,PCR检测HIF-1α和VASP在mRNA表达水平,蛋白质印迹法检测HIF-1α和VASP蛋白的表达。同时采用Luciferase assay 的方法检测HIF-1α与VASP启动子区域结合的状态。 【结果】 (1)高剂量TNF-α可以促进HIF-1α表达,从而下调VASP表达水平,抑制肺癌A549细胞增殖和粘附。(2)与空载质粒pEGFP-C1组相比,瞬时转染VASP过表达质粒pEGFP-C1-VASP后,A549细胞的增殖能力显著增加(P<0.05),粘附能力显著增加(P<0.05)。相反,与Scrambled-shRNA组比较,通过转染VASP shRNA特异性敲降VASP后,A549细胞的增殖能力显著降低(P<0.05),粘附能力显著降低(P<0.05)。(3)选择高浓度TNF-α(120 ng/mL)处理A549细胞24小时后,与空载质粒pEGFP-C1组相比,瞬时转染HIF-1α过表达质粒pEGFP-C1-HIF后,HIF-1α的表达在mRNA 和蛋白水平都显著增加(P<0.05),与此同时VASP的表达在mRNA和蛋白的水平显著降低(P<0.05)。相反,与Scrambled-siRNA组比较,通过转染HIF siRNA特异性敲降HIF-1α后, HIF-1α的表达在mRNA 和蛋白水平都显著降低(P<0.05),与此同时VASP的表达在mRNA和蛋白的水平显著增高(P<0.05)。(4)在给予肿瘤坏死因子-α诱导的细胞中,通过转染HIF siRNA特异性敲降HIF-1α表达后,TNF-α带来的HIF-1α的升高被部分抵消了(P<0.05)。(5)Luciferase assay 的检测结果提示HIF-1α可以与VASP启动子区域结合从而在转录水平上抑制VASP的表达。 【结论】 高浓度TNF-α通过增加HIF-1α的表达,调控并抑制VASP蛋白的表达,从而降低肺癌A549细胞增殖和粘附,从而发挥抗肿瘤的作用。     

NF-κB在感染合胞病毒的人支气管上皮细胞凋亡中作用的探讨

【立论依据】 呼吸道合胞病毒(RSV)易致呼吸道上皮细胞受损凋亡,NF-κB与细胞凋亡密切相关。建立感染RSV的支气管上皮细胞(NHBE)模型,检测NHBE的增值、凋亡情况及NF-κB的转位,阐明NF-κB在感染合胞病毒的人支气管上皮细胞凋亡中的作用,为临床治疗呼吸道疾病提供新的方法和思路。 【设计思路】 建立感染RSV的NHBE模型,检测细胞增值、凋亡情况以及NF-κB是否转位,定性定量地探讨呼吸道合胞病毒(RSV)是否通过诱导NF-κB激活介导人支气管上皮细胞(NHBE)凋亡。 【实验内容】 培养人支气管上皮细胞(NHBE),建立并鉴定RSV感染NHBE的体外细胞模型(用定量RT-PCR法鉴定细胞模型是否成功;设正常组、水相处理组、RSV感染组,MTT比色法检测RSV对NHBE增殖的抑制作用,感染组以不同滴度分为1 000、500、100、50、10 TCID50 5个组,感染12、48、72、96、120 h);用Annexin-V-FITC凋亡检测试剂盒检测RSV诱导体外培养的NHBE的凋亡;以免疫荧光法和蛋白质印迹法检测经RSV处理的人支气管上皮细胞NF-κB的激活和对细胞凋亡的影响。 【材料】 人支气管上皮细胞(NHBE)细胞;RSV A亚型原型株Long株;细胞胞浆胞核蛋白提取试剂盒;Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒;兔抗NF-κB抗体;电泳仪。 【可行性】 (1)呼吸道合胞病毒(RSV)易致呼吸道上皮细胞受损凋亡,NF-κB与细胞凋亡密切相关,感染RSV的人支气管上皮细胞模型容易建立成功。(2)本组成员长期跟随老师进行呼吸合胞病毒、流感病毒的研究,具有一定的科研基础和实验能力。(3)所需试剂、仪器、材料,医学基础实验中心基本都有配备,学校同时具备SPF级实验中心。 【创新性】 (1)首次从NF-κB角度探讨感染RSV的NHBE模型,为临床治疗呼吸道疾病提供新的方法思路。(2)分别使用免疫荧光法和蛋白质印迹法定性与定量检测RSV是否通过诱导NF-κB激活介导NHBE凋亡。     

重组人IL2-MUC1融合蛋白在大肠杆菌中的表达及鉴定

目的：构建表达人IL2-MUC1融合蛋白的工程菌，为制备新型MUC1疫苗提供实验依据。方法：通过PCR方法钓取人IL-2基因片段,将其克隆入pBS-SK-MUC1重组载体中，再将人IL2-MUC1串联基因片段插入原核表达载体pGEX-4T-1。将重组的pGEX-IL2-MUC1转化大肠杆菌BL-21，通过IPTG诱导表达，采用SDS-PAGE 和Western blotting鉴定表达蛋白。结果：经酶切及基因测序证实获得的IL-2基因片段 402 bp及IL2-MUC1基因片段852 bp基因序列正确；构建的pGEX-IL2-MUC1表达载体在BL21大肠杆菌中成功表达GST-IL2-MUC1蛋白，经SDS-PAGE证实其相对分子质量为64 000，与理论预期值相符。Western blotting分析表明该表达产物与抗人MUC1多克隆抗体及抗人IL-2单克隆抗体均具有特异性结合能力。结论：成功构建表达人IL2-MUC1融合蛋白的工程菌，为进一步研究以人MUC1为靶点的新型抗肿瘤疫苗奠定基础。     

