抑制SIRT2介导的心肌程序性坏死改善衰老心肌的缺血耐受

【立论依据】 衰老心肌对缺血/再灌注(I/R)损伤的耐受力显著降低。并且,坏死是I/R心肌死亡最主要的病理途径,但以往认为心肌坏死不可调控。最新发现SIRT2介导的RIP1去乙酰化是触发程序性坏死(Necroptosis)这一可调控性细胞坏死的关键机制。 【设计思路】 本研究以成年和老年组为对比,结合基因和药理学干预,从整体,器官,细胞,分子四个水平进行功能验证, 旨在探讨衰老状态下SIRT2介导的心肌Necroptosis是否是老年心肌缺血损伤加重的新机制。 【实验内容】 采用成/老年C57小鼠建立整体心肌I/R(30 min/4 h)模型。分别于基础状态和I/R后检测各组心肌SIRT2表达水平及其活性;RIP1的乙酰化水平。采用免疫共沉淀方法检测RIP1-RIP3复合物(necrosome)水平;免疫组化方法检测下游分子MLKL的质-膜转位;再灌注后测定心肌梗死面积。采用成年SIRT2 KO和RIP3 KO小鼠建立心肌I/R平行实验,分析SIRT2介导的促坏死在心肌缺血易损中的关键作用。进而,采用心肌点注射腺病毒或siRNA 上调/下调成年和老年心肌SIRT2的表达,在整体水平明确衰老状态下心肌SIRT2对I/R心肌Necroptosis以及心肌损伤的影响。运用离体心脏灌流结合SIRT2特异阻断剂AGK2和Necroptosis抑制剂nec-1,建立成/老年小鼠离体心脏I/R模型。在器官水平探讨干预SIRT2介导的Necroptosis能否抑制衰老心肌死亡。再则,建立体外心肌细胞缺氧/复氧(H/R)模型,使用AGK2或nec-1处理细胞;采用细胞动缘探测系统观察单心肌细胞收缩舒张功能;流式细胞仪检测PI和Annexin V双阳性细胞定量检测心肌Necroptosis程度与细胞存活率。在细胞水平阐明干预SIRT2介导的Necroptosis促进衰老心肌存活的分子机制。 【材料】 成年(4个月龄)及老年(22个月龄)C57小鼠。 【可行性】 老年组I/R心肌SIRT2活性显著增高,RIP1乙酰化水平随之降低,necrosome水平升高,MLKL细胞质-膜转位增加(均P<0.05)。离体灌流实验发现,AGK2可有效抑制老年I/R心肌SIRT2活性,减小老年组心肌损伤。心肌细胞实验显示,抑制SIRT2介导的Necroptosis可提高H/R后心肌存活率(均P<0.05)。现有的实验结果表明本设计切实可行。 【创新性】 我们有望首次证实:SIRT2介导的Necroptosis加重是老年心肌缺血易损性增加的重要原因;针对性的抑制心肌SIRT2可显著改善衰老心肌抗I/R损伤能力。本研究将为降低老年缺血性心脏病患者的心肌损伤提出新的干预靶点。     

去乙酰化酶SIRT1调控PFOA诱导小鼠肝损伤的作用及机制研究

【立论依据】 流行病学调查发现,全氟辛酸(PFOA)和人类多种疾病密切相关。我们前期研究发现PFOA可通过氧化应激、炎症反应和诱导凋亡引起小鼠肝脏毒性损伤。去乙酰化酶SIRT1在细胞应激反应中具有关键作用,可引起多种转录因子去乙酰化,从而促进细胞存活,抑制凋亡。因此,我们提出:“SIRT1的去乙酰化修饰可能对PFOA诱导的小鼠肝损伤起保护作用”。 【设计思路】 在前期研究的基础上,探讨PFOA肝脏毒性与SIRT1表达和反应活性的相关性;利用SIRT1激活剂以及SIRT1抑制剂观察SIRT1信号通路对PFOA诱导的肝脏毒性损伤的调控作用;通过检测P53、NF-κB p65 和FOXO3a的表达和乙酰化水平,分析SIRT1系统调控PFOA肝脏毒性的分子机制,是否与SIRT1对P53、NF-κB p65 和FOXO3a的去乙酰化修饰有关。 【实验内容】 (1)Real-time PCR和蛋白质印迹方法检测SIRT1的表达,免疫共沉淀法检测SIRT1的反应活性,对比正常对照和PFOA染毒小鼠,明确PFOA肝脏毒性与SIRT1的相关性;(2) PFOA染毒小鼠给予SIRT1激活剂SRT1720以及SIRT1抑制剂尼克酰胺,石蜡切片HE染色观察肝组织病理学改变;全自动生化分析仪检测ALT、AST、ALP及LDH的血清水平;酶联免疫分析IL-6、COX-2及CRP的肝组织水平;免疫组化检测DNA氧化损伤标志物8-OHdG的产生;比色法检测MDA生成及SOD、CAT和GSH-PX的活性;TUNEL染色法观察细胞凋亡;real-time PCR和蛋白质印迹方法检测Bcl-2、Bax、Fas、FasL等凋亡相关基因的表达,明确SIRT1通路的激活或抑制对PFOA诱导肝脏损伤的调控作用;(3)应用乙酰化赖氨酸抗体通过蛋白质印迹方法检测P53、NF-κB p65 和FOXO3a的乙酰化水平,分析SIRT1是否通过对P53、NF-κB p65 和FOXO3a的去乙酰化修饰调控PFOA诱导的肝脏毒性损伤。 【材料】 本项目以小鼠为实验动物,实验仪器包括实时荧光定量PCR仪、全自动DNA扩增仪、紫外可见分光光度计、石蜡切片机、高速低温离心机、蛋白电泳系统、电转仪、全自动生化分析仪等。 【可行性】 本项目充分分析了国内外研究现状和发展前景,并取得了较好的前期研究基础。 【创新性】 SIRT1对PFOA肝脏毒性的调控作用尚未见报道,本实验项目研究SIRT1对PFOA诱导肝损伤的保护作用及其分子机制,为预防和治疗全氟化合物引起的肝脏损伤寻找新靶点。     

