去细胞肝支架诱导大鼠损伤肝脏再生的研究

【立论依据】 基于结合国内外对肝脏去细胞的研究及前期的基础,利用肝脏去细胞支架在体内诱导损伤肝组织的修复与再生。以解决肝功能衰竭供体缺乏,在外科手术后损失修复与再生的空缺。 【设计思路】 制造肝损伤模型研究去细胞支架对于肝脏损伤修复及再生的作用。 【实验内容】 通过外科手术造成大鼠肝脏损伤,移植去细胞支架修补创面;检测去细胞基质内生长因子含量与移植后支架内细胞的类型;观测移植后肝脏形态及内部结构的改变与蛋白表达情况。 【材料】 去细胞肝脏支架。 【可行性】 去细胞支架相较于其他生物材料具有完全模拟机体细胞的生存环境;去细胞支架含有的一系列黏附分子及生长因子是细胞与组织再生的关键因素;运用去细胞支架体外培养细胞已初具成效。 【创新性】 相较国外针对去细胞支架的体外研究,体内移植能模拟真正的体内生理环境;运用新型生物材料修复肝损伤。     

Klotho对脊髓继发性损伤的调节作用及机制研究

【立论依据】 脊髓损伤(SCI)后,病灶区炎症反应、氧化应激、神经细胞凋亡所引起的继发性损伤是创伤后神经功能障碍和影响修复再生的主要原因。已知,Klotho基因缺失鼠(KL-/-)的表型类似人类的衰老表现,包括寿命缩短、动脉硬化、皮肤肌肉萎缩、认知障碍、运动神经元受损、软组织钙化、听力下降、骨质疏松等,但Klotho在中枢神经损伤领域的研究,还知之甚少。 【设计思路】 本项目将发现klotho对脊髓损伤修复的调节作用,明确klotho通过调节氧化应激及细胞凋亡的作用,阐明klotho对中枢神经系统损伤修复的调节机制。 【实验内容】 确立Klotho过表达的脊髓损伤动物模型;评估Klotho促进损伤后运动功能恢复的作用;观察神经组织形态学的改变,评估Klotho对神经胶质瘢痕形成的影响;分析ROS、SOD、8-ohdg等氧化应激及细胞凋亡水平,并筛选其作用靶分子,阐明其作用机制。 【材料】 利用干细胞联合基因治疗手段,将骨髓间充质干细胞(BMSCs)作为基因搭载受体,使其过表达klotho基因,并移植到脊髓损伤大鼠模型。 【可行性】 辽宁医学院神经生物学教研室和辽宁医学院神经退行性疾病实验室(辽宁省重点实验室)一直从事神经系统损伤的基础研究,并熟练掌握各种实验技术和方法,并且拥有研究所需的实验场所和设备,因此对完成本课题具有较强的优势。 【创新性】 揭示Klotho对神经细胞的保护作用机制,为研究脊髓损伤的基础研究和新型神经营养药物的研发,提供基础。     

靶向/促穿膜双功能肽介导的肿瘤靶向基因递送系统的构建及其抗肿瘤作用研究

【立论依据】 基因治疗(gene therapy)现已成为攻克肿瘤最具潜力,也是研究最活跃的领域,许多学者为基因治疗能成功应用于临床进行了大量相关研究。要成功地实施基因治疗,必须具备3个关键因素:针对性的治疗基因;基因传递系统;基因表达调节系统。基因传递系统是基因治疗的核心技术,而转染效率与细胞毒性相矛盾、稳定性与穿膜能力相矛盾以及靶向性差,是基因递送系统存在的3个关键问题。本课题旨在为肿瘤的基因治疗寻找到一种兼具高转染效率、高肿瘤细胞和组织特异靶向性及良好安全性和体内外稳定性的基因递药系统。 【设计思路】 首选通过将低分子量聚乙烯亚胺(LMW-PEI)连接到能形成单分子聚合物胶束的普朗尼克(Pluronic)表面,制得PEI衍生物;然后采用固相法合成兼具靶向和促穿膜作用的双功能短肽DR5-TAT(D21),其中DR5短肽对正常细胞无毒副作用、对肿瘤细胞具有高特异性和高选择性且自身具有抗肿瘤活性,TAT是具有促细胞穿膜作用的穿膜肽;再利用SMCC法将D21与Pluronic-PEI偶联,构建肿瘤靶向纳米基因载体递送系统(D21-Pluronic-PEI),并对其体内外性能进行评价。 【实验内容】 (1) Pluronic-PEI的合成,DNA/Pluronic-PEI纳米胶束的制备及其性能考察;(2) D21-Pluronic-PEI的构建及其性能考察; (3)载p53的靶向纳米非病毒基因给药系统 (p53/D21-Pluronic-PEI)的制备及其体内靶向特性和抗肿瘤效果评价 【材料】 分支状聚乙烯亚胺Pluronic 123 (Mw=2000 Da),DR5短肽,细胞穿膜肽TAT,p53等。 【可行性】 项目组有一定的专业基础,具有较强的创新意识和研究探索精神,具备开展该项目的素质与能力。该实验设计思路新颖、制定的项目方案切实可行,具有可靠的实施条件,可以保证该训练计划实施成效。项目组所在学校对学生实践创新及实验实训一贯积极支持和鼓励,匹配经费到位,配套扶持政策完善。因此,项目开展所需的人员、场地、实验设备、材料和经费等条件均可以保证。 【创新性】 (1)本课题拟采用不同PO/EO比的Pluronic连接低分子量PEI,并在此基础上合成具有可实现肿瘤靶向和具促穿膜作用的双功能短肽DR5-TAT(D21),将其与所得的PEI衍生物偶联,得到高效、低毒的新型基因靶向载体系统 (D21-Pluronic-PEI),该研究国内外尚未见报道。(2)重组人p53腺病毒注射液已应用于临床,但该药选择的载体为病毒基因载体-5型腺病毒,本课题拟采用高效,低毒且可主动靶向肿瘤细胞的新型聚阳离子载体系统(D21-Pluronic-PEI)作为p53载体,拟为p53的应用开辟新途径,国内外未见相关报道,具有潜在的应用价值。     