KCNE1蛋白胞外肽段功能的研究

【立论依据】 KCNE1/KCNQ1(IKs)为电压依赖性钾离子通道,介导心肌细胞动作电位复极化3期中的IKs电流。KCNE1的突变会造成高致死性的LQT综合症(V型)。KCNE1为通道调控亚基,对通道功能的实现具有重要意义。在其调控下,通道表现为缓慢激活特征,失活速度减慢,并且通道电导率明显增大。KCNQ1单独形成的通道,表现为快速激活和快速失活,通道电导性较小。KCNE1是由129个氨基酸构成的单次跨膜蛋白,分胞外段(N端),跨膜段(M段)和胞内段(C端)。N端包含42个氨基酸,关于该段的功能,研究极少,对其认识仍不全面,仅被报道与蛋白转运有关。本课题主要探究该蛋白N端的功能,研究关于该段可能有的更多的生理功能,并分析该段核心功能区段。 【设计思路】 通过分子技术制备KCNE1的N端缺失突变体,将其分别与KCNQ1共表达:以蛋白质印迹技术获得上述突变体的蛋白表达差异图谱,从而了解各个突变体的蛋白表达差异;以细胞免疫染色方法观察各突变体的亚细胞定位情况,从而了解N端缺失的部位对细胞定位的影响;以全细胞膜片钳技术检测各突变体(与KCNQ1共表达)的通道电流特征,从而了解N端缺失的部位对KCNE1功能的影响。最后,通过以上数据的综合分析评估KCNE1N端的功能,以及N端的核心功能部位。 【实验内容】 KCNE1的N端缺失突变体的制备及其蛋白表达;野生型和突变体(与KCNQ1共表达)的细胞免疫染色;利用全细胞膜片钳技术,获得各缺失突变体与KCNQ1共表达后的通道功能的电生理数据。 【材料】 KCNE1、KCNQ1哺乳动物细胞系表达质粒;哺乳动物表达细胞系HEK293。 【可行性】 缺失突变体制备技术成熟,其他各项实验技术为实验室常用技术;理论基础充分,思路清晰;经文献查证对于KCNE1胞外段功能研究的尚无此类报道,因此该项目具有研究意义。 【创新性】 采用缺失突变体技术,通过多种实验方法从多个角度探讨蛋白特定部位的功能,是首次较深入探讨KCNE1蛋白特定区域的功能,对蛋白功能的深入了解,有助于积累临床治疗的理论依据。     

旋毛虫副肌球蛋白与补体C9结合位点的研究

【目的】 旋毛虫病是呈全球性广泛分布的食源性人兽共患寄生虫病。旋毛虫副肌球蛋白(trichinella spiralis paramyosin,Ts-Pmy)是本课题组首次发现的抗原蛋白。前期研究结果表明,该蛋白通过与补体膜攻击复合物(MAC)组分C9结合,阻碍MAC组装,使虫体逃避补体系统的杀伤。本课题将精确定位Ts-Pmy与补体C9的结合位点,为深入研究Ts-Pmy免疫调节功能奠定基础。 【方法】 将Ts-Pmy分段表达为多个重组截短片段以及合成短肽,利用蛋白质印迹(Western-blot)和斑点印迹(Dot-blot)方法检测截短片段以及短肽与补体C9的结合能力,以定位Ts-Pmy与补体C9的结合位点。通过对Zn²⁺诱导的补体C9聚合反应以及红细胞裂解实验,研究结合位点多肽的功能。进一步制备了抗结合位点多肽的单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb)。在鉴定单抗的亚型、亲和力和特异性的基础上,通过单抗体外结合抑制实验和体内被动免疫保护实验鉴定单抗的功能。 【结果】 精确定位Ts-Pmy与补体C9的结合位点位于Ts-Pmy羧基端14个氨基酸残基的区域,即第866位缬氨酸至第879位甲硫氨酸(VSMGKSLSSKVYVM)。结合位点多肽可抑制Zn²⁺诱导的补体C9聚合反应以及红细胞的细胞溶解反应,具有与全长Ts-Pmy相似的功能。制备的mAb 9G3可与旋毛虫不同发育阶段的天然Pmy和重组Ts-Pmy特异识别,且能够抑制Ts-Pmy与补体C9的结合。通过小鼠尾静脉被动回输mAb 9G3,肌幼虫减虫率可达42.6%。 【结论】 精确定位了Ts-Pmy与补体C9的结合位点,获得的抗结合位点多肽的mAb 9G3是一株具有免疫保护性的抗体。上述研究为抗旋毛虫病疫苗及基因工程抗体的研制提供了精确的分子靶标。     