Klotho对脊髓继发性损伤的调节作用及机制研究

【立论依据】 脊髓损伤(SCI)后,病灶区炎症反应、氧化应激、神经细胞凋亡所引起的继发性损伤是创伤后神经功能障碍和影响修复再生的主要原因。已知,Klotho基因缺失鼠(KL-/-)的表型类似人类的衰老表现,包括寿命缩短、动脉硬化、皮肤肌肉萎缩、认知障碍、运动神经元受损、软组织钙化、听力下降、骨质疏松等,但Klotho在中枢神经损伤领域的研究,还知之甚少。 【设计思路】 本项目将发现klotho对脊髓损伤修复的调节作用,明确klotho通过调节氧化应激及细胞凋亡的作用,阐明klotho对中枢神经系统损伤修复的调节机制。 【实验内容】 确立Klotho过表达的脊髓损伤动物模型;评估Klotho促进损伤后运动功能恢复的作用;观察神经组织形态学的改变,评估Klotho对神经胶质瘢痕形成的影响;分析ROS、SOD、8-ohdg等氧化应激及细胞凋亡水平,并筛选其作用靶分子,阐明其作用机制。 【材料】 利用干细胞联合基因治疗手段,将骨髓间充质干细胞(BMSCs)作为基因搭载受体,使其过表达klotho基因,并移植到脊髓损伤大鼠模型。 【可行性】 辽宁医学院神经生物学教研室和辽宁医学院神经退行性疾病实验室(辽宁省重点实验室)一直从事神经系统损伤的基础研究,并熟练掌握各种实验技术和方法,并且拥有研究所需的实验场所和设备,因此对完成本课题具有较强的优势。 【创新性】 揭示Klotho对神经细胞的保护作用机制,为研究脊髓损伤的基础研究和新型神经营养药物的研发,提供基础。     

凋亡抑制蛋白ILP-2对乳腺癌细胞MCF-7氧化应激损伤的保护作用

【立论依据】 文献表明氧化应激会损伤体内核酸等生物大分子物质而促进肿瘤的发生发展;凋亡抑制蛋白ILP-2在生长中的乳腺癌有高表达,由此,我们猜想乳腺癌中高表达的ILP-2可能与氧化应激的损伤作用存在联系 【设计思路】 实验以乳腺癌细胞株MCF-7制备氧化应激的细胞模型,研究氧化应激状态下MCF-7内ILP-2的表达情况;RNAi ilp-2基因表达,分析ILP-2与氧化应激损伤之间的关系 【实验内容】 利用H2O2对乳腺癌细胞株MCF-7进行氧化应激造模,流式细胞术(flow cytometry, FCM)检测细胞内活性氧簇(reactive oxygen species,ROS),分光光度法检测丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)水平;通过瞬时转染敲低MCF-7 ilp-2表达,利用RT-PCR和蛋白质印迹法检测基因和蛋白质表达情况;干扰细胞ilp-2表达并同时进行氧化应激处理,通过MTT、Scratch、FCM等方法检测细胞的存活状态 【材料】 乳腺癌细胞株MCF-7,H2O2,转染试剂,RNeasy Mini Kit,QuantiFast Probe Assay,RIPA 裂解液,一抗,二抗,ROS试剂盒,GSH试剂盒,MDA试剂盒,MTT试剂盒等。 【可行性】 该研究内容所需技术在生物分子研究领域已经非常成熟,所需设备完善,可操作性强 【创新性】 首次研究ILP-2促癌细胞生长作用与氧化应激损伤之间的关系,为进一步阐明ILP-2的作用机制奠定基础。     

PTRF介导骨髓间充质干细胞衰老在骨质疏松中的作用及其分子机制

【立论依据及设计思路】 临床上衰老所致的骨质疏松症(OP)没有好的治疗办法,以“干细胞”作为种子细胞的治疗策略为其提供了新的方法。骨髓间充质干细胞(BMSCs)自身衰老可影响其向成骨细胞分化,是衰老所致OP的重要因素。但何种机制参与调控BMSCs 衰老仍不明确。新近研究表明聚合酶Ⅰ转录释放因子(PTRF)介导细胞衰老,但目前暂未见PTRF在BMSCs衰老中作用的报道,我们预实验结果显示PTRF在老龄SD大鼠来源的BMSCs表达偏高。因此提出假说:PTRF可能介导BMSCs衰老在OP中发挥重要的作用,调控PTRF的表达可以通过延缓BSMCs衰老从而抑制OP。为此提出设计思路:(1)明确BMSCs衰老与PTRF有关;(2)证明PTRF介导BMSCs衰老影响成骨分化;(3)在动物模型上验证,输入上调或下调PTRF表达的BMSCs可促进或抑制OP。 【实验内容】 (1)对幼龄及老龄SD大鼠来源BMSCs进行鉴定,比较其PTRF和衰老标志物p21、p53表达以及成骨分化能力;(2)上调或下调PTRF对BMSCs衰老及成骨分化的影响;(3)探讨PTRF是否通过影响成骨分化相关蛋白碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(OPN)的表达从而导致成骨分化异常;(4)在老年性骨质疏松SD大鼠模型上,在体输入上调或下调PTRF的BMSCs,验证其对衰老所致OP的影响。 【材料】 动物:幼龄SD大鼠(5周)、老龄SD大鼠(32周)、雌性SD大鼠(10周);抗体:CD29、CD34、CD44、CD45(用于BMSCs鉴定);PTRF;ALP、OPN等成骨分化相关蛋白抗体;引物:(PTRF、P21、P53);转染相关:PTRF siRNA(慢病毒)、表达载体; 培养相关:成骨培养基;成骨染色试剂:茜素红S。 【可行性】 (1)我们预实验结果显示PTRF在幼龄和老龄SD大鼠来源BMSCs表达存在差异,并且与成骨分化相关。因此本项目的提出具有坚实的实验基础,理论上可行; (2)课题组成员都参与过学校暑期及业余学生科研项目,具有相关实验基础,技术上可行;(3)指导教师从事PTRF相关研究,可提供很好的支持,试剂及设备上可行。 【创新性】 老年化是当今中国社会面临的严重问题,本项目结合干细胞转化研究新进展,从PTRF介导BMSCs衰老影响成骨分化入手,为临床上治疗老年性OP提供一种新的安全有效的靶点。     

