量子点标记自杀基因靶向脂质体在肝癌诊治一体化中的应用研究

【目的】 自杀基因/前体药物系统抗肿瘤作用效果显著,但自杀基因肿瘤靶向识别性差而限制其临床应用。基于叶酸偶联脂质体(FL)的生物相容性及靶向性、量子点(QD)荧光标记的高灵敏性及光稳定性、HSV-tk自杀基因独特的旁观者效应,本研究拟开发多功能纳米载体-叶酸靶向量子点标记的HSV-TK基因脂质体(FL/QD-TK),并检测此载体系统在肝癌诊治一体化中作用。 【方法】 构筑FL/QD-TK并进行表征后,利用MTT法、激光共聚焦荧光显微镜、活体荧光成像仪及裸鼠移植瘤模型等方法对其体内外靶向性成像和治疗肝癌的作用及生物安全性进行研究。 【结果】 多功能纳米载体FL/QD-TK合成方法稳定,形貌均一,对叶酸受体高表达的Bel-7402肝癌细胞表现出较强的选择性杀伤作用,而对叶酸受体低表达的HepG2细胞靶向杀伤作用较弱。FL/QD-TK可实时示踪TK基因在Bel-7402荷瘤裸鼠体内的运输与分布,实现了在肿瘤部位的靶向富集,系统性给药并联合GCV取得了良好的抗肿瘤效果,同时对各脏器组织形态学和血清学指标无影响。 【结论】 新型多功能纳米载体FL/QD-TK可在体外靶向和选择性杀伤叶酸受体高表达肝癌细胞,在体内可视化示踪TK基因治疗肿瘤并具备了较好的生物安全性,FL/QD-TK作为一种潜在的高效低毒的纳米药物有望应用于肝癌的诊治一体化。     

丝氨酸缺乏和p53依赖的代谢重构对乳腺癌细胞的影响

【立论依据】 丝氨酸对肿瘤细胞增殖具有重要作用。丝氨酸缺乏可导致肿瘤细胞氧化应激,对其增殖产生抑制。肿瘤抑制基因p53在抗氧化代谢中发挥不可或缺的作用,因此p53可帮助肿瘤细胞耐受丝氨酸缺乏。这与p53的抑癌功能是一对矛盾,利用此矛盾可为肿瘤治疗提供新的思路。 【设计思路】 选取p53突变或缺失的三阴性乳腺癌细胞系,给予丝氨酸缺失的培养环境,观察其增殖情况、相关基因和蛋白表达情况。以p53阳性的乳腺癌细胞和正常培养基作对照 【实验内容】 MDA-MB-157(P53 null)或HCC1937(P53 mutant)分别用不含丝氨酸的培养基(-SG)、加入丝氨酸的-SG、加入丙酮酸和GSH的-SG,进行72 h培养,每24 h用流式细胞仪检测细胞数量、细胞周期和细胞内ROS水平,酶标仪检测抗氧化能力、GSH和GSSG水平,Real-time PCR检测P53、PHGDH的mRNA转录,蛋白质印迹检测p53、PHGDH的蛋白表达。MCF-7(P53 wildtype)作为P53的阳性对照。 【材料】 MCF-7、MDA-MB-157或HCC1937、MEM培养液(HyClone SH30024)、丝氨酸、丙酮酸、GSH,相关的试剂盒和试剂。 【可行性】 已进行预实验,已实践过实验内容中提及的操作,已观察到MCF-7在丝氨酸缺乏时增殖先受抑制后恢复、细胞内ROS水平上升、PHGDH表达上升 【创新性】 p53对肿瘤细胞代谢的影响已成为研究热点。多数肿瘤中近一半存在p53基因的突变,丝氨酸在肿瘤增殖中的重要地位,使得丝氨酸、p53以及相关的信号调节通路和酶可能成为肿瘤治疗的新靶点。     