MiR-101通过靶向RAP1B调节上皮间质转化并抑制乳腺癌的侵袭和转移

【目的】 探讨微小RNA miR-101在乳腺癌细胞转移与侵袭中的功能及靶点。 【方法】 首先通过脂质体转染的方法在MDA-MB-231、BT549和MDA-MB-4355细胞系中瞬时过表达miR-101模拟物,进而通过划痕实验、transwell迁移和侵袭实验来反映细胞运动能力的改变;然后应用荧光素酶报告基因分析技术和蛋白质印迹技术寻找并验证miR-101的靶基因。 【结果】 在功能学上miR-101的过表达可显著抑制MDA-MB-231、BT549和MDA-MB-4355细胞的迁移和侵袭能力(P<0.01);在线软件预测RAP1B和RAB5A是miR-101的潜在靶基因;荧光素酶报告基因分析初步证明RAP1B是miR-101的靶基因;蛋白质印迹从蛋白质水平进一步验证RAP1B是miR-101的靶基因。 【结论】 在乳腺癌中,miR-101可以通过靶向RAP1B抑制细胞的侵袭和转移能力,这是miR-101作为一种特殊的基因调节因子,在乳腺癌的发生发展中起的重要作用之一。     

用Substrate Trapping对PP2C家族未知底物的探究

【立论依据】 蛋白质磷酸化是细胞信号转导的重要调控机制,由蛋白磷酸酶和蛋白激酶协同调控。人体内由100多个酪氨酸磷酸酶和近40个丝氨酸/苏氨酸磷酸酶完成大约2万5千个蛋白的去磷酸化反应,其磷酸酶与底物的作用机制及其选择性是细胞信号转导的核心问题之一。丝氨酸/苏氨酸磷酸酶有十分重要的作用,而许多底物仍然未知,所以我们主要研究此类磷酸酶。PPM1A是金属离子依赖性蛋白磷酸酶,属于丝氨酸/苏氨酸磷酸酶中的PP2C家族,目前已经有人对其进行了一些研究,因此我们将PPM1A作为本课题的切入点。 【设计思路】 首先,本课题将对PPM1A的催化机制及底物特异性进行研究。然后,基于对PPM1A催化机理的阐明,本课题将发明一种全新的底物陷阱技术——substrate trapping,从而为整个PP2C磷酸酶家族底物的阐明带来革命性的变化。我们将利用这种新发展的底物陷阱技术,发现重要的PP2C磷酸酶家族成员,如PPM1D和PPM1G的未知底物。Substrate trapping是一种发现酶的未知底物的新方法。由于酶与底物反应迅速,没有充足的时间捕捉底物的信息,而酶的“陷阱突变体”可以结合底物但不水解底物,即底物亲和力、底物特异性不变,但催化活性降低,从而可以帮助我们找到未知底物。 【实验内容】 (1)构建PPM1A的不同突变体,用小分子底物pNPP和短肽分别进行酶学分析,找到trapping mutant;(2)GST pull down验证找到的突变体的可行性;(3)将PPM1A的研究方法推广到PPM1D和PPM1G,进行酶学分析、免疫沉淀、质谱分析、GST pull down验证,从而找到未知底物。 【材料】 大肠杆菌 pNPP 分子筛 PCR试剂 浓缩柱 酶标板 多肽底物等。 【可行性】 (1)已探索出一种PPM1A的突变体,对底物的特异性和亲和力不变,但催化活性很弱。(2)已表达纯化出PPM1D和PPM1G的部分突变体,并进行了酶学分析。 【创新性】 (1)揭示PPM1A最基本的催化机制与酶学特性;(2)首次在丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶家族中提出底物陷阱分子技术,在未来科研与临床应用中拥有广阔的前景。     

凋亡抑制蛋白ILP-2对乳腺癌细胞MCF-7氧化应激损伤的保护作用

【立论依据】 文献表明氧化应激会损伤体内核酸等生物大分子物质而促进肿瘤的发生发展;凋亡抑制蛋白ILP-2在生长中的乳腺癌有高表达,由此,我们猜想乳腺癌中高表达的ILP-2可能与氧化应激的损伤作用存在联系 【设计思路】 实验以乳腺癌细胞株MCF-7制备氧化应激的细胞模型,研究氧化应激状态下MCF-7内ILP-2的表达情况;RNAi ilp-2基因表达,分析ILP-2与氧化应激损伤之间的关系 【实验内容】 利用H2O2对乳腺癌细胞株MCF-7进行氧化应激造模,流式细胞术(flow cytometry, FCM)检测细胞内活性氧簇(reactive oxygen species,ROS),分光光度法检测丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)水平;通过瞬时转染敲低MCF-7 ilp-2表达,利用RT-PCR和蛋白质印迹法检测基因和蛋白质表达情况;干扰细胞ilp-2表达并同时进行氧化应激处理,通过MTT、Scratch、FCM等方法检测细胞的存活状态 【材料】 乳腺癌细胞株MCF-7,H2O2,转染试剂,RNeasy Mini Kit,QuantiFast Probe Assay,RIPA 裂解液,一抗,二抗,ROS试剂盒,GSH试剂盒,MDA试剂盒,MTT试剂盒等。 【可行性】 该研究内容所需技术在生物分子研究领域已经非常成熟,所需设备完善,可操作性强 【创新性】 首次研究ILP-2促癌细胞生长作用与氧化应激损伤之间的关系,为进一步阐明ILP-2的作用机制奠定基础。     