丝氨酸缺乏和p53依赖的代谢重构对乳腺癌细胞的影响

【立论依据】 丝氨酸对肿瘤细胞增殖具有重要作用。丝氨酸缺乏可导致肿瘤细胞氧化应激,对其增殖产生抑制。肿瘤抑制基因p53在抗氧化代谢中发挥不可或缺的作用,因此p53可帮助肿瘤细胞耐受丝氨酸缺乏。这与p53的抑癌功能是一对矛盾,利用此矛盾可为肿瘤治疗提供新的思路。 【设计思路】 选取p53突变或缺失的三阴性乳腺癌细胞系,给予丝氨酸缺失的培养环境,观察其增殖情况、相关基因和蛋白表达情况。以p53阳性的乳腺癌细胞和正常培养基作对照 【实验内容】 MDA-MB-157(P53 null)或HCC1937(P53 mutant)分别用不含丝氨酸的培养基(-SG)、加入丝氨酸的-SG、加入丙酮酸和GSH的-SG,进行72 h培养,每24 h用流式细胞仪检测细胞数量、细胞周期和细胞内ROS水平,酶标仪检测抗氧化能力、GSH和GSSG水平,Real-time PCR检测P53、PHGDH的mRNA转录,蛋白质印迹检测p53、PHGDH的蛋白表达。MCF-7(P53 wildtype)作为P53的阳性对照。 【材料】 MCF-7、MDA-MB-157或HCC1937、MEM培养液(HyClone SH30024)、丝氨酸、丙酮酸、GSH,相关的试剂盒和试剂。 【可行性】 已进行预实验,已实践过实验内容中提及的操作,已观察到MCF-7在丝氨酸缺乏时增殖先受抑制后恢复、细胞内ROS水平上升、PHGDH表达上升 【创新性】 p53对肿瘤细胞代谢的影响已成为研究热点。多数肿瘤中近一半存在p53基因的突变,丝氨酸在肿瘤增殖中的重要地位,使得丝氨酸、p53以及相关的信号调节通路和酶可能成为肿瘤治疗的新靶点。     

17-AAG抑制piRNA-PIWI通路对神经母细胞瘤“干性”影响的研究

【理论依据】 piRNA是细胞内三大非编码RNA(nocodingRNA)之一,参与到干细胞干细胞“干性”的维持之中,同时与PIWI蛋白组成piRNA-PIWI通路,在大量不同类型的肿瘤细胞中高表达。类比miRNA领域取得的研究成果,例如组织工程学应用、抗肿瘤靶点等,探讨piRNA-PIWI通路是否具备相同的应用与靶点价值是本实验设计的核心所在。 【设计思路】 热休克蛋白90(hot shock protein 90)参与了piRNA负载到PIWI蛋白的关键过程,通过使用其抑制剂17-AAG能够间接的抑制piRNA-PIWI通路,同时以神经母细胞瘤的肿瘤干细胞为实验对象,探讨抑制piRNA-PIWI通路对于肿瘤干细胞“干性”的影响 【实验内容】 以小儿最常见的颅外实体瘤神经母细胞为实验对象:(1)神经母细胞瘤干细胞的富集:使用依托泊苷处理肿瘤细胞,进行肿瘤干细胞的富集。(2)实验对象的分组:①维甲酸组作为对照组;②17-AAG组;③RNAi-PIWIL2组。(3)实验检测指标:①PIWIL2 mRNA的检测;②细胞干性的评价:检测相关基因OCT4、SOX2、C-MYC与N-MYC基因的表达,甲基化相关酶(DNMT1、DNMT3)的表达,同时进行形态学观察、细胞凋亡以及细胞周期的监测。③piRNA-PIW通路功能的检测:检测代表性的转座子Line-1、IAP的表达,以及PIWIL2蛋白的表达。 【材料】 神经母细胞瘤细胞系IMR-32、SK-N-SH、SH-SY5Y;HSP90抑制剂17-AAG。 【可行性】 本实验室已在神经母细胞瘤的相关研究中取得研究成果,发表SCI论文,同时本实验的参与团队在校学习期间深入实验室研究过程之中,掌握了一定的实验技能。 【创新性】 探讨使用piRNA-PIWI通路的间接抑制剂17-AAG,从而研究抑制该通路对于神经母细胞瘤干细胞“干性”所造成的影响,为研究靶向抑制piRNA-PIWI通路作为抗肿瘤治疗新靶点奠定理论基础,同时亦为未来开发基于piRNA的组织工程学重编程细胞的新靶点进行前瞻性研究。     