具有抗氧化活性的含硒短肽的研制

【立论依据】 硒蛋白是微量元素硒发挥生物学功能的主要形式。人体中硒蛋白在抗氧化、抗肿瘤和调节免疫等方面都具有显著的作用,其中抗氧化活性是多种硒蛋白最核心的生物学功能。研制一种具有潜在应用价值的、类似于硒蛋白的抗氧化活性的含硒短肽具有重要意义。 【设计思路】 选取抗氧化活性最强的硒蛋白如硒蛋白P、谷胱甘肽过氧化物酶等,设计出3~5种含硒代半胱氨酸活性中心的硒蛋白截短型的短肽,根据硒蛋白基因表达的特殊性构建其表达载体及其哺乳动物细胞表达体系,实现此类含硒短肽的准确、高效的翻译,再通过抗氧化检测筛选出具有应用开发价值的短肽。 【实验内容】 (1)用于硒蛋白基因工程表达的哺乳动物细胞株的建立:选择在人类硒蛋白翻译过程中将编码硒代半胱氨酸密码子TGA正确解码时起着重要作用的3个反式作用因子,即SECIS 结合蛋白2(SBP2)、Sec特异延伸因子(EFSec)和核糖体蛋白L30(RPL30),将它们的编码基因分别克隆并构建为1个三基因表达载体pcDNA3.1-SBP2/Efsec/RPL30,稳定转染HepG2细胞系获得目的基因高表达的单克隆细胞株;(2)利用生物信息学的方法,筛选和设计硒蛋白截短型的短肽,并将其编码基因插入真核表达载体pcDNA4HisMaxB获得相应的重组载体;(3)利用各重组载体分别对已建立的转基因细胞株进行稳定转染,使目的基因表达并纯化获得含硒短肽;(4)利用常规的抗氧化检测方法,考察各种含硒短肽体外抗氧化活性,并筛选出最佳者用于后续研究。 【材料】 人肝癌细胞系HepG2;质粒pcDNA3.1、pcDNA4HisMaxB;各种基因工程工具酶及常规试剂;细胞培养及转染试剂;抗氧化检测试剂盒等。 【可行性】 硒蛋白复杂的翻译机制已经逐渐阐明,在原核生物细胞中利用反式作用因子提高硒蛋白表达已取得成功,为真核表达提供重要的启示,我们的设计在理论上是可行的;实验室相关技术方法及条件成熟,完全可满足本研究的要求。 【创新性】 具有抗氧化活性的硒蛋白分子量大限制了其药用价值,我们研究中将获得截短型的含硒短肽从而使其具有应用开发价值。此外,应用3个反式作用因子构建硒蛋白基因工程表达体系也是本研究的一个创新。     

细胞穿膜-靶向双肽修饰紫杉醇纳米制剂的制备、表征及体外抗胶质瘤评价

目的 以胶质瘤U251细胞为研究对象,制备细胞穿膜-靶向双肽修饰的紫杉醇纳米制剂(TN-PTX),研究其性质及体外抗肿瘤活性。 方法 采用噬菌体展示技术体外筛选与U251细胞特异性结合的靶向肽;界面沉淀法制备紫杉醇(PTX)纳米粒,将靶向肽、细胞穿膜肽TAT修饰于其表面,制备TN-PTX;对TN-PTX的粒径、Zeta电位、载药量、形态外貌、体外释放等方面进行表征; CCK8实验探讨TN-PTX对U251细胞增殖能力的影响。 结果 筛选的靶向肽HK特异性良好,TN-PTX的粒径为350.5±31.8nm,Zeta电位为-31.9±5.0mV,载药量为5.01%,形貌基本呈圆球形,分布较均匀,体外释放缓慢。PTX浓度相同时,TN-PTX对U251细胞的杀伤作用比PTX强。 结论 TN-PTX性质稳定,具有一定缓释作用,在细胞水平对U251细胞具有更强的细胞毒性作用。     