致婴幼儿腹泻星状病毒非结构蛋白诱导宿主细胞凋亡的分子机制

星状病毒(human astrovirus,HAstV)是导致婴幼儿腹泻的重要病原体,发病率高,易造成群体感染,威胁公共卫生安全。目前HAstV导致腹泻的致病机制尚不明确。本研究前期工作基础表明HAstV非结构蛋白nsP1a能够诱导细胞凋亡,是病毒诱发腹泻的主要原因。基于前期研究结果,本研究以nsP1a蛋白为研究对象,深入探讨nsP1a诱导细胞凋亡的能力及信号通路,并筛选鉴定nsP1a蛋白诱导细胞凋亡的关键结构域。【立论依据】 文献表明,病毒诱导的腹泻大多与小肠上皮细胞凋亡密切相关。前期研究表明HAstV野毒株能诱导Caco-2细胞凋亡,非结构蛋白nsP1a起到主要作用。基于前期实验结果,本研究深入开展nsP1a诱导Caco-2凋亡的分子机制研究。 【设计思路】 以nsP1a蛋白为研究对象,探讨nsP1a蛋白诱导细胞凋亡的分子机制,明确nsP1a蛋白诱导的凋亡是通过何种途径发挥作用;筛选鉴定nsP1a蛋白促凋亡作用的关键结构域。 【实验内容】 构建nsP1a蛋白真核表达载体转染宿主细胞,建立稳定表达细胞株。采用流式细胞技术检测蛋白诱导细胞凋亡的能力。实时定量及蛋白质印迹法检测细胞caspase3、caspase8、caspase9、FADD蛋白、Bcl-2、Bax的表达变化。综合分析受体途径和线粒体途径参与诱导细胞凋亡的机制。构建nsP1a蛋白不同位点的删除突变体,流式细胞仪分析筛选nsP1a蛋白中诱导细胞凋亡的主要结构域。 【材料】 载体pEGFP-N3,Caco-2细胞, Lipofectamine 2000, caspase3、6、8、9,细胞色素C、FADD、PARP、LaminA/C,EGFP抗体等。 【可行性】 本研究由国家自然基金青年基金项目(81201285)及辽宁省大学生创新创业训练计划项目(201210160005)支持。 【创新性】 本研究内容国内外未见报道。本研究为探明nsP1a蛋白参与的星状病毒致腹泻机制提供理论依据,同时也为星状病毒抗腹泻药物的筛选提供有效靶点。     

JAM-A表达与肺腺癌侵袭转移的关系及机制

【立论依据】 JAM-A是上皮细胞紧密连接结构的重要成分,在紧密连接装配、白细胞迁移、血小板活化和血管生成等细胞过程中发挥重要作用,参与调节炎症反应,并与细胞极性和渗透性的调节有关。目前发现JAM-A参与肿瘤的进展过程,其过量表达可能与患者的不良预后有关。但JAM-A在肿瘤进展中的功能尚存争议,JAM-A在肺腺癌中侵袭和转移中作用及机制尚未阐明。 【设计思路】 本实验在组织、细胞和动物三个层面探究肺癌中JAM-A蛋白在肺腺癌侵袭、转移和预后中的作用,证实JAM-A过表达促进肺腺癌进展。 【实验内容】 (1)组织实验:量子点免疫荧光检测200例肺腺癌组织JAM-A表达,观察JAM-A表达情况与临床病理因素及预后的关系。(2)细胞实验:培养人肺腺癌细胞A549和人正常肺上皮细胞BEAS-2B,①用siRNA分别转染细胞系使JAM-A基因沉默;②质粒转染细胞系建立JAM-A基因高表达的模型;③对两个系列的肺腺癌细胞和正常肺上皮细胞均用共聚焦显微镜、蛋白质印迹法和直接测定TER观察细胞紧密连接结构变化,Transwell小室方法检测细胞侵袭和迁移能力,MTT法检测细胞增殖能力。(3)动物实验:建立JAM-A(-)裸鼠和正常同种裸鼠构建肺腺癌荷瘤模型,检测肿瘤细胞JAM-A的表达情况并比较两组肿瘤的生物学特征。 【材料】 肺腺癌组织,肺腺癌细胞系,JAM-A(-)裸鼠,JAM-A抗体,质粒转染试剂盒,量子点试剂盒等。 【可行性】 前期工作已明确JAM-A在肺腺癌中表达与一些临床病理参数相关。指导教师课题组一直从事肿瘤侵袭转移机制研究并取得一定成绩,本组成员有较扎实的基础理论知识以及较熟练的实验操作技能。 【创新性】 (1)探讨肺腺癌组织中JAM-A表达与临床病理参数及预后的关系。(2)证实JAM-A过表达与肺腺癌的侵袭转移有关,并探究其机制。     