MiR-382促进大鼠肝前体细胞WB-F344肝向分化的研究

【立论依据】 肝卵圆细胞的定向分化可为肝细胞移植和生物人工肝提供丰富的肝细胞源。阐明肝卵圆细胞分化的分子机制,是实现控制其定向分化的基础和前提。前期研究显示:miR-382在肝干细胞分化过程中表达上调,提示miR-382可能促进肝干细胞的分化过程。然而,目前对于miR-382在肝干细胞分化中的作用和分子机制仍知之甚少。 【设计思路】 本项目拟利用肝细胞生长因子(HGF)诱导大鼠肝前体细胞WB-F344向肝实质细胞分化的细胞模型,观察miR-382在肝前体细胞WB-F344分化进程中的表达变化,并从功能学和分子标志物两方面检测该microRNA分子对肝卵圆细胞分化的作用,并通过寻找该microRNA分子的靶基因初步明确miR-382调控肝干细胞分化的分子机制。 【实验内容】 (1)建立HGF诱导大鼠肝上皮样干细胞WB-F344肝向分化的细胞模型,并通过糖原染色和肝分化标志物的检测证实该模型的有效性。(2)通过qPCR的方法检测miR-382在整个诱导分化进程中的表达变化。(3)从功能学指标和分子标志物指标两方面检测miR-382过表达或者低表达对WB-F344细胞分化的影响。(4)miR-382通过靶向抑制候选靶基因Ezh2的表达提高肝干细胞的分化能力。 【材料】 大鼠肝前体细胞WB-F344,肝细胞生长因子HGF,Trizol 试剂,Lipofectamine 2000转染试剂,MiR-382 mimics等等。 【可行性】 (1)项目组成员均系统学习了细胞生物学和分子生物学的知识和实验操作技能,对科研有浓厚的兴趣,并已加入指导教师课题组进行科研项目训练。(2)项目指导教师承担的浙江省教育厅课题(Y201330031)包含肝干细胞定向分化的研究,积累了丰富的肝实质细胞诱导分化经验。 【创新性】 (1)本项目首次研究miR-382在肝干细胞分化中的作用,该研究有助于我们认识miR-382的功能。(2)本项目首次提出miR-382通过调控表观遗传修饰酶Ezh2的表达影响染色质修饰状态并参与肝干细胞分化的作用机制,本实验数据将丰富我们对肝干细胞分化过程中表观遗传修饰的认识,具有一定的理论意义。     

PEDF抑制乳腺癌转移机制:通过p-ERK和p-AKT途径介导减少纤连蛋白表达

【目的】 色素上皮细胞衍生因子(PEDF)是一种多功能分泌性糖蛋白,具有神经营养、抑制新生血管和抗肿瘤的作用。PEDF通过降低微血管密度从而抑制肿瘤的作用已有研究,但其在乳腺癌转移中的确切作用和机制尚不明了。 【方法】 体内实验中,我们使用稳定表达PEDF的MDA-MB-231乳腺癌细胞原位肿瘤模型评估裸鼠乳腺癌的肝转移和肺转移。体外实验中,在MDA-MB-231细胞和SKBR3细胞过表达PEDF,用Boyden小室检测其的侵袭和转移能力。此外,PEDF对乳腺癌细胞EMT相关的Maker、纤连蛋白(fibronectin)及p-AKT、p-ERK分别用qRT-PCR、蛋白质印迹法和荧光免疫细胞化学法测定。肿瘤血管新生密度用MVD分析。 【结果】 实验发现,体外实验和在体实验中,PEDF均明显抑制了乳腺癌的转移。PEDF抑制肿瘤转移是通过抑制fibronectin表达,而非逆转EMT途径,而增加fibronectin可抵消PEDF的抑制乳腺癌的作用。此外,PEDF抑制fibronectin蛋白的表达是通过层黏连蛋白受体(laminin receptor)及后续的p-ERK 和p-AKT信号通路起作用的。 【结论】 实验结果证实了PEDF在乳腺癌生长和转移中发挥重要作用,并且发现,PEDF是通过层黏连蛋白受体介导和抑制fibronectin表达得以实现的。这为今后的乳腺癌治疗提供了新的思路。     

HIF-1α信号通路相关分子在胃癌中的表达及其对细胞增殖与侵袭的影响研究

【立论依据】 缺氧诱导因子1α(Hypoxia-inducible factor 1α, HIF-1α)是参与低氧环境中细胞适应性调节的关键转录因子,通过结合于靶基因上游转录调节区的低氧反应原件调控多种分子的表达。HIF-1α的异常增高参与了多种癌症的发生发展,课题组前期研究揭示了胃癌组织中存在着HIF-1α的高表达现象,但是HIF-1α的异常表达通过哪些下游靶基因及信号通路来实现对胃癌细胞的增殖、侵袭的调控尚不清晰。因此,高通量筛选及验证HIF-1α下游靶基因,构建HIF-1α信号网络并进行功能分析,为深入理解以HIF-1α为核心的信号通路相关分子对胃癌细胞增殖与侵袭的影响奠定重要理论基础,同时也为阐明胃癌发生、发展机理,寻找胃癌早期诊断和治疗的靶标提供科学依据。 【设计思路】 本设计旨在前期研究基础上,检测胃癌细胞中HIF-1α的表达变化,结合转录组学及数据库信息绘制与细胞增殖及侵袭相关的HIF-1α调控网络图;利用RNAi技术沉默HIF-1α,检测其靶基因的表达,探讨转染后对肿瘤细胞增殖及侵袭的影响。 【实验内容】 (1)结合转录组及数据库信息,初步构建胃癌中HIF-1α调控网络,RT-qPCR及蛋白质印迹对HIF-1α及靶基因进行验证;(2)siRNA技术对胃癌细胞HIF-1α进行敲除,RT-qPCR、蛋白质印迹检测敲除后HIF-1α 及其靶基因表达;(3)MTT及transwell实验检测有效基因敲除后胃癌细胞株的增殖能力及侵袭性变化。 【材料】 (1)胃癌细胞株SGC-7901,细胞转染相关材料及试剂,HIF-1α及其靶基因引物、抗体,逆转录及实时定量PCR试剂,蛋白质印迹相关试剂。(2)转录组学信息,TRED数据库,cytoscape做图软件等计算机工具。 【可行性】 课题组前期利用外显子芯片、RT-qPCR及蛋白质印迹法证实HIF-1α在胃癌组织中呈高表达,并且结合TRED数据库及胃癌基因表达谱筛选出胃癌中HIF-1α可能的靶基因。以上工作为进一步探索HIF-1α作用的下游靶基因及其对胃癌细胞增殖及侵袭性的影响及机制研究提供了思路及实验基础。此外,项目组具有完成信号调控网络研究的硬件设施及研究基础,为项目的顺利实施奠定基础。 【创新性】 将高通量组学、生物学实验及计算生物学技术紧密联合,探讨HIF-1α信号通路对胃癌细胞增殖及侵袭性的影响及可能的机制。     