凋亡抑制蛋白ILP-2对乳腺癌细胞MCF-7氧化应激损伤的保护作用

【立论依据】 文献表明氧化应激会损伤体内核酸等生物大分子物质而促进肿瘤的发生发展;凋亡抑制蛋白ILP-2在生长中的乳腺癌有高表达,由此,我们猜想乳腺癌中高表达的ILP-2可能与氧化应激的损伤作用存在联系 【设计思路】 实验以乳腺癌细胞株MCF-7制备氧化应激的细胞模型,研究氧化应激状态下MCF-7内ILP-2的表达情况;RNAi ilp-2基因表达,分析ILP-2与氧化应激损伤之间的关系 【实验内容】 利用H2O2对乳腺癌细胞株MCF-7进行氧化应激造模,流式细胞术(flow cytometry, FCM)检测细胞内活性氧簇(reactive oxygen species,ROS),分光光度法检测丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)水平;通过瞬时转染敲低MCF-7 ilp-2表达,利用RT-PCR和蛋白质印迹法检测基因和蛋白质表达情况;干扰细胞ilp-2表达并同时进行氧化应激处理,通过MTT、Scratch、FCM等方法检测细胞的存活状态 【材料】 乳腺癌细胞株MCF-7,H2O2,转染试剂,RNeasy Mini Kit,QuantiFast Probe Assay,RIPA 裂解液,一抗,二抗,ROS试剂盒,GSH试剂盒,MDA试剂盒,MTT试剂盒等。 【可行性】 该研究内容所需技术在生物分子研究领域已经非常成熟,所需设备完善,可操作性强 【创新性】 首次研究ILP-2促癌细胞生长作用与氧化应激损伤之间的关系,为进一步阐明ILP-2的作用机制奠定基础。     

磁场下制备的γ-Fe2O3膜对成骨细胞分化作用的效果研究

【目的】 骨质疏松症已成为世界公共卫生问题,针对骨质疏松症的基础及临床研究是目前国际研究的热点。目前已有实验证明PLA/γ-Fe₂O₃复合膜对于细胞的分化具有促进作用,但是由于复合膜是自然晾干的,纳米磁性材料分布不均,对细胞的生长不利,为了将这种材料的性能优化,根据在磁场下,磁性纳米粒子分布更加均匀的特性,通过实验验证在磁场下制备的磁性纳米材料对于细胞分化的促进作用更加明显。 【方法】 因为PLA在复合膜中起到支架和黏附作用,所有本项目将首先在磁场条件下组装纳米材料膜(γ-Fe₂O₃膜),研究其对成骨细胞的影响。利用qPCR、ALP等检测方法对不同组细胞的分化情况进行对比,并分析各项检测结果得出结论。然后进一步在γ-Fe₂O₃膜的基础上用PLA粘附,并对其对于成骨细胞的生长分化的作用进行研究。 【结果】 ALP染色结果:在磁场下制备的纳米磁性材料上接种的细胞染色明显比自然晾干的磁性纳米材料上接种的细胞颜色深且分散;qPCR检测结果:Oc、BMP2、ALP三种成骨细胞标志性基因的qPCR结果显示,在磁场下制备的纳米磁性材料上接种的细胞几种标志性基因含量明显比自然晾干的磁性纳米材料上接种的细胞含量多,且随着磁场强度的增强,基因含量随之增多。 【结论】 自然干的纳米材料+玻片上接种的细胞分化情况明显不如在磁场下组装的纳米基底,而且在不同场强下组装的纳米基底中随着场强增大,细胞分化生长均越来越好。磁场下组装的纳米材料对于细胞分化的促进作用要优于自然晾干的复合膜,且随着场强的增大,促进作用愈加明显。     

壳聚糖耦联杂大环Cu(II)配合物的制备及其催化释放NO性能

【目的】 寻求高效低毒的内源性一氧化氮供体型前药,并探究其在生理条件下催化一氧化氮前驱体释放一氧化氮性能。 【方法】 采用常规法与微波法考察关键中间体制备条件;应用壳聚糖成膜策略耦联杂大环Cu(II)化合物,通过¹HNMR、¹³CNMR、SEM等手段对中间体及目标前药分子的结构和组成进行表征;利用重氮化反应探究其催化一氧化氮前驱体释放一氧化氮性能。 【结果】 (1)探寻出关键中间体的高效、节能制备方法;(2)成功制备并表征了各中间体及其目标前药;(3) 制备的目标前药具有良好的催化一氧化氮前驱体释放一氧化氮性能。 【结论】 为人工合成高效低毒的一氧化氮供体型前药的设计开辟了新思路,也为一氧化氮的供药方式提出了新的供药途径。     