维甲酸诱导基因I对氧固醇7α羟化酶的调控作用研究

【立论依据】 基因芯片结果显示,敲除维甲酸诱导基因I(RIG-I)的小鼠体内氧固醇7α羟化酶(下文称CYP7B1)基因水平发生变化,说明两者存在慢反应联系,本实验目的旨在探究这两个基因之间是否存在直接调控的快反应联系。 【设计思路】 本实验首先需要对基因芯片的结果进行确定,随后通过多种方式改变RIG-I的表达水平(干扰素刺激、质粒转染等),观察CYP7B1是否存在明显的协同表达变化。如果能确定两者之间确实存在直接调控关系,将进一步探究调控的具体机制,从分子水平阐释调控的环节。 【实验内容】 利用real-time PCR检测基因芯片结果;利用IFNγ上调RIG-I表达水平,并运用real-time PCR检测CYP7B1的表达水平变化;构建载有RIG-I基因的质粒并进行质粒转染,运用real-time PCR和蛋白质印迹法检测CYP7B1的基因表达和蛋白表达变化情况;转染RIG-I promoter,探究其调控CYP7B1的具体机制。 【材料】 细胞:293T细胞、Hela细胞、HepG2细胞等;其他:RIG-I、CYP7B1引物、一抗、二抗及其他常规所需试剂。 【可行性】 预实验中已经确定了RIG-I与CYP7B1间存在慢反应调控关系,同时也确定了相关文献中IFN-γ对RIG-I的上调作用,实验器材、试剂齐备。 【创新性】 本实验首次提出RIG-I基因与CYP7B1及其所参与的脂代谢过程有调控关系,对胆固醇代谢、神经甾体代谢、及CYP7B1缺乏所引起的一系列疾病的研究也可以提供一定的实验依据和理论支持。     

探究3C蛋白酶切割p51在B组柯萨奇病毒致病毒性心肌炎中的作用

【立题依据】 B组柯萨奇病毒(CVB)是病毒性心肌炎的主要病原体,可引发扩张型心肌病,尚无治疗药物。CVB的3C蛋白酶切割前体蛋白形成结构蛋白,完成病毒复制,也通过切割宿主蛋白发挥致病作用。我们发现宿主细胞中一个长约51kDa的蛋白质(其功能尚不清楚,暂称为p51)有3C蛋白酶的特异性酶切位点,推测p51是CVB的作用靶点之一,3C蛋白酶切割p51可能是CVB致病的新机制。 【设计思路】 通过蛋白质过表达和沉默等分子生物学技术,在细胞和动物实验中证实CVB 3C蛋白酶可以切割p51,并通过通过切割p51发挥致病作用。 【实验内容】 本实验设计通过以下4方面研究CVB通过其3C蛋白酶切割p51致病的作用机制:(1)构建真核表达载体质粒pEGFP-p51;(2)细胞实验确定3C蛋白酶通过特异性位点切割p51;(3)细胞实验确定CVB通过3C蛋白酶切割p51发挥致病作用;(4)动物实验确定3C蛋白酶可以切割p51并在CVB致病毒性心肌炎中发挥作用。 【材料】 HeLa细胞;Balb/c小鼠;CVB3,嗜心肌CVB3 H3株;质粒:pEGFP-C1,pEGFP-2A,pEGFP-3C;干扰RNA:通过商业渠道购买。 【可行性】 本实验设计有充分依据表明p51有CVB 3C蛋白酶的酶切位点,CVB可能通过3C蛋白酶切割p51发挥致病作用,从而导致病毒性心肌炎和扩张型心肌病。 【创新性】 通过本实验,我们可能揭示CVB致病的新机制,能够更加全面地了解CVB致病毒性心肌炎的分子机制,为研发抗CVB药物提供新靶点,为临床治疗提供新方向,有广泛的应用前景。     

具有抗氧化活性的含硒短肽的研制

【立论依据】 硒蛋白是微量元素硒发挥生物学功能的主要形式。人体中硒蛋白在抗氧化、抗肿瘤和调节免疫等方面都具有显著的作用,其中抗氧化活性是多种硒蛋白最核心的生物学功能。研制一种具有潜在应用价值的、类似于硒蛋白的抗氧化活性的含硒短肽具有重要意义。 【设计思路】 选取抗氧化活性最强的硒蛋白如硒蛋白P、谷胱甘肽过氧化物酶等,设计出3~5种含硒代半胱氨酸活性中心的硒蛋白截短型的短肽,根据硒蛋白基因表达的特殊性构建其表达载体及其哺乳动物细胞表达体系,实现此类含硒短肽的准确、高效的翻译,再通过抗氧化检测筛选出具有应用开发价值的短肽。 【实验内容】 (1)用于硒蛋白基因工程表达的哺乳动物细胞株的建立:选择在人类硒蛋白翻译过程中将编码硒代半胱氨酸密码子TGA正确解码时起着重要作用的3个反式作用因子,即SECIS 结合蛋白2(SBP2)、Sec特异延伸因子(EFSec)和核糖体蛋白L30(RPL30),将它们的编码基因分别克隆并构建为1个三基因表达载体pcDNA3.1-SBP2/Efsec/RPL30,稳定转染HepG2细胞系获得目的基因高表达的单克隆细胞株;(2)利用生物信息学的方法,筛选和设计硒蛋白截短型的短肽,并将其编码基因插入真核表达载体pcDNA4HisMaxB获得相应的重组载体;(3)利用各重组载体分别对已建立的转基因细胞株进行稳定转染,使目的基因表达并纯化获得含硒短肽;(4)利用常规的抗氧化检测方法,考察各种含硒短肽体外抗氧化活性,并筛选出最佳者用于后续研究。 【材料】 人肝癌细胞系HepG2;质粒pcDNA3.1、pcDNA4HisMaxB;各种基因工程工具酶及常规试剂;细胞培养及转染试剂;抗氧化检测试剂盒等。 【可行性】 硒蛋白复杂的翻译机制已经逐渐阐明,在原核生物细胞中利用反式作用因子提高硒蛋白表达已取得成功,为真核表达提供重要的启示,我们的设计在理论上是可行的;实验室相关技术方法及条件成熟,完全可满足本研究的要求。 【创新性】 具有抗氧化活性的硒蛋白分子量大限制了其药用价值,我们研究中将获得截短型的含硒短肽从而使其具有应用开发价值。此外,应用3个反式作用因子构建硒蛋白基因工程表达体系也是本研究的一个创新。     