JAM-A表达与肺腺癌侵袭转移的关系及机制

【立论依据】 JAM-A是上皮细胞紧密连接结构的重要成分,在紧密连接装配、白细胞迁移、血小板活化和血管生成等细胞过程中发挥重要作用,参与调节炎症反应,并与细胞极性和渗透性的调节有关。目前发现JAM-A参与肿瘤的进展过程,其过量表达可能与患者的不良预后有关。但JAM-A在肿瘤进展中的功能尚存争议,JAM-A在肺腺癌中侵袭和转移中作用及机制尚未阐明。 【设计思路】 本实验在组织、细胞和动物三个层面探究肺癌中JAM-A蛋白在肺腺癌侵袭、转移和预后中的作用,证实JAM-A过表达促进肺腺癌进展。 【实验内容】 (1)组织实验:量子点免疫荧光检测200例肺腺癌组织JAM-A表达,观察JAM-A表达情况与临床病理因素及预后的关系。(2)细胞实验:培养人肺腺癌细胞A549和人正常肺上皮细胞BEAS-2B,①用siRNA分别转染细胞系使JAM-A基因沉默;②质粒转染细胞系建立JAM-A基因高表达的模型;③对两个系列的肺腺癌细胞和正常肺上皮细胞均用共聚焦显微镜、蛋白质印迹法和直接测定TER观察细胞紧密连接结构变化,Transwell小室方法检测细胞侵袭和迁移能力,MTT法检测细胞增殖能力。(3)动物实验:建立JAM-A(-)裸鼠和正常同种裸鼠构建肺腺癌荷瘤模型,检测肿瘤细胞JAM-A的表达情况并比较两组肿瘤的生物学特征。 【材料】 肺腺癌组织,肺腺癌细胞系,JAM-A(-)裸鼠,JAM-A抗体,质粒转染试剂盒,量子点试剂盒等。 【可行性】 前期工作已明确JAM-A在肺腺癌中表达与一些临床病理参数相关。指导教师课题组一直从事肿瘤侵袭转移机制研究并取得一定成绩,本组成员有较扎实的基础理论知识以及较熟练的实验操作技能。 【创新性】 (1)探讨肺腺癌组织中JAM-A表达与临床病理参数及预后的关系。(2)证实JAM-A过表达与肺腺癌的侵袭转移有关,并探究其机制。     

MiR-101通过靶向RAP1B调节上皮间质转化并抑制乳腺癌的侵袭和转移

【目的】 探讨微小RNA miR-101在乳腺癌细胞转移与侵袭中的功能及靶点。 【方法】 首先通过脂质体转染的方法在MDA-MB-231、BT549和MDA-MB-4355细胞系中瞬时过表达miR-101模拟物,进而通过划痕实验、transwell迁移和侵袭实验来反映细胞运动能力的改变;然后应用荧光素酶报告基因分析技术和蛋白质印迹技术寻找并验证miR-101的靶基因。 【结果】 在功能学上miR-101的过表达可显著抑制MDA-MB-231、BT549和MDA-MB-4355细胞的迁移和侵袭能力(P<0.01);在线软件预测RAP1B和RAB5A是miR-101的潜在靶基因;荧光素酶报告基因分析初步证明RAP1B是miR-101的靶基因;蛋白质印迹从蛋白质水平进一步验证RAP1B是miR-101的靶基因。 【结论】 在乳腺癌中,miR-101可以通过靶向RAP1B抑制细胞的侵袭和转移能力,这是miR-101作为一种特殊的基因调节因子,在乳腺癌的发生发展中起的重要作用之一。     