人疱疹病毒6型DR7蛋白在神经胶质瘤发生中的作用研究

【立论依据】 神经胶质瘤是人类最常见的颅内原发性肿瘤,恶性程度高,对人类健康造成严重威胁。近年来有关神经胶质瘤和病毒感染相关的证据逐渐增多。人疱疹病毒6型 (human herpesvirus 6, HHV-6)是一类嗜人淋巴细胞的双链DNA病毒,分为HHV-6A和6B两个亚型。HHV-6是一种肿瘤相关病毒,近年来国内外文献均报道在胶质瘤标本中 HHV-6DNA和蛋白的阳性率明显高于对照组,表明HHV-6感染在神经胶质瘤的发生中具有重要作用,但是起关键作用的病毒基因及机制仍不十分清楚。HHV-6 DR7基因是潜在的转化基因,其表达产物是一种转录激活子。文献报道DR7蛋白能导致NIH3T3细胞体外转化以及裸鼠皮下成瘤,DR7蛋白还可以和肿瘤抑制基因p53结合导致p53功能缺失。为探究 DR7在神经胶质瘤发生中的作用,我们通过免疫组化检测了神经胶质瘤组织中DR7的表达,发现神经胶质瘤组织中DR7的阳性率明显高于瘤旁及正常组织。 【设计思路】 首先明确DR7蛋白对神经胶质瘤细胞增殖、侵袭和转移的影响,然后深入研究引起上述变化的分子机制,并在体内进一步证实DR7蛋白对神经胶质瘤肿瘤形成能力的影响。 【实验内容】 (1)构建 DR7过表达载体,建立DR7过表达稳定转染细胞系。(2)细胞水平上研究DR7蛋白对细胞增殖,侵袭和转移等生物学功能的影响。(3)运用基因芯片,real-time PCR和蛋白质印迹等技术确定引起上述变化的机制。(4)体内验证DR7蛋白对神经胶质瘤细胞肿瘤形成能力的影响。 【材料】 HHV-6标准株,U87细胞株,real-time PCR试剂,蛋白质印迹用试剂及抗体,裸鼠。 【可行性】 (1)理论依据充分。HHV-6是嗜神经的DNA病毒,可长期潜伏于中枢神经系统。潜伏期的HHV-6基因组可整合于宿主染色体,一旦宿主免疫力下降则再激活,激活的HHV-6表达多种病毒蛋白,其中DR7是具有反式激活能力的转化基因。(2)有前期结果。我们已成功建立了DR7过表达稳定转染细胞系,MTT和Transwell实验均表明DR7蛋白能明显促进U87细胞的增殖和侵袭。 【创新性】 本研究基于临床,运用分子生物学的相关技术,首次研究HHV-6DR7在神经胶质瘤发生发展中的作用,将为神经胶质瘤的预防及治疗提供新靶点。     

细胞穿膜-靶向双肽修饰紫杉醇纳米制剂的制备、表征及体外抗胶质瘤评价

目的 以胶质瘤U251细胞为研究对象,制备细胞穿膜-靶向双肽修饰的紫杉醇纳米制剂(TN-PTX),研究其性质及体外抗肿瘤活性。 方法 采用噬菌体展示技术体外筛选与U251细胞特异性结合的靶向肽;界面沉淀法制备紫杉醇(PTX)纳米粒,将靶向肽、细胞穿膜肽TAT修饰于其表面,制备TN-PTX;对TN-PTX的粒径、Zeta电位、载药量、形态外貌、体外释放等方面进行表征; CCK8实验探讨TN-PTX对U251细胞增殖能力的影响。 结果 筛选的靶向肽HK特异性良好,TN-PTX的粒径为350.5±31.8nm,Zeta电位为-31.9±5.0mV,载药量为5.01%,形貌基本呈圆球形,分布较均匀,体外释放缓慢。PTX浓度相同时,TN-PTX对U251细胞的杀伤作用比PTX强。 结论 TN-PTX性质稳定,具有一定缓释作用,在细胞水平对U251细胞具有更强的细胞毒性作用。     