硫化氢抑制高血压中枢炎症的作用研究

【立论依据】 延髓头端腹外侧区(RVLM)、孤束核(NTS)和室旁核(PVN)是中枢调节交感活动的主要核团。研究提示,高血压患者的血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)和血管紧张素受体1(AT1R)的含量明显上升,AngⅡ诱发的神经炎症使小胶质细胞激活,而小胶质细胞激活后分泌的炎症因子如肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素-1(IL-1)和白介素-6(IL-6)能直接或间接地增强交感神经元兴奋性,引起血压升高。硫化氢(H₂S)作为一种新型气体信号分子具有广泛的生物学作用。外周的研究提示,H₂S降低血压的效应与舒张血管平滑肌有关,而H₂S的中枢血压调节作用与炎症有关,但具体的作用机制尚不清楚。因此,本课题总体研究目标是明确H₂S是否通过抑制AngⅡ诱发的中枢神经炎症而抑制高血压的交感亢进和降低血压。 【设计思路】 对原发性高血压大鼠(SHR)腹腔注射GYY4317(H₂S缓释剂),观察H₂S对交感活动和血压心率的影响。测定TNF-α、IL-1和IL-6的含量,明确心血管活动是否与抑制中枢炎症有关,并由细胞水平探究H₂S是否通过降低AT1R或AngⅡ抑制神经炎症。 【实验内容】 (1)观察H₂S对SHR的血压和交感活动影响:测定血压和心率及NE含量; 测定肾交感神经活动。(2)观察H₂S对SHR的神经炎症的效应:测定RVLM、PVN和NTS的炎症因子含量。(3)通过小胶质细胞明确H₂S抗炎机制:检测AngⅡ和AT1R的状态及水平;检测P38/MAPK的水平。 【材料】 SHR大鼠; WKY大鼠; 小胶质细胞;GYY4317等药品。 【可行性】 (1)课题组两人于2012年开展实验,已掌握PCR和整体实验等技术,具备完成课题能力。(2)第二军医大学生理教研室具有实验所需的设备,可保证实验的顺利实施。(3)王伟忠教授长期从事心血管活动中枢调控机制研究,可给与理论和技术的指导。 【创新性】 (1)本课题从神经炎症和中枢Ras系统参与高血压交感亢进出发,首次探索H₂S通过中枢Ras系统对神经炎症的影响机制,明确其在改善高血压交感亢进的意义。(2)H₂S作为一种新型的气体信号分子,表现出明显抗炎和降压效应,但具体作用通路,特别是中枢降压途径尚未明确,本课题着眼于H₂S在慢性动物实验、急性动物实验和细胞实验的抗炎机制,探索H₂S对血压调控的作用途径。     

hSesn1基因真核表达载体构建及蛋白的表达和定位

目的 构建人源的Sesn1真核表达载体同时检测融合蛋白在COS-7细胞系内的表达和定位。方法 提取工具细胞系HeLa的mRNA,进而反转录成为cDNA。聚合酶链反应方法扩增人源Sesn1基因的cDNA全长片段,将其克隆于pEGFP-C1真核表达载体中。进一步将已构建好的重组表达载体进行双酶切以及测序鉴定,继而转染到工具细胞系COS-7中,进行Western blot方法检测。最后应用激光共聚焦扫描显微镜方法来观察pEGFP-hSesn1在COS-7细胞中的定位情况。结果 hSesn1基因cDNA全长片段克隆至pEGFP-C1真核表达载体中,酶切鉴定片段大小为1479bp,测序证实成功。Western blot方法检测出GFP-hSesn1融合蛋白的成功表达,分子质量（Mr）约为80kDa。pEGFP-hSesn1在COS-7于细胞中主要定位在细胞质及核周。结论 成功构建了pEGFP-hSesn1真核表达载体,进而检测到融合蛋白的表达,并且在COS-7细胞中主要定位于核周及细胞质。     