TRPM2在机械性创伤引发单核细胞TNF-α过量产生中的作用及其机制

【立论依据】 车祸、地震等造成的机械性创伤(MT),可以造成心脑等重要器官的继发性损伤。前期的研究表明,MT引发的TNF-α过量产生是导致继发性心肌损伤的关键环节,然而其机制却不清楚。TRPM2是非选择性阳离子通道,在氧化应激情况下开放。由于单核细胞是产生TNF-α的主要细胞,故本课题以TRPM2为切入点,研究MT引发单核细胞TNF-α过量产生的机制。 【设计思路】 依次解决下述三个问题:(1)TRPM2在MT引发单核细胞TNF-α过量产生中是否发挥重要的作用?(2)TRPM2在MT引发TNF-α过量产生中的作用机制,主要观察通过TRPM2通道的开放是否与UCP2有关?(3)通过该通道内流的钙离子,是否通过ErK/NF-κB通路介导TNF-α的过量产生? 【实验内容】 (1)在培养的单核细胞液中,分别使用TRPM2通道阻断剂、Ca²⁺清除剂、相关溶剂和基因沉默技术,观察在培养液中添加创伤动物血浆(TP)引发的培养液中TNF-α浓度的变化;(2)使用TRPM2基因敲除鼠,观察MT造成的动物血浆中TNF-α浓度变化;(3)使用膜片钳和检测细胞内钙变化,从功能上观察在单核细胞上的TRPM2通道,是否参与TP引起的钙离子内流;(4)动物实验,观察MT后,UCP2的蛋白表达是否增强;使用UCP2抑制剂,观察MT后血浆TNF-α产生量的变化;(5)膜片钳观察,使用UCP2抑制剂,观察是否可抑制TP引起的单核细胞TRPM2通道开放和细胞内钙上升;(6)单核细胞培养,使用TRPM2阻断剂和siRNA基因沉默TRPM2,观察培养液中添加TP后,对ErK的表达、NF-κB的表达和核内移情况;(7)动物实验,观察TRPM2基因敲除鼠和对照鼠,创伤后ErK的表达、NF-κB的表达和核内移情况。 【材料】 使用雄性成年C57B16/J小鼠和TRPM2基因敲除鼠。 【可行性】 (1)申请人所在实验室具有完成上述实验的全部实验仪器,本课题组实验技术成熟,人员配备较好。(2)实验所用TRPM2基因敲除鼠可以从日本国立自然科学研究机构获得。 【创新性】 (1)以TRPM2为靶点,研究其在MT引发TNF-α过量产生中的作用。(2)研究TRPM2通道与UCP2的关系。(3)观察TRPM2通道是否通过ErK/NF-κB通路介导MT引发的TNF-α过量产生。     

维甲酸诱导基因I对氧固醇7α羟化酶的调控作用研究

【立论依据】 基因芯片结果显示,敲除维甲酸诱导基因I(RIG-I)的小鼠体内氧固醇7α羟化酶(下文称CYP7B1)基因水平发生变化,说明两者存在慢反应联系,本实验目的旨在探究这两个基因之间是否存在直接调控的快反应联系。 【设计思路】 本实验首先需要对基因芯片的结果进行确定,随后通过多种方式改变RIG-I的表达水平(干扰素刺激、质粒转染等),观察CYP7B1是否存在明显的协同表达变化。如果能确定两者之间确实存在直接调控关系,将进一步探究调控的具体机制,从分子水平阐释调控的环节。 【实验内容】 利用real-time PCR检测基因芯片结果;利用IFNγ上调RIG-I表达水平,并运用real-time PCR检测CYP7B1的表达水平变化;构建载有RIG-I基因的质粒并进行质粒转染,运用real-time PCR和蛋白质印迹法检测CYP7B1的基因表达和蛋白表达变化情况;转染RIG-I promoter,探究其调控CYP7B1的具体机制。 【材料】 细胞:293T细胞、Hela细胞、HepG2细胞等;其他:RIG-I、CYP7B1引物、一抗、二抗及其他常规所需试剂。 【可行性】 预实验中已经确定了RIG-I与CYP7B1间存在慢反应调控关系,同时也确定了相关文献中IFN-γ对RIG-I的上调作用,实验器材、试剂齐备。 【创新性】 本实验首次提出RIG-I基因与CYP7B1及其所参与的脂代谢过程有调控关系,对胆固醇代谢、神经甾体代谢、及CYP7B1缺乏所引起的一系列疾病的研究也可以提供一定的实验依据和理论支持。     

B-Myb在肺癌中的作用与分子机制初探

【立论依据】 B-Myb是经典癌基因Myb家族的成员之一,其编码蛋白隶属于转录因子,在细胞周期和肿瘤发生发展过程中均具有重要作用。我们前期已发现,B-Myb在肺癌中表达异常上调,提示其在肺癌中具有重要作用,但其具体功能与分子机制仍不清楚,本课题拟对此进行研究。 【设计思路】 基于B-Myb在肺癌中表达上调,故选用“功能失活”策略进行研究。即:采用RNA干扰技术,抑制人肺癌细胞系H1299中B-Myb的高水平表达,构建B-Myb基因沉默稳定细胞株,分析B-Myb基因沉默后肺癌细胞的生长增殖、细胞周期和迁移侵袭能力以及全基因组基因表达谱的变化,由此初步揭示B-Myb在肺癌中的潜在作用与分子机制。 【实验内容】 首先,分别构建阴性对照和靶向B-Myb的RNA干扰质粒;然后,将上述质粒瞬时转染人肺癌细胞系H1299,结合嘌呤霉素抗性筛选和绿色荧光蛋白追踪,分别建立阴性对照和B-Myb基因沉默稳定细胞株,通过定量RT-PCR和蛋白质印迹技术检测确认B-Myb基因表达的抑制程度;最后,使用上述构建的稳定细胞株,分别采用MTT实验、流式细胞仪、软琼脂克隆形成实验、迁移侵袭实验对细胞的生长增殖、细胞周期分布、克隆形成能力和迁移侵袭能力进行分析,并通过基因芯片技术对全基因组基因表达谱进行检测。 【材料】 人肺癌细胞系H1299、细胞培养基、RNA干扰质粒、转染试剂、定量PCR试剂、B-Myb抗体、基因芯片等。 【可行性】 理论可行性:本课题是依据大量文献、我们的前期研究结果以及经典的分子肿瘤学理论,经过严密论证而提出。技术可行性:本课题采用的实验技术均为经典和成熟的肿瘤分子生物学研究技术,指导教师提供全程指导。 【创新性】 采用“功能失活”策略,综合运用RNA干扰、稳定细胞株构建、细胞表型分析和基因芯片技术,以期首次初步阐明B-Myb在肺癌中的作用与潜在分子机制,目前国内外尚未见报道。     