旋毛虫副肌球蛋白与补体C9结合位点的研究

【目的】 旋毛虫病是呈全球性广泛分布的食源性人兽共患寄生虫病。旋毛虫副肌球蛋白(trichinella spiralis paramyosin,Ts-Pmy)是本课题组首次发现的抗原蛋白。前期研究结果表明,该蛋白通过与补体膜攻击复合物(MAC)组分C9结合,阻碍MAC组装,使虫体逃避补体系统的杀伤。本课题将精确定位Ts-Pmy与补体C9的结合位点,为深入研究Ts-Pmy免疫调节功能奠定基础。 【方法】 将Ts-Pmy分段表达为多个重组截短片段以及合成短肽,利用蛋白质印迹(Western-blot)和斑点印迹(Dot-blot)方法检测截短片段以及短肽与补体C9的结合能力,以定位Ts-Pmy与补体C9的结合位点。通过对Zn²⁺诱导的补体C9聚合反应以及红细胞裂解实验,研究结合位点多肽的功能。进一步制备了抗结合位点多肽的单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb)。在鉴定单抗的亚型、亲和力和特异性的基础上,通过单抗体外结合抑制实验和体内被动免疫保护实验鉴定单抗的功能。 【结果】 精确定位Ts-Pmy与补体C9的结合位点位于Ts-Pmy羧基端14个氨基酸残基的区域,即第866位缬氨酸至第879位甲硫氨酸(VSMGKSLSSKVYVM)。结合位点多肽可抑制Zn²⁺诱导的补体C9聚合反应以及红细胞的细胞溶解反应,具有与全长Ts-Pmy相似的功能。制备的mAb 9G3可与旋毛虫不同发育阶段的天然Pmy和重组Ts-Pmy特异识别,且能够抑制Ts-Pmy与补体C9的结合。通过小鼠尾静脉被动回输mAb 9G3,肌幼虫减虫率可达42.6%。 【结论】 精确定位了Ts-Pmy与补体C9的结合位点,获得的抗结合位点多肽的mAb 9G3是一株具有免疫保护性的抗体。上述研究为抗旋毛虫病疫苗及基因工程抗体的研制提供了精确的分子靶标。     

去乙酰化酶SIRT1调控PFOA诱导小鼠肝损伤的作用及机制研究

【立论依据】 流行病学调查发现,全氟辛酸(PFOA)和人类多种疾病密切相关。我们前期研究发现PFOA可通过氧化应激、炎症反应和诱导凋亡引起小鼠肝脏毒性损伤。去乙酰化酶SIRT1在细胞应激反应中具有关键作用,可引起多种转录因子去乙酰化,从而促进细胞存活,抑制凋亡。因此,我们提出:“SIRT1的去乙酰化修饰可能对PFOA诱导的小鼠肝损伤起保护作用”。 【设计思路】 在前期研究的基础上,探讨PFOA肝脏毒性与SIRT1表达和反应活性的相关性;利用SIRT1激活剂以及SIRT1抑制剂观察SIRT1信号通路对PFOA诱导的肝脏毒性损伤的调控作用;通过检测P53、NF-κB p65 和FOXO3a的表达和乙酰化水平,分析SIRT1系统调控PFOA肝脏毒性的分子机制,是否与SIRT1对P53、NF-κB p65 和FOXO3a的去乙酰化修饰有关。 【实验内容】 (1)Real-time PCR和蛋白质印迹方法检测SIRT1的表达,免疫共沉淀法检测SIRT1的反应活性,对比正常对照和PFOA染毒小鼠,明确PFOA肝脏毒性与SIRT1的相关性;(2) PFOA染毒小鼠给予SIRT1激活剂SRT1720以及SIRT1抑制剂尼克酰胺,石蜡切片HE染色观察肝组织病理学改变;全自动生化分析仪检测ALT、AST、ALP及LDH的血清水平;酶联免疫分析IL-6、COX-2及CRP的肝组织水平;免疫组化检测DNA氧化损伤标志物8-OHdG的产生;比色法检测MDA生成及SOD、CAT和GSH-PX的活性;TUNEL染色法观察细胞凋亡;real-time PCR和蛋白质印迹方法检测Bcl-2、Bax、Fas、FasL等凋亡相关基因的表达,明确SIRT1通路的激活或抑制对PFOA诱导肝脏损伤的调控作用;(3)应用乙酰化赖氨酸抗体通过蛋白质印迹方法检测P53、NF-κB p65 和FOXO3a的乙酰化水平,分析SIRT1是否通过对P53、NF-κB p65 和FOXO3a的去乙酰化修饰调控PFOA诱导的肝脏毒性损伤。 【材料】 本项目以小鼠为实验动物,实验仪器包括实时荧光定量PCR仪、全自动DNA扩增仪、紫外可见分光光度计、石蜡切片机、高速低温离心机、蛋白电泳系统、电转仪、全自动生化分析仪等。 【可行性】 本项目充分分析了国内外研究现状和发展前景,并取得了较好的前期研究基础。 【创新性】 SIRT1对PFOA肝脏毒性的调控作用尚未见报道,本实验项目研究SIRT1对PFOA诱导肝损伤的保护作用及其分子机制,为预防和治疗全氟化合物引起的肝脏损伤寻找新靶点。     