姜黄素对肌腱钙化及退变治疗作用的研究

【立论依据】 肌腱病是一种常见的软组织疾病。从事剧烈运动的职业选手跟腱发病高达29%,人群中前臂伸肌肌腱病达1%,而其关键的发病机制尚不明确,且缺乏有效的临床治疗方法。姜黄素作为一种传统中药,据Blood、Nature等权威期刊刊登的研究报道具有抗炎、抗氧化、抑制癌症发生、缓解老年痴呆、促进炎症下肌腱细胞体外表型的维持的作用。我们实验室发现,在炎症环境下的肌腱细胞中,HIF-2a高表达。 【设计思路】 首先研究姜黄素在炎症环境下对肌腱细胞钙化的抑制作用和促肌腱组织表观维持能力,然后用微针给动物模型给药,观察姜黄素对肌腱病小鼠模型的治疗效果。在此基础上,进一步探讨姜黄素功能的相关机制。 【实验内容】 (1)取Scx-GFP小鼠跟腱组织培养,设置空白组、IL-1组、IL-1与姜黄素组,培养1、2、3 d后,分别使用激光共聚焦显微镜观察细胞存活及Scx阳性肌腱细胞的比率;(2)将肌腱干细胞进行骨诱导,设置空白组、IL-1组、IL-1与姜黄素组,运用茜素红(ARS)染色观察钙沉积,并使用real-time PCR、蛋白质印迹法检测Runx2等基因的表达;(3)构建小鼠肌腱病模型, 5只小鼠做为空白组,15只小鼠用微针给予不同浓度的姜黄素治疗。一段时间后,运用X-ray、组织学等手段分析其疗效;用Q-PCR检测HIF-2a信号在各组小鼠肌腱细胞的信号强度。 【材料】 分析纯姜黄素;SCX-GFP小鼠;IL-1β;胶原蛋白酶;Hif-2α引物;染色剂:茜素红,DAPI;聚乙烯吡咯烷酮缓释姜黄素微针等。 【可行性】 前期实验结果:(1)初步明确了姜黄素处理可促进炎症下肌腱组织的存活和表观维持;(2)初步发现姜黄素可抑制炎症下肌腱细胞的钙化;(3)发现Hif-2a在炎症下肌腱细胞中高表达。 【创新性】 (1)老药新用,首次发现姜黄素在肌腱病上的治疗效果,为其提供新药物;(2)用微针进行肌腱部位给药简单、方便、高效、无害;(3)为姜黄素治疗神经退行性等疾病提供新的机制,有助于阐释已知作用和发现未知作用。     

SHP2/Hook1通过上皮间质转化调控肺肿瘤转移的机制研究

【立论依据】 肿瘤转移是肿瘤患者死亡的最主要原因,而上皮间质转化在肿瘤转移的起始过程中发挥重要作用。原癌基因ptpn11表达的蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2在多种肿瘤中存在突变或高表达现象,提示SHP2参与肿瘤的发生与进展。本项目的前期研究发现SHP2促进上皮间质转化过程,且需要其酶活性的参与;新发现的SHP2相互作用蛋白Hook1在上皮间质转化中具有相反的抑制作用,而Hook1与SHP2的催化结构域结合。 【设计思路】 本项目对Hook1是SHP2的内源酶抑制剂这一假设进行研究,并探究SHP2与Hook1形成的蛋白复合物通过调节上皮间质转化过程影响肺肿瘤转移的可能性。 【实验内容】 (1)原核表达与纯化带有His标签的SHP2和Hook1蛋白,通过测定SHP2蛋白磷酸酶的活性探讨Hook1能否抑制SHP2的酶活性;(2)定量PCR、蛋白质印迹方法比较侵袭能力不同的肺上皮细胞中SHP2和Hook1在mRNA与蛋白水平上的差异;(3)miRNA干扰或过表达方法改变两种蛋白的表达水平,观察其对肿瘤细胞的迁移及侵袭能力的影响;(4)构建破坏SHP2与Hook1相互作用的截短或点突变质粒,探究Hook1对上皮间质转化以及细胞侵袭的影响是否需要SHP2的参与;(5)体内实验验证改变SHP2或Hook1的表达是否影响肿瘤细胞在小鼠体内的成瘤能力。 【材料】 原核表达质粒PET21a,His亲和纯化树脂,非小细胞性肺癌细胞株A549,SHP2siRNA,pCDNA3.1-SHP2及突变体表达载体,Hook1siRNA,pCDNA3.1-Hook1及突变体表达载体,抗SHP2、Hook1抗体,4组(每组9只,共36只)NOD/SCID小鼠。 【可行性】 前期研究发现SHP2的蛋白酪氨酸磷酸酶活性能够促进肺上皮细胞的上皮间质转化过程;SHP2的催化结构域相互作用蛋白Hook1则抑制上皮间质转化过程。在此基础上我们推测SHP2和Hook1通过上皮间质转化从而对肿瘤的转移产生影响,并且Hook1的作用需要SHP2的参与。故本研究具有较强的可行性。 【创新性】 新发现的与SHP2催化结构域相互作用的Hook1有可能成为首个SHP2的内源抑制蛋白。明确SHP2/Hook1复合物在上皮间质转化以及肿瘤转移中的作用,有助于认识SHP2与肿瘤转移的关系,所揭示的分子机制有望为肿瘤转移的早期诊断及临床治疗提供新的潜在靶点。     