维生素E经LOX-1/NADPH氧化酶/ROS通路抑制oxLDL诱导的HUVEC细胞损伤

【目的】 复制氧化性低密度脂蛋白(oxygenized low density lipoprotein,oxLDL)诱导人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)损伤模型,建立慢病毒介导的LOX-1-shRNA转染HUVEC细胞模型,从LOX-1/NADPH氧化酶/ROS信号通路研究维生素E(Vit E)对oxLDL诱导的HUVEC细胞氧化损伤的保护作用。 【方法】 以200 μg/mL oxLDL与HUVEC细胞共孵育24 h,用于复制细胞损伤模型;实验设计分为:正常对照组、oxLDL模型组、药物组(200 μmol/L Vit E);以MTT检测细胞存活率,DCFH-DA检测细胞内ROS及蛋白质印迹法检测LOX-1、NADPH氧化酶亚基(gp91phox、p47phox、p67phox)蛋白经时改变(3、6、12、24 h);real-time PCR检测24 h后LOX-1、NADPH氧化酶亚基(p22phox、gp91phox、rac1)mRNA的表达,采用慢病毒介导的基因沉默技术抑制LOX-1表达48 h后,用oxLDL诱导24 h,检测LOX-1蛋白、NADPH氧化酶亚基(p47phox、p67phox、gp91phox)蛋白和ROS的含量。采用SPSS 17.0进行统计学分析。 【结果】 与正常组比较,oxLDL处理后细胞生存率仅为50.31%,LOX-1蛋白伴随细胞氧化损伤在3、6、12、24 h表达量显著增加,且在3 h和24 h时呈现两个表达高峰(P<0.05),NADPH氧化酶亚基(p47phox、p67phox、gp91phox)蛋白表达水平在各时间点均显著升高(P均<0.01),24 h达高峰,ROS检测结果表明其动态经时改变在3 h和24 h达峰值( P<0.05)。Real-time PCR结果显示,LOX-1 mRNA及NADPH氧化酶亚基(gp91phox、p22phox、rac1) mRNA表达水平显著升高(P<0.01)。慢病毒介导LOX-1基因沉默后,最佳转染效率为73.23%。oxLDL诱导24 h后,LOX-1及NADPH氧化酶亚基(p47phox、p67phox、gp91phox)蛋白表达下调,ROS生成量相应降低。VitE组下调LOX-1和NADPH氧化酶的mRNA及蛋白质表达并降低ROS生成。 【结论】 oxLDL经LOX-1/NADPH氧化酶/ROS通路诱导HUVEC细胞损伤。200 μmol/L的VitE可通过抑制LOX-1/NADPH氧化酶/ROS信号通路的活化而发挥对oxLDL诱导的HUVEC细胞损伤的保护作用。     

原发性高血压大鼠外周小动脉内皮细胞线粒体动力学在NO相关的内皮细胞功能障碍中的调节作用

【立论依据】 原发性高血压外周小动脉内皮细胞中均存在线粒体动力学的异常与内皮功能障碍。研究表明线粒体功能障碍发生于内皮功能障碍之前,而内皮功能障碍发生于原发性高血压之后。 【设计思路】 首先,研究原发性高血压大鼠外周小动脉内皮细胞中的线粒体动力学的异常改变情况。然后:改变正常外周小动脉内皮细胞线粒体动力学,观察内皮细胞变化情况。其次,将正常大鼠施加相应应激因素,使其向原发性高血压方向发展,在这个过程中定时测量大鼠外周小动脉内皮细胞损伤情况、线粒体动力学情况以及大鼠血压变化,来寻找以上三者发生异常的因果关系。最后,改善原发性高血压大鼠线粒体功能,观察大鼠血压的改善情况。 【实验内容】 首先,分别取正常大鼠与原发性高血压大鼠外周小动脉内皮细胞进行原代培养,检测两组细胞内线粒体的形态与分布;融合相关基因OPA1L、MFN1、MFN2的表达情况;分裂相关基因FIS1、DRP1的表达情况。然后,使用转染技术降低正常大鼠外周小动脉内皮细胞相应影响线粒体动力学基因的表达,检测eNOS的表达情况;BH4的含量;ROS与ONOO^-的含量。再通过转染技术使上述表达下降了的基因再次恢复表达,同样测上述指标。其次,给正常大鼠高脂质食物、限制其行动并使其一直处于恐惧中,在其向原发性高血压发展的过程中,定时监测大鼠血压变化;大鼠外周小动脉内皮细胞中线粒体的形态与分布;融合相关基因OPA1L、MFN1、MFN2的表达情况;分裂相关基因FIS1、DRP1的表达情况;eNOS的表达情况;BH4的含量;ROS与ONOO^-的含量。最后,给予原发性高血压大鼠运动与饥饿处理,观察线粒体动力学与血压的变化。 【材料】 SD大鼠与原发性高血压大鼠。 【可行性】 所涉及指标及依据背景,均有文献支持。使用的技术均为常规实验技术。 【创新性】 首次研究线粒体动力学在原发性高血压大鼠外周小动脉内皮细胞中的改变,首次提出线粒体动力学异常与原发性高血压之间的因果关系,与线粒体动力学在原发性高血压的发生与发展中的作用。进一步寻找原发性高血压预防与治疗上新的靶点。     