靶向脐带间充质干细胞的构建及其在小鼠脾脏内的定位

目的 构建含小分子肽P1-GFP融合基因慢病毒载体, 用携带P1-GFP融合基因的慢病毒感染MSC, 使MSC具有靶向性, 将靶向MSC注入小鼠体内后观察MSC在小鼠脾脏的定位及与淋巴细胞的关系。方法 用组织片贴壁法培养健康人脐带间充质干细胞, 用基因工程技术构建含小分子肽P1-GFP融合基因慢病毒载体并感染人脐带间充质干细胞, 通过尾静脉将转入P1-GFP融合基因的MSC注入小鼠体内, 18 h后免疫组化染色观察GFP在小鼠脾脏的定位。 结果 培养的健康人脐带间充质干细胞生长良好, MSC感染含P1-GFP融合基因的慢病毒18 h后MSC开始出现绿色荧光, 随着培养时间的延长, 荧光强度逐渐增强, 72 h达高峰。靶向MSC表达髓系干细胞的表面标记 CD105(90.0%)/CD44(98%),CD73(85.0%)/CD90(98.5%)。将靶向MSC经尾静脉注入小鼠体内, 18 h后小鼠脾脏出现大量GFP阳性细胞, 并与脾脏淋巴细胞密切接触。结论 本研究成功构建了含P1-GFP融合基因的靶向MSC, 靶向MSC成功定向脾脏, 并与脾脏淋巴细胞密切接触, 可用于后续的实验研究。     

基因治疗中的靶向转移载体研究

自 1990年美国ＮＩＨ批准开始第一例临床基因治疗试验以来 ,全世界已有 2 10 0多例患者因各种各样的疾病 ,如病毒感染、单个基因缺乏等进行基因治疗。在基因治疗过程中 ,为使基因能在患者体内有良好的表达并产生满意的治疗效果 ,就必须有一个合适的基因治疗系统 ,其组成除含治疗基因外 ,还需靶向转移载体系统 (即基因传递系统 )及基因表达系统。靶向转移载体系统可将基因定向传递到特定的靶细胞中。目前 ,基因的靶向转移载体可分为病毒性及非病毒性两大类。1　病毒性靶向转移载体病毒性靶向转移载体是目前临床应用十分广泛的一类载体 ,其特…     

土槿乙酸酰胺对 HeLa 细胞周期的影响

目的 通过研究土槿乙酸衍生物土槿乙酸酰胺 (PB-LY) 对 HeLa 细胞周期的影响,探讨 PB-LY 的抗肿瘤作用机制。方法 采用流式细胞术检测 PB-LY 对 HeLa 细胞周期的影响;采用 RT-PCR 法检测 PB-LY 对 HeLa 细胞周期相关基因 p53 和 p21 mRNA 表达的影响。结果 PB-LY 可明显减少 G₁ 期的 HeLa 细胞比例,明显增加 G₂₊M 期细胞的比例,上调 p53 基因的表达,同时协同下调 p21 基因的表达。结论 PB-LY 可通过增加细胞周期相关基因 p53 基因的表达和减少 p21 基因的表达,使 HeLa 细胞的周期阻断在 G₂₊M 期,从而阻滞 HeLa 细胞的生长。     

NT4-SAC-HA2-TAT融合基因表达载体的构建及鉴定

目的 构建NT₄-SAC-HA₂-TAT融合肽cDNA克隆，探讨前列腺凋亡反应基因-4(Par-4)核心区凋亡肽(SAC)作为目的基因对前列腺癌的治疗作用。  方法 应用互为引物模板法合成两端具有NaeI和KpnI酶识别位点的SAC cDNA片段。将所得SAC和已有HA₂-TAT片段克隆到具有相应酶切位点的pBV220-NT₄质粒，得到pBV220-NT₄-SAC-HA₂-TAT重组质粒。PCR扩增NT₄-SAC-HA₂-TATcDNA片段，并将其克隆到pGEM-T easy中，转化细菌筛选阳性克隆，酶切鉴定，序列测定分析。  结果 经DNA测序、限制性内切酶酶切等证实，PCR获得了编码NaeI和KpnI酶切位点的SAC cDNA片段，并将NT₄、SAC、HA₂-TAT亚克隆于pBV220内。  结论 成功构建了NT₄-SAC-HA₂-TAT融合基因的原核表达载体pBV220-NT₄-SAC-HA₂-TAT。     