靶向肿瘤干细胞的双模态分子探针的制备与表征

【立论依据及设计思路】 肿瘤干细胞具有无限自我更新能力,与肿瘤的生长、转移和复发具有密切联系。CD133是目前研究最为广泛的肿瘤干细胞表面特异性标志物。前期研究结果已经证实胰腺癌组织与细胞中均存在CD133⁺肿瘤干细胞。本设计以胰腺癌干细胞为着眼点,以其特异性标志物CD133 为靶点,制备表面耦连抗CD133单克隆抗体, 以稀土上转换发光纳米材料(UCNPs)、顺磁氧化铁(SPIO)为显像剂,涵盖MRI和光学两种成像信号的多模态分子影像探针,并通过体内外实验验证其生物安全性及靶向性。 【实验内容】 (1)改良化学共沉淀法制备SPIO并通过修饰将二羧基PEG连接到表面;(2)热分解及配体交换法制备UCNPs并修饰;(3)通过SPIO表面羧基与UCNPs表面氨基的酰胺化反应,制备SPIO/UCNPs复合纳米材料;(4)MTT,溶血实验、微核实验、半数致死量实验等评价 SPIO/UCNPs的生物安全性;(5)酰胺化反应将抗CD133抗体耦联到SPIO/UCNPs纳米复合物表面,得到最终的双模态探针;(6)双模态分子影像探针(CD133mAb-SPIO/UCNPs)的表征及亲和力、体内代谢、体内分布、体内外靶向实验。 【材料】 氯化钇、氯化镱、氯化铒、正硅酸四乙酯、氟化铵、聚丙烯酸、CD133抗体、二羧基聚乙二醇、十六烷基三甲基溴化铵、人胰腺癌细胞系PANC-1、NOD-SCID小鼠。 【可行性】 (1)前期工作:已熟练掌握UCNPs及SPIO的制备与修饰方法,并已完成SPIO/UCNPs复合纳米材料的制备及部分生物安全性评价实验。(2)实验平台:依托教育部分子影像重点实验室。 【创新性】 (1)利用多模态分子影像技术追踪肿瘤干细胞,是一种可以在活体条件下进行的、无创、动态、高分辨率的特异性靶向检测方法,为肿瘤的早期诊断、治疗决策、疗效监测、预后评估等问题提供了新的解决思路;(2)经文献查新检索,表面耦连抗CD133单克隆抗体, 以SPIO、UCNPs为显像剂,涵盖MRI和光学两种成像信号的双模态分子影像探针,国内外未见报道。     

基于纳米颗粒的生物分子传感新方法

【立论依据】 通过在微米结构中堆积纳米颗粒形成的纳流体晶体具有单根纳米通道的电动力学特性,即低离子浓度溶液中,通过晶体的电导与颗粒表面的电荷密度成正比而与溶液中的离子浓度无关。蛋白质和核酸分子都是带有极性的生物大分子,在结合到纳米颗粒表面的时候会改变纳米颗粒表面的电荷密度。通过纳流体晶体的理论电动力学模型可以测量生物大分子的浓度。另外,核酸适配体是一种能和特定蛋白实现特异性结合的核酸片段,适配体本身除了可以结合特定蛋白分子之外,还能提升纳米颗粒表面的电荷密度改变量。 【设计思路】 (1)以人α-凝血酶分子作为模型蛋白,通过在纳米颗粒的表面修饰特异性的α-凝血酶核酸适配体探针,然后在微米孔芯片中堆积成纳流体晶体,通过电泳的形式让含有低浓度凝血酶分子的待测溶液通过纳流体晶体通道,通过适配体结合分子后造成纳米颗粒表面电荷密度改变,通过计算改变量,进而实现对α-凝血酶浓度的检测。(2)为了进一步提高灵敏度,利用“适配体1-凝血酶-适配体2”的类三明治结构,即在原来的基础之上,将待测的α-凝血酶分子结合上适配体-2,然后通过纳流体晶体。因为结合上核酸适配体-2之后,蛋白的带电量增加,结合在纳米颗粒表面之后使得颗粒表面的电荷密度变化更加明显,理论上的检测灵敏度会增加。此外,核酸适配体-2与适配体-1在α-凝血酶上结合位点不一样,因此互不影响。进样方式依然采用电泳方式。 【实验内容】 (1)在纳米颗粒表面结合α-凝血酶适配体探针;(2)利用上述纳米颗粒构建纳流体晶体;(2)通过电泳使待测凝血酶溶液通过晶体通道,并检测电导变化;(3)在凝血酶上结合特异性适配体,通过电泳加样,再次检测电导变化。 【材料】 人α-凝血酶溶液,特异性α-凝血酶适配体探针1和2,纳米颗粒溶液,电导检测电极 【可行性】 (1)通过晶体的电导与颗粒表面的电荷密度成正比而与溶液中的离子浓度无关的特性在生物传感器方面理论上已经完全成熟,基于此原理的纳流体传感器也已初步实现。(2)核酸适配体探针的特性研究已经相对透彻。 【创新性】 本实验首次设计出“适配体1-蛋白-适配体2”的三明治结构并应用于传感器中,相比较于“适配体-蛋白”传感器极大提升了传感器检测的灵敏度。     

MNPs-exosomes联合载药系统的制备及其在肿瘤治疗中的可行性探索

【立论依据】 药物靶向输送系统在肿瘤治疗中至关重要。磁性纳米颗粒(MNPs)可在外磁场引导下使其负载药物定向于肿瘤组织,达到肿瘤化疗中低毒高效的目的。然而,它的非生物源性使它不能在体液和组织中稳定地存在。Exosomes是一种由体内多种细胞释放的、直径介于50~150纳米的微囊体。因不引起补体或凝血因子的激活,以及难以被单核巨噬细胞吞噬,故可以在体内稳定存在,也是药物的理想载体。但由于靶向性较弱,难以富集至肿瘤组织。 【设计思路】 本项目拟设计并制备MNPs-exosomes二者联合的载药系统,以达到优势互补的效果,并通过体内外实验探讨其是否具有协同效应,从而为构建肿瘤靶向给药系统提供一种新思路。 【实验内容】 (1)制备3种药物载体:MNPs、exosomes、MNPs-exosomes联合载药体;(2)将3种药物载体分别与药物结合:选用多柔比星;(3)体内外实验验证其靶向性;(4)体内外实验评价其治疗效果。 【材料】 RAW-264.7细胞、HEPG-2细胞、MNPs、四氧化三铁悬液、250nm二氧化硅粒子悬液、聚苯乙烯、甲苯。 【可行性】 本课题组已进行了制备MNPs-exosomes联合载药体的预实验,实验结果符合预期。在以往的研究中,我们已经掌握了进行上述实验所需要的技术和方法,具备一定的科研悟性和热情,可以完成此研究。 【创新性】 (1)首次提出将MNPs与exosomes联合载药,通过二者的优势互补,来观察联合体是否具有协同作用;(2)我们拟通过制作超小粒径分子筛分离提纯exosomes,避免了传统方法的弊端。     