siRNA介导核干因子基因沉默抑制肝癌细胞增殖并促进细胞凋亡

【目的】 核干因子(nucleostemin, NS)是最近发现的一个GTP结合蛋白,在神经干细胞、胚胎干细胞以及某些肿瘤细胞中均有表达。NS在多种肿瘤细胞增殖和凋亡调控中具有重要作用,然而其在肝癌中的作用尚未清楚。本研究通过检测其在不同肝癌细胞系和组织中的表达,并利用siRNA干扰技术,以探究NS在肝癌细胞增殖和凋亡中的作用。 【方法】 以肝癌组织和多种肝癌细胞系为研究对象,首先通过定量PCR及蛋白质印迹法分析细胞及肝癌组织中NS的表达。接着通过siRNA瞬时转染的方法降低NS的表达,并通过定量PCR和蛋白质印迹法检测干涉效果,利用MTT试验和细胞增长实时监控技术检测细胞增殖情况,流式细胞术探究紫外线(ultraviolet, UV)或血清饥饿诱导下细胞凋亡情况。 【结果】 蛋白质印迹及定量PCR结果显示NS在多种肝癌细胞系及肝癌组织中都有较高的表达,且在MHCC97H和Bel7402细胞中,MTT试验和细胞增长实时监控显示降低NS的表达能够抑制细胞增殖,流式细胞术和蛋白质印迹结果显示NS基因沉默能够促进UV和血清饥饿诱导的细胞凋亡。即NS可能具有促进细胞增殖和抑制细胞凋亡的作用。 【结论】 NS在肝癌组织和细胞中都有较高的表达,在MHCC79H和Bel7402细胞中,降低NS表达可抑制细胞增殖,促进UV及血清饥饿诱导的细胞凋亡。     

虾青素通过SIRT1/FOXO3a信号通路预防低渗性对比剂诱导的急性肾损伤的实验研究

目的 探讨虾青素（astaxanthin,AST）通过沉默信息调节因子（Sir2）家族成员之一的SIRT1/叉头框蛋白（FOXO3a）对碘海醇诱导的人肾小管上皮（HK-2）细胞氧化损伤的作用。方法 HK-2细胞株培养贴壁后随机分为对照组、二甲基亚砜（DMSO）对照组、碘海醇组、碘海醇+SIRT1抑制剂尼克酰胺（niacinamide,NA）组、碘海醇+FOXO3a siRNA组、碘海醇+低、高剂量虾青素（1.0、10.0μmol/L）组,继续培养然后应用细胞计数试剂盒（CCK-8）检测细胞存活率,流式细胞仪检测细胞内活性氧（ROS）的水平,蛋白免疫印迹法检测细胞中SIRT1及FOXO3a的蛋白水平。结果 与对照组相比,碘海醇组、碘海醇+低、高剂量虾青素组细胞存活率降低,并且随着碘海醇剂量的增加,抑制作用增强;虾青素组（在一定浓度范围内）可改善碘海醇对HK-2细胞增殖的抑制作用,一定范围内剂量增加,改善能力越强。加入碘海醇后,细胞内ROS水平明显增加,虾青素预处理后,ROS水平下调。碘海醇使SIRT1蛋白的表达上调,同时降低了叉头框蛋白（FOXO3a）的表达,虾青素可以拮抗这一作用,在一定浓度范围内,随着浓度增加,拮抗作用增强。碘海醇作用下,SIRT1抑制剂NA可以降低SIRT1的表达,增加叉头框蛋白的表达,FOXO3a siRNA使FOXO3a的表达下降,但对SIRT1的表达无明显影响。结论 虾青素可以对抗碘海醇诱导的HK-2的氧化损伤,其可能的机制与降低内皮细胞SIRT1的表达有关,且在FOXO3a的上游发挥对抗碘海醇诱导的氧化损伤作用。     

PAK6与HDAC6的相互结合诱导的细胞自噬在前列腺癌增殖中的作用

【立论依据】 前列腺癌 (prostate cancer,PCa)是男性恶性肿瘤的第一杀手。近期研究表明细胞自噬作为双刃剑在前列腺癌、乳腺癌等肿瘤的生理与病理过程中发挥重要的作用,但目前细胞自噬如何调控前列腺癌的机制尚无报道。p21活化激酶-6(p21-activated kinase 6,PAK6)是丝/苏氨酸蛋白激酶PAK家族的一员,通过磷酸化雄激素受体与肿瘤E3连接酶而泛素化降解雄激素受体,从而负向调节前列腺肿瘤的生长。HDAC6是Ⅱ类组蛋白脱乙酰化酶的一个成员,通过调节底物乙酰化水平促进肿瘤的生长与转化。已有文献报道,PAK6在前列腺癌中呈高表达,而HDAC6具有促进自噬小体形成的作用。我们前期的研究结果发现,PAK6可通过结合HDAC6从而诱导细胞发生自噬,且临床标本的免疫荧光结果显示PAK6与HDAC6共定位于细胞质中,且恶性前列腺癌中的共定位明显高于正常前列腺组织,提示两者在前列腺癌中发挥重要作用。因此本实验旨在探讨PAK6与HDAC6相互结合诱导的细胞自噬在前列腺癌中的发挥的生物学功能及调节机制。 【设计思路】 应用体内外结合实验研究二者在细胞内的相互作用。电镜及蛋白质印迹技术检测PAK6与HDAC6与细胞自噬的关系,及PAK6与HDAC6诱导的细胞自噬在前列腺癌中的生物学功能。免疫组化检测二者在前列腺癌临床标本中表达的相关性。 【实验内容】 (1)体外GST-pull down实验证实PAK6与HDAC6直接结合。(2)共转染HDAC6和PAK6到工具细胞HEK293中,免疫共沉淀检测二者在细胞内结合。(3)成功构建过表达和沉默PAK6细胞系,利用MTT,细胞计数及蛋白质印迹实验揭示PAK6与HDAC6诱导的细胞自噬在前列腺癌中的生物学功能。(4)免疫组化分析前列腺癌组织临床标本中PAK6与HDAC6表达的相关性。 【材料】 前列腺癌及工具细胞系,相应抗体, ECL发光试剂及仪器,共聚焦激光显微镜。 【可行性】 所在实验室为教育部医学细胞生物学重点实验室。前期实验成功证明PAK6和HDAC6的结合及共定位关系,本人已熟练掌握了后续实验涉及的相关技术。 【创新性】 本研究首次发现PAK6和HDAC6在前列腺癌中的共定位表达变化及二者的相互作用,阐明PAK6通过HDAC6促进细胞自噬,为寻找前列腺癌的预警分子提供理论基础。