MiR-101通过靶向RAP1B调节上皮间质转化并抑制乳腺癌的侵袭和转移

【目的】 探讨微小RNA miR-101在乳腺癌细胞转移与侵袭中的功能及靶点。 【方法】 首先通过脂质体转染的方法在MDA-MB-231、BT549和MDA-MB-4355细胞系中瞬时过表达miR-101模拟物,进而通过划痕实验、transwell迁移和侵袭实验来反映细胞运动能力的改变;然后应用荧光素酶报告基因分析技术和蛋白质印迹技术寻找并验证miR-101的靶基因。 【结果】 在功能学上miR-101的过表达可显著抑制MDA-MB-231、BT549和MDA-MB-4355细胞的迁移和侵袭能力(P<0.01);在线软件预测RAP1B和RAB5A是miR-101的潜在靶基因;荧光素酶报告基因分析初步证明RAP1B是miR-101的靶基因;蛋白质印迹从蛋白质水平进一步验证RAP1B是miR-101的靶基因。 【结论】 在乳腺癌中,miR-101可以通过靶向RAP1B抑制细胞的侵袭和转移能力,这是miR-101作为一种特殊的基因调节因子,在乳腺癌的发生发展中起的重要作用之一。     

具有抗氧化活性的含硒短肽的研制

【立论依据】 硒蛋白是微量元素硒发挥生物学功能的主要形式。人体中硒蛋白在抗氧化、抗肿瘤和调节免疫等方面都具有显著的作用,其中抗氧化活性是多种硒蛋白最核心的生物学功能。研制一种具有潜在应用价值的、类似于硒蛋白的抗氧化活性的含硒短肽具有重要意义。 【设计思路】 选取抗氧化活性最强的硒蛋白如硒蛋白P、谷胱甘肽过氧化物酶等,设计出3~5种含硒代半胱氨酸活性中心的硒蛋白截短型的短肽,根据硒蛋白基因表达的特殊性构建其表达载体及其哺乳动物细胞表达体系,实现此类含硒短肽的准确、高效的翻译,再通过抗氧化检测筛选出具有应用开发价值的短肽。 【实验内容】 (1)用于硒蛋白基因工程表达的哺乳动物细胞株的建立:选择在人类硒蛋白翻译过程中将编码硒代半胱氨酸密码子TGA正确解码时起着重要作用的3个反式作用因子,即SECIS 结合蛋白2(SBP2)、Sec特异延伸因子(EFSec)和核糖体蛋白L30(RPL30),将它们的编码基因分别克隆并构建为1个三基因表达载体pcDNA3.1-SBP2/Efsec/RPL30,稳定转染HepG2细胞系获得目的基因高表达的单克隆细胞株;(2)利用生物信息学的方法,筛选和设计硒蛋白截短型的短肽,并将其编码基因插入真核表达载体pcDNA4HisMaxB获得相应的重组载体;(3)利用各重组载体分别对已建立的转基因细胞株进行稳定转染,使目的基因表达并纯化获得含硒短肽;(4)利用常规的抗氧化检测方法,考察各种含硒短肽体外抗氧化活性,并筛选出最佳者用于后续研究。 【材料】 人肝癌细胞系HepG2;质粒pcDNA3.1、pcDNA4HisMaxB;各种基因工程工具酶及常规试剂;细胞培养及转染试剂;抗氧化检测试剂盒等。 【可行性】 硒蛋白复杂的翻译机制已经逐渐阐明,在原核生物细胞中利用反式作用因子提高硒蛋白表达已取得成功,为真核表达提供重要的启示,我们的设计在理论上是可行的;实验室相关技术方法及条件成熟,完全可满足本研究的要求。 【创新性】 具有抗氧化活性的硒蛋白分子量大限制了其药用价值,我们研究中将获得截短型的含硒短肽从而使其具有应用开发价值。此外,应用3个反式作用因子构建硒蛋白基因工程表达体系也是本研究的一个创新。     