同型半胱氨酸经PRMTs调控E2F1 差异甲基化介导内皮细胞凋亡和平滑肌细胞增殖的作用机制研究

【立论依据】 动脉粥样硬化(AS)是以退行性和增生性病变为特征的复杂性疾病,高同型半胱氨酸血症(HHcy)是其独立危险因子。内皮细胞(ECs)和血管平滑肌细胞(VSMCs)是HHcy致AS形成的基本细胞类型,但两者的病理变化却截然相反:ECs主要表现为凋亡、损伤和功能障碍;而VSMCs则主要表现为增殖、基质合成和分泌亢进;有研究提示E2F1可因修饰位点不同而分别调控细胞的凋亡和增殖,是决定细胞增殖或凋亡的"开关",但其在Hcy致ECs凋亡和VSMCs增殖并存中的具体作用未见报道。 【设计思路】 E2F1是既能促增殖亦能促凋亡的关键靶基因,Hcy经PRMTs修饰E2F1 不同位点导致血管ECs凋亡和VSMCs增殖并存从而引起As。 【实验内容】 复制HHcy AS模型,验证模型是否成功;分析血管组织中ECs凋亡和VSMCs增殖的变化,并在体外培养ECs和VSMCs上验证;检测E2F1在血管和两种细胞中的表达,在HHcy致ApoE^-/-鼠AS模型和ECs/VSMCs共培养的基础上确定E2F1在Hcy致ECs凋亡和VSMCs增殖并存中的作用。分别在ECs和VSMCs及共培养的细胞内过表达和沉默PRMTs,检测E2F1修饰后产物的变化,并以流式细胞术等观察ECs凋亡和VSMCs增殖情况,探讨不同细胞类型中E2F1 精氨酸甲基化的作用及调控机制。 【材料】 ApoE^-/-鼠;核酸提取试剂盒;细胞培养系统;限制性内切酶; DNA甲基化试剂盒;PCR试剂盒;PCR仪;高速冷冻离心机;恒温摇床紫外凝胶成像系统;琼脂糖电泳系统等。 【可行性】 本课题经导师组老师仔细论证并完成了一部分实验,证实研究方案具有较高的可行性;本课题依托我校心脑血管疾病实验室,该室主要从事表观遗传学修饰在Hcy致AS作用机制研究,研究经验丰富,实验技术成熟稳定,具备本课题所需的平台和设备;课题组成员作为生物技术班的学生,已在实验室工作了一年时间,为本课题的顺利实施提供保障。 【创新性】 首次揭示以"Hcy经PRMTs调控E2F1精氨酸甲基化修饰致ECs凋亡和VSMCs增殖中的潜在差异"为核心的基因表达调控通路。     

纳米二氧化钛诱发氧化应激大鼠肾脏毒性的研究

【立论依据】 纳米二氧化钛(nano-TiO₂)广泛应用于工业、农业、食品、医药等领域,为人们的生产、生活带来便利的同时,其生物安全性也越来越备受关注,是近年来的一个研究热点领域。目前,对TiO₂纳米材料毒性研究多局限于机体健康状态下,而基于机体的疾病状态,尤其是机体氧化应激状态下的纳米材料毒性研究鲜有报道。 【实验内容】 通过肌肉注射四氧嘧啶构建SD大鼠氧化应激模型,通过对健康和氧化应激大鼠进行0.5、5及50 mg/kg体重剂量的TiO₂纳米材料染毒,探讨其对肾脏组织的潜在不良影响。 【材料】 TiO₂纳米材料,四氧嘧啶,尿素氮(BUN)及超氧化物歧化酶(SOD)酶等联免疫吸附试剂盒,雄性SD大鼠,苏木精-伊红(H-E)染料。 【可行性】 前期文献调研扎实。西安医学院的SPF动物实验室,可饲养动物并进行动物实验。指导教师所在的基础医学部基础研究所有石蜡切片机等设备。指导教师从事纳米材料毒性方面的研究,可提供了强有力的技术保障及稳定、可靠的试剂供应。 【创新性】 临床上,糖尿病肾病是糖尿病最严重和最常见的慢性并发症之一,其发病机制比较复杂,但氧化应激在糖尿病肾病的发生、发展中起非常重要作用。但现在关于TiO₂纳米材料对疾病状态(尤其是氧化应激状态)的机体的毒性研究鲜有报道。基于此,本研究利用大鼠氧化应激模型,通过对健康和氧化应激大鼠进行低、中、高剂量TiO₂纳米材料染毒,探讨其对肾脏组织的潜在不良影响,希望能为纳米TiO₂的安全使用及毒性的科学预防提供了可靠参考和实验依据。     