魔芋提取物对大鼠胃溃疡的治疗作用及其机制研究

【立题依据】 魔芋的主要成分为魔芋葡甘聚糖,且吸水后具有凝胶性质。国内外有研究表明魔芋葡甘聚糖具有促进消化道黏液分泌,抗炎,抗氧化,促进细胞增生,抗癌等作用,据此提出本研究假设:魔芋提取物通过其抗炎,促增生,促黏液分泌及抗凋亡作用可以在胃溃疡的损伤修复和治疗过程中发挥较好的作用,且其机制可能与EGF-EGFR信号通路有关。 【设计思路】 采用大鼠胃溃疡模型,比较不同剂量的魔芋粉治疗组、EGFR阻断剂AG1478联合不同剂量魔芋治疗组和对照组之间的胃溃疡损伤与细胞增生修复的程度差异,以此证实魔芋提取物对于胃溃疡具有治疗作用,且初步明确其作用机制。 【实验内容】 (1)模型建立:采用无水乙醇灌胃诱发急性胃溃疡大鼠模型。(2)给药处理:实验设正常对照组,胃溃疡模型组,自然恢复组,低、中、高浓度魔芋粉治疗组,AG1478对照组,低、中、高浓度魔芋粉联合AG1478治疗组。(3)取材检测:给药5 d,断食不断水1 d后处死大鼠,采血,分离血清;取最大溃疡边缘胃组织,分别进行相关蛋白检测和制备石蜡切片备用。(4)实验观察:形态学观察胃黏膜损伤指数(UI),胃黏液变化,组织病理改变;ELISA法检测血清TNF-α、IL-8含量;免疫组织化学法染色进行PCNA表达检测;蛋白质印迹检测EGF、EGFR、BCL-2蛋白、Bax蛋白、K-ras蛋白表达情况。 【材料】 SD大鼠,魔芋粉,阿尔新蓝染液,AG1478,及TNF-α、IL-8、EGF、EGFR、BCL-2、Bax、K-ras等相关检测试剂盒。 【可行性】 (1)学校具备完善的配套仪器设备是本实验研究顺利开展的有力保障。(2)实验所用药品及试剂盒均可直接购得。(3)通过前期实验准备,本团队已掌握研究所需的实验技术。(4)前期预实验结果表明,魔芋提取物治疗后,胃黏液量及中性胃黏膜比例增加,炎症因子减少,细胞增殖增加,这与本研究假设相符合,提示本实验有较好的研究前景。 【创新性】 目前国内外对魔芋的药用研究较少,本研究则根据魔芋抗炎,促增生,促黏液分泌及抗凋亡等功效,首次将其应用于胃溃疡治疗并探讨其作用机制,具有较强的创新性。     

自分泌促炎因子在肿瘤化疗耐药中的作用

【目的】 顺铂和依托泊苷联合化疗(EP)是临床常用的针对肺癌的化疗方案。但长期应用EP后,其药效减弱,产生多药耐药,影响疗效。并有文献报道,某些促炎因子在多药耐药中发挥着作用。本课题旨在探究EP诱导的化疗耐药机制,找出潜在的多药耐药作用靶点。 【方法】 (1)基础实验:选用NCI-H446和A549肺癌细胞系,DDP处理后进行细胞克隆形成实验,发现在CM培养条件下,两种细胞耐药性形成。以此为基础进行设计。用TNF-α、EP、CM、TNF-α抑制剂分别或共同处理H446和A549细胞,通过光镜、流式细胞术、台盼蓝细胞计数来明确细胞存活情况。用TNF-α处理后通过蛋白质印迹和real-time PCR法检测ABCG2、MRP2、Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1的表达,再用TNF-α siRNA进行干扰,用real-time PCR检测。先用蛋白质印迹法检测两种细胞中磷酸化ATM和磷酸化IkB-a的表达情况,再用TNF-α处理,通过蛋白质印迹和共聚焦显微检测,确定磷酸化ATM、磷酸化p65和磷酸化IkB-a的表达。用TNF-α、ATM抑制剂、NF-κB抑制剂分别和(或)共同处理细胞,通过蛋白质印迹和confocal来确定磷酸化ATM、磷酸化p65、磷酸化IkB-a、ABCG2、MRP2、Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1的表达。通过siRNA干扰ATM、p65,再用蛋白质印迹和real-time PCR来确定这些蛋白的表达。(2)临床实验:通过回顾性分析,取小细胞肺癌和非小细胞肺癌患者的癌组织和癌旁组织,通过免疫组化检测TNF-α的表达情况。再结合患者的预后,进行数据分析,探究患者TNF-α表达和预后之间的关系。 【结果】 DDP处理的细胞克隆实验发现,在CM培养条件下,NCI-H446和A549两种细胞耐药性比DDP组明显,说明两种细胞耐药性形成。 【结论】 CM中含有的某一细胞因子(TNF-α)能够诱导NCI-H446和A549两种肺癌细胞耐药性形成,为治疗肺癌多药耐药提供新的可能的治疗靶点。     

MUC1在喉癌中的表达及临床意义

目的 研究MUC1黏蛋白在喉癌组织中的表达及其与喉癌患者临床病理资料之间的关系。方法 运用免疫组化染色及评分、荧光定量PCR方法检测51例喉癌组织及20例声带息肉组织中MUC1的表达差异,分析MUC1表达水平与喉癌患者临床病理指标之间的关系。结果 免疫组化结果显示,在51例喉癌组织中MUC1阳性率66.7%（34/51）,其中包含“-”17例,“+”9例,“++”11例,“+++”14例;在20例声带息肉组织中,MUC1蛋白的阳性表达率35.0%（7/20）,其中包含“-”13例,“+”4例,“++”2例,“+++”1例,喉癌组织的MUC1表达水平显著高于正常声带息肉组织（P<0.05）;荧光定量PCR检测结果显示,在喉癌组织中MUC1 mRNA的表达水平高于声带息肉组织,差异具有统计学意义（P<0.05）。MUC1的表达与喉癌患者的T分级、临床分期及淋巴结转移有关（P<0.05）,而与患者年龄、性别及分化程度无相关性（P>0.05）。结论 MUC1在喉癌中可能起到促进癌症进展的作用,患者的MUC1表达水平可能与其预后有关,具体机制有待于更深入的研究。