靶向性非病毒载体GE7系统的构建及对人脑胶质瘤体外转移效率分析

目的：组建表皮生长因子受体介导的靶向性非病毒载体GE7系统，研究GE7系统对U251人恶性胶质瘤细胞株的体外转导效率。方法：应用上海市肿瘤研究所组建的EGF-R配体16肽GE7、流感病毒血凝素N端20肽HA20与多聚赖氨酸P.L.组成非病毒载体基因转移系统，分别与β-gal报道基因、p21WAF-1/CIP1基因组成多肽/DNA载体四元复合物。β-gal报道基因体外转导U251细胞，分析GE7系统体外导入效率。结果：载体DNA复合物组转染后24h即可观察到少量外源基因的表达，72h外源基因表达达到高峰，然后逐渐下降，转染后168h基本消失。单纯质粒DNA组仅见微弱外源基因的转入；对照组未见外源基因的转入。结论：GE7基因转移系统具有较高的基因转移效率和靶向性，为脑胶质瘤基因治疗提供了一种新的途径。     

MNPs-exosomes联合载药系统的制备及其在肿瘤治疗中的可行性探索

【立论依据】 药物靶向输送系统在肿瘤治疗中至关重要。磁性纳米颗粒(MNPs)可在外磁场引导下使其负载药物定向于肿瘤组织,达到肿瘤化疗中低毒高效的目的。然而,它的非生物源性使它不能在体液和组织中稳定地存在。Exosomes是一种由体内多种细胞释放的、直径介于50~150纳米的微囊体。因不引起补体或凝血因子的激活,以及难以被单核巨噬细胞吞噬,故可以在体内稳定存在,也是药物的理想载体。但由于靶向性较弱,难以富集至肿瘤组织。 【设计思路】 本项目拟设计并制备MNPs-exosomes二者联合的载药系统,以达到优势互补的效果,并通过体内外实验探讨其是否具有协同效应,从而为构建肿瘤靶向给药系统提供一种新思路。 【实验内容】 (1)制备3种药物载体:MNPs、exosomes、MNPs-exosomes联合载药体;(2)将3种药物载体分别与药物结合:选用多柔比星;(3)体内外实验验证其靶向性;(4)体内外实验评价其治疗效果。 【材料】 RAW-264.7细胞、HEPG-2细胞、MNPs、四氧化三铁悬液、250nm二氧化硅粒子悬液、聚苯乙烯、甲苯。 【可行性】 本课题组已进行了制备MNPs-exosomes联合载药体的预实验,实验结果符合预期。在以往的研究中,我们已经掌握了进行上述实验所需要的技术和方法,具备一定的科研悟性和热情,可以完成此研究。 【创新性】 (1)首次提出将MNPs与exosomes联合载药,通过二者的优势互补,来观察联合体是否具有协同作用;(2)我们拟通过制作超小粒径分子筛分离提纯exosomes,避免了传统方法的弊端。     

磁性白蛋白纳米球作为基因载体的研究

目的 制备载基因的磁性白蛋白纳米球,评估磁性白蛋白纳米球作为基因载体的可行性及体外的磁靶向性。方法 采用去溶剂化-交联法制备载基因磁性白蛋白纳米球,分别运用透射电镜（TEM）、动态光散射分析（DLS）对其形态、粒径进行表征。应用绿色荧光蛋白基因系统（pGFP）,观察载基因磁性白蛋白纳米球体外释放基因速率的情况及转染细胞的情况。运用普鲁士蓝染色法观察磁性纳米球的体外磁靶向性。结果 载基因磁性纳米球在TEM检测下为球形,大小均匀,并且在载基因磁性纳米球中明显地观察到在电子密度较低的白蛋白纳米球中包裹着电子密度较高的磁性纳米粒。DLS显示载基因免疫磁性纳米球的水合粒径约为209nm。体外动态释放基因速率,计算其累积释放率显示,该材料13h释放基因为95.25%,曲线平缓;转染实验结果显示载基因磁性纳米球能够有效转染SMMC-7721细胞,且转染效率高于载基因纳米球。普鲁士蓝染色实验结果显示磁靶向组细胞内的铁颗粒明显多于非靶向组。结论 成功制备了载基因磁性白蛋白纳米球,具有缓释基因的作用,并且能高效转染人肝癌细胞SMMC-7721。磁性白蛋白纳米球基因载体具有体外靶向性,有望作为一种潜在的靶向基因载体应用到生物医学领域。     