PI3K/Akt/GSK-3β/β-catenin信号通路对局灶性脑缺血再灌注大鼠神经元保护的实验研究

【目的】 探讨PI3K/Akt信号通路在大鼠脑缺血再灌注损伤中对Wnt/β-catenin信号通路的影响。 【方法】 健康雄性SD大鼠96只,采用longa法建立局灶性脑缺血再灌注模型,随机分为4组:假手术组(S组)、脑缺血再灌注组(I组)、脑缺血再灌注+bFGF后处理组(bFGF组)、脑缺血再灌注+bFGF后处理+LY294002(LY组),各组24只大鼠。各组依据缺血后再灌注时间点12、24、48、72 h再分4个亚组。应用H-E染色、TUNEL法检测皮质组织形态变化及细胞凋亡情况。采用免疫组织化学法、原位杂交法、蛋白质印迹法分别检测在各组皮质不同再灌注时间点P-Akt、GSK-3β mRNA、β-catenin的表达变化。 【结果】 免疫组织化学法检测P-Akt蛋白水平, I组和LY组每一灌注时间点都高于S组表达水平,24 h达高峰。bFGF组各亚组皮质P-Akt表达均较I组和LY组各亚组表达增多(P<0.05)。应用原位杂交和蛋白质印迹技术分别检测GSK-3β mRNA和β-catenin在缺血再灌注皮质的表达。I组和LY组各亚组缺血皮质GSK-3β mRNA和β-catenin表达高于S组,分别在48 h和72 h达高峰。与I组和LY组比较,bFGF组各亚组缺血皮质GSK-3β mRNA表达明显降低,而β-catenin蛋白表达却显著增高(P<0.05)。说明bFGF在缺血再灌注皮质通过激活Akt,抑制GSK-3β的活性,拮抗由GSK-3β、axin和结肠多发性息肉样蛋白(APC)组成的复合物,使β-catenin不能被磷酸化,游离的β-catenin在细胞浆内蓄积,继而进入胞核,促进Wnt靶基因转录,抑制细胞凋亡。从两条通路主要成员激活的时间上,Akt在皮质缺血再灌注后24 h达高峰,而β-catenin是缺血再灌注后持续增高,一直到72 h达高峰。提示β-catenin参与了脑缺血再灌注PI3K/Akt激活后的信号传导路径,Akt对β-catenin的调控作用同样在缺血性脑损伤中发挥作用,即Akt-GSK-3β-β-catenin。 【结论】 脑缺血再灌注损伤中PI3K/Akt信号通路通过GSK-3β可以调控Wnt信号通路主要成员β-catenin,这为深入研究β-catenin在缺血性脑损伤中的作用机制提供重要线索。     

DNA复制起始的复制压力诱导子代细胞非对称分布的染色体损伤

【立论依据】 细胞对染色体在有丝分裂后子代中分布的精密调控是生物遗传过程中最基本的特征之一。迄今对染色体在有丝分裂过程中的编程机制尚不清楚。本研究着力于研究DNA复制起始位点的复制压力所诱导的DNA损伤在子代细胞中的分布信息。 【设计思路】 通过对细胞周期的同步化处理,在DNA复制起始位点诱导复制压力,再免疫荧光染色观察染色体损伤在下一个细胞周期子细胞中的分布。从DNA损伤的角度探讨染色体分布的可能调控机制和生理意义。 【实验内容】 (1)用去血清方法将大部分细胞同步于细胞周期的G₁期,通过流式细胞术进行鉴定;(2)在细胞进入G₁期后给予血清培养,使细胞同步化开始DNA复制,实验组给予APH(DNA聚合酶抑制剂)干预,对照组给予不含APH的血清。同时加入脱氧核苷酸异构物EdU(5-ethynyl-2'-deoxyuridine)参与合成中的DNA,并可作为后续荧光标记DNA复制的起始位置;(3)流式细胞术观察细胞周期进入有丝分裂M期和到达下一个细胞周期G₁期所需的时间;(4)分别进行细胞爬片和滴片固定收样,并标染EdU(DNA复制起始位置)和FANCD2(DNA损伤修复蛋白)。观察各对子细胞中的DNA损伤情况,并进行统计分析。观察统计染色体的断裂频率,判断断裂位点与EdU染色位点的相对位置关系。 【材料】 人HBE上皮细胞;FANCD2抗体(美国Gibco公司);APH;EdU;1640培养基(美国Gibco公司)。 【可行性】 已完成的前期实验:(1)明确了DNA复制起始位点通过抑制DNA聚合酶更容易导致染色体损伤;(2)这些DNA起始位点的损伤在有丝分裂后的两个子代细胞中呈现明显的非随机、非对称分布,表现为一个子代细胞损伤明显增多,而另一个子细胞基本没有或很少出现损伤。这些前期实验结果与预期结果相符。 【创新性】 (1)首次在体细胞水平探讨DNA复制起始位点的复制压力所诱导的DNA损伤在子代细胞中的分布信息;(2)探讨DNA复制起始位点在复制压力下与染色体断裂的关系;(3)首次从DNA损伤的角度阐释染色体分布的可能调控机制。     