NT4-p53（N37）-HA2-TAT融合基因的克隆和鉴定

目的 构建NT4-p53(N37)-HA2-TAT融合基因表达盒并进行序列分析. 方法 应用互补引物二次PCR技术及T载体克隆法克隆p53(N37)基因,筛选阳性克隆、酶切鉴定并测序.扩增阳性重组质粒后用限制性内切酶切取p53(N37)和HA2-TAT片段连入pUC19/NT4质粒. 结果 克隆了p53(N37)基因,经酶切及测序证实结果正确;重组质粒pUC19/NT4-p53(N37)-HA2-TAT经限制性内切酶及琼脂糖凝胶电泳鉴定,结果显示酶切片段大小和理论值完全一致. 结论 通过基因克隆体外重组技术成功制备了含有NT4-p53(N37)-HA2-TAT表达盒的pUC/19质粒,为进一步开展肿瘤的基因治疗奠定了基础.     

尿刊酸修饰的壳聚糖介导野生型p53基因转染对人肺腺癌细胞系H1299增殖和凋亡的影响

目的： 研究尿刊酸修饰的壳聚糖(UAC)介导野生型p53(wt-p53)基因转染对人肺腺癌细胞系H1299(p53基因缺失)的增殖抑制和凋亡诱导作用。方法： UAC介导wt-p53基因转染H1299细胞后,采用荧光显微术、RT-PCR法和Western blot法分别检测细胞内绿色荧光蛋白(GFP)、wt-p53 mRNA和蛋白的表达,并通过MTT法分析基因转染对细胞的生长抑制作用,DAPI染色法和琼脂糖凝胶电泳法评价其对细胞的诱导凋亡作用。结果： UAC介导wt-p53基因转染H1299细胞后,大量细胞表达GFP,细胞内wt-p53 mRNA和蛋白表达水平明显上调,细胞生长受到显著地抑制,凋亡细胞数量明显增加,并有清晰的DNA梯状条带出现。结论： UAC介导wt-p53基因转染能够显著地抑制人肺腺癌细胞系H1299的增殖,并诱导其凋亡。     

构建一种新型穿膜活性hMsrA的酵母表达体系

【目的】 当机体代谢生成的活性氧簇超过了抗氧化系统的清除能力,可引起氧化应激而与心血管疾病、炎症、肿瘤等发生密切相关。甲硫氨酸亚砜还原酶A (methionine sulfoxide reductase A, MsrA)能够特异还原被氧化的甲硫氨酸, 是细胞内一道重要的蛋白抗氧化防御屏障。导师课题组曾构建大肠杆菌表达系统并获得人源性MsrA(hMsrA),证实其在体外的抗氧化作用。本课题试图利用酵母表达体系表达一种具有细胞穿膜活性的分泌型Pep-1-hMsrA,为进一步研究 MsrA 对细胞的抗氧化保护机制奠定基础。 【方法】 利用基因克隆技术,合成含有细胞穿膜肽的pUC19/pep-1载体,双酶切将Pep-1序列连接到pET28a/hMsrA质粒上,构建pUC19/pep-1-hMsrA,再双酶切亚克隆到酵母表达载体获得pPICZ9k/pep-1-hMsrA重组质粒。经线性化的质粒电转化导入毕赤酵母GS115,通过G418抗性筛选、PCR鉴定拷贝数,构建新的hMsrA酵母表达体系。经甲醇(0.5%V/V)诱导表达,SDS-PAGE鉴定发酵液中Pep-1-hMsrA融合蛋白的产量,利用Ni-NTA Agarose亲和层析分离纯化目的蛋白,蛋白质印迹法鉴定融合蛋白的细胞穿膜效率,利用特异荧光底物鉴定融合蛋白的催化活性。 【结果】 成功构建pPIC9k/Pep-1-hMsrA重组质粒,并筛选出17株表达Pep-1-hMsrA的GS115工程株。诱导表达并纯化的目的蛋白产量约为30~40 mg/L,SDS-PAGE显示MW为约50 kD的单一条带,糖染色表明目的蛋白糖基化。蛋白质印迹法鉴定纯化蛋白有免疫原性,并具有特异还原活性。 【结论】 建立了Pep-1-hMsrA重组蛋白的酵母表达体系,纯化的Pep-1-hMsrA存在高度糖基化可能影响其催化活性,有待进一步研究此MsrA融入蛋白的结构与功能。     

周期型马来丝虫M29基因疫苗的制备与应用

【立论依据】 丝虫病是一种严重危害人类健康的疾病,全球受威胁人口超过11亿。如何抵御丝虫感染和侵袭,除药物和防蚊外,免疫预防被视为一种重要的具有持效性的措施。本课题以我国流行的周期型马来丝虫为研究对象,克隆和表达周期型马来丝虫M29编码基因,建立M29基因真核表达体系,进行其表位基因原核及真核表达,重组构建马来丝虫M29表位基因疫苗,并进一步进行免疫学研究应用,筛选新的预防丝虫感染疫苗候选分子,为最终研制开发出具有保护作用的抗丝虫感染基因工程疫苗并进入临床奠定基础。 【设计思路】 进行研究方案及技术路线的自主设计,学习课题中所要求的引物的设计和合成技术,克隆和扩增周期型马来丝虫M29编码基因。通过RT-PCR技术和体外特异性扩增技术,进行马来丝虫M29 表位基因原核及真核的重组质粒构建以及免疫学研究与应用。 【实验内容】 克隆和扩增周期型马来丝虫M29编码基因;构建含目的基因的原核及真核表达质粒;HeLa细胞培养及转染技术实验;周期型马来丝虫M29基因疫苗免疫接种与检测。 【材料】 E.coli DH5α大肠埃希菌,pET-28a(+)载体,pcDNA3.1(+)质粒,试剂盒,限制性内切酶,DNA连接酶,异丙基β-D-硫代半乳糖苷酶,咪唑。 【可行性】 课题研究将在指导教师专用科研实验室进行,备有课题研究所需各种仪器设备,该课题是指导教师科研项目中的子项目,具有前期工作的基础。同学们利用课余时间查阅资料;到实验室进行科研实际操作;由指导教师进行理论和实际操作方面的指导;有实验室在读研究生的实际带教。同学们通过理论学习和实际操作实践掌握相关技术,培养动手能力,按期完成计划项目。 【创新性】 (1)以我国流行的周期型马来丝虫为研究对象,进行基因工程疫苗的研究。(2)采用先进的哺乳动物HeLa细胞作为真核表达系统,具备完整的蛋白质组装和修饰系统,表达产物的构象接近天然蛋白质。(3)通过设计B细胞表位,进行马来丝虫M29 表位基因疫苗叠加免疫研究。     

纳米短肽系统对子宫损伤高效修复过程的机制研究

【立论依据】 目前,临床上主要依靠清宫术、抗生素抗感染等措施来处理人流损伤,虽然诊疗器械升级快、新药问世频繁,但用于术后子宫康复的有效疗法仍为空白。本方案以“纳米短肽”为平台,探索高效修复子宫损伤的过程及机制,对提供新的临床干预技术和方法意义重大。在子宫损伤修复过程中,生长因子(GF)对内膜再生起重要作用。目前,国内主要研究人流手术方式及镇痛方案,刮宫术后多主张自愈,忽视损伤修复的质量研究。国际较早从GF着手,推动损伤的高效愈合,但传统工艺制备难而价格高、控释靶点不明,能投入相关临床实践的GF及其控释机制探索报道甚少。原因在于:定量调控损伤修复GF方面的研究较少,基础研究如高通量、高纯度GF生产技术没有突破,组织创伤的三维修复研究也不成熟等。D型短肽可自组装成纳米纤维并形成水凝胶,可支持细胞三维生长,还可维持GF及能量物质的缓慢控释。“纳米短肽-兔网织红细胞无细胞蛋白质系统”作为GF制备的新途径前景广阔。 【设计思路】 采用“纳米短肽-Cell free体系”,制备bFGF;利用bFGF修饰短肽,得到纳米网络水凝胶;最后通过SD大鼠子宫损伤修复实验,确认短肽修饰前后的实际效果,洞察其机制并建立“纳米三维微环境-GF损伤快速修复”的假说,为临床应用打下基础。 【实验内容】 (1)利用“短肽-Cell free体系”,制备bFGF。(2)合成、连接、纯化得到含修饰bFGF的纳米短肽。(3)短肽理化检测,自组装效能及GF控释分析。(4)构建SD大鼠子宫损伤模型,评估修复效果,建立数学模型和假说。 【材料】 SD大鼠、新西兰大白兔、PET系列载体、短肽。 【可行性】 目标短肽模板得到国家专利授权,本方案是对其理论和应用的创新。本方案拥有“短肽-Cell free体系”及其相关技术规范。预实验中,动物实验模型损伤修复效果明显。 【创新性】 应用“短肽能量泵”优化“cell-free 体系”,制备GF。采用短肽控释GF,对子宫损伤进行快速修复。将GF制备与子宫损伤修复整合为一套完备的修复策略,在控制炎症反应、减少瘢痕产生、保护子宫上实现突破,国内外尚无报道。     

青岛地区大肠埃希菌中整合子与耐药性的分析

【立论依据】 大肠埃希菌是临床常见的条件致病菌,耐药率有逐年上升的趋势。近年研究表明,整合子在细菌多重耐药性的形成和水平传播中发挥重要作用,且整合子的分布及其携带的基因盒存在明显的地区差异性。因此,检测不同地区大肠埃希菌中整合子的分布及耐药基因盒,对于控制细菌耐药及合理应用抗菌药物具有重要的指导意义。 【设计思路】 本研究通过检测青岛地区临床分离的大肠埃希菌中I类、II类及III类整合子的分布及携带的耐药基因盒,分析整合子与耐药表型的关系,旨在探讨整合子在介导大肠埃希菌耐药中的作用。 【实验内容】 琼脂纸片扩散法进行药敏试验;分别设计针对I、II、III类整合子整合酶基因及可变区的PCR引物,PCR检测整合子的整合酶基因,对整合酶基因阳性菌株进行可变区基因的PCR扩增,回收纯化的PCR产物克隆至T载体,将筛选鉴定的重组子送往华大基因公司测序,测序结果经在线Blast及DNAstar软件进行同源性比对分析,确定整合子携带的耐药基因盒。应用SPSS 21.0统计软件分析大肠埃希菌耐药性与整合子的相关性。 【材料】 78株大肠埃希菌分离自青岛市立医疗集团住院患者的各类标本,细菌DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司,PCR引物由Invitrogen公司合成,pMD18-T载体购自大连TaKaRa公司。 【可行性】 前期研究结果表明:78株大肠埃希菌对环丙沙星、左氧氟沙星、头孢唑林、头孢呋辛、复方新诺明、氨曲南、头孢曲松及哌拉西林的耐药率均超过70%;I类整合子的携带率为53.89%,其中I类整合子阳性菌株对复方新诺明的耐药率明显高于整合子阴性菌株,差异有统计学意义(P<0.05);I类整合子可变区检测出3种不同长度的片段:2株750 bp片段不携带耐药基因盒,8株1 800 bp片段携带dfrA17-aadA5 基因盒,1株1 200 bp片段为aadA22基因盒;I类整合子阳性菌株中携带耐药基因盒的菌株占61.90%,对复方新诺明的耐药率明显高于基因盒阴性菌株(P<0.01)。 【创新性】 首次研究青岛地区大肠埃希菌中整合子的分布及其携带的耐药基因盒,探讨整合子与大肠埃希菌耐药性的关系。     

腺病毒介导的CD基因在人胰腺癌细胞中的靶向性表达

【目的】探讨腺病毒介导的大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶 (E .coliCD)基因在胰腺癌细胞中靶向性表达的可能性及其作用。【方法】将含癌胚抗原 (carcinoembryonicantigenCEA)启动子的重组腺病毒感染人胰腺癌SW1990细胞 (CEA )、Capan 2细胞 (CEA-)和人宫颈癌Hela细胞 ,观察CD基因在 3种细胞中的表达及细胞对 5 FC的敏感性差异。【结果】腺病毒介导CD基因仅在SW1990细胞中呈专一性表达 ,转导CD基因的SW1990细胞对 5 FC的敏感性明显提高。【结论】含CEA启动子的CD基因疗法可能是胰腺癌靶向性基因治疗的可行途径。