小鼠精子与子宫内膜细胞融合及嵌合细胞生物特性研究

【立论依据】 宫颈癌和子宫内膜癌是我国妇女常见的恶性肿瘤。虽然大量的研究数据表明人乳头状瘤病毒(HPV)感染与宫颈癌的发生密切相关,但仍有许多妇女在未感染HPV情况下发生宫颈癌,因此宫颈癌的发病机制迄今为止尚未完全阐明。一些研究发现在妇女体内存在含有Y染色体的细胞,这提示精子与女性体细胞相互作用和融合的可能,而与精子融合的体细胞是否会产生恶性特征目前尚不清楚。如果精子与宫颈或子宫内膜的直接接触可导致细胞的融合,而融合细胞可表现恶性特征则提示无保护的性生活具有导致宫颈或子宫内膜癌患病的风险。 【设计思路】 在体外证实小鼠精子对子宫内膜细胞的穿透性,并观察融合后嵌合细胞的生物特性及转归,通过标志性蛋白分析完成对嵌合细胞的干细胞特性或恶性特征的初步鉴定。 【实验内容】 附睾尾和精囊部获得成年雄鼠的精子,精子获能后用特异荧光分子标记精子细胞膜或顶体结构,然后进行精子与原代培养的雌鼠子宫内膜细胞的共培养,根据荧光染料在细胞膜的弥散特征证实精子与子宫内膜细胞的融合。采用流式细胞仪分选嵌合细胞并进行体外的长期培养。取对数生长期的嵌合细胞进行其生物学特性鉴定,包括:增殖能力、干性特征及恶性特征的鉴定。 【材料】 实验动物:SPF级 KM小鼠;主要试剂:DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、荧光染料等;实验仪器:二氧化碳培养箱、超净工作台、恒温水浴箱、倒置显微镜、激光共聚焦荧光显微镜、流式细胞仪等。 【可行性】 精子-体细胞融合已有部分体外研究报道,本研究借鉴了这些研究的实验方法并对具体的实验方案进行了优化。参与本研究的成员前期研究已经证实精子与宫颈癌Hela细胞的融合现象并已掌握了进行相关实验的生物学技术。 【创新性】 小鼠精子对子宫内膜细胞穿透性的体外研究目前尚未见相关报道,本研究旨在建立一种新型的精子-子宫内膜细胞融合模型,并将对这一模型的生物特征进行初步的研究。     

魔芋提取物对大鼠胃溃疡的治疗作用及其机制研究

【立题依据】 魔芋的主要成分为魔芋葡甘聚糖,且吸水后具有凝胶性质。国内外有研究表明魔芋葡甘聚糖具有促进消化道黏液分泌,抗炎,抗氧化,促进细胞增生,抗癌等作用,据此提出本研究假设:魔芋提取物通过其抗炎,促增生,促黏液分泌及抗凋亡作用可以在胃溃疡的损伤修复和治疗过程中发挥较好的作用,且其机制可能与EGF-EGFR信号通路有关。 【设计思路】 采用大鼠胃溃疡模型,比较不同剂量的魔芋粉治疗组、EGFR阻断剂AG1478联合不同剂量魔芋治疗组和对照组之间的胃溃疡损伤与细胞增生修复的程度差异,以此证实魔芋提取物对于胃溃疡具有治疗作用,且初步明确其作用机制。 【实验内容】 (1)模型建立:采用无水乙醇灌胃诱发急性胃溃疡大鼠模型。(2)给药处理:实验设正常对照组,胃溃疡模型组,自然恢复组,低、中、高浓度魔芋粉治疗组,AG1478对照组,低、中、高浓度魔芋粉联合AG1478治疗组。(3)取材检测:给药5 d,断食不断水1 d后处死大鼠,采血,分离血清;取最大溃疡边缘胃组织,分别进行相关蛋白检测和制备石蜡切片备用。(4)实验观察:形态学观察胃黏膜损伤指数(UI),胃黏液变化,组织病理改变;ELISA法检测血清TNF-α、IL-8含量;免疫组织化学法染色进行PCNA表达检测;蛋白质印迹检测EGF、EGFR、BCL-2蛋白、Bax蛋白、K-ras蛋白表达情况。 【材料】 SD大鼠,魔芋粉,阿尔新蓝染液,AG1478,及TNF-α、IL-8、EGF、EGFR、BCL-2、Bax、K-ras等相关检测试剂盒。 【可行性】 (1)学校具备完善的配套仪器设备是本实验研究顺利开展的有力保障。(2)实验所用药品及试剂盒均可直接购得。(3)通过前期实验准备,本团队已掌握研究所需的实验技术。(4)前期预实验结果表明,魔芋提取物治疗后,胃黏液量及中性胃黏膜比例增加,炎症因子减少,细胞增殖增加,这与本研究假设相符合,提示本实验有较好的研究前景。 【创新性】 目前国内外对魔芋的药用研究较少,本研究则根据魔芋抗炎,促增生,促黏液分泌及抗凋亡等功效,首次将其应用于胃溃疡治疗并探讨其作用机制,具有较强的创新性。     

LDL诱导RAW264.7细胞前后与神经节苷脂结合的蛋白质向脂质筏的转位

【立论依据】 氧化修饰的低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein, Ox-LDL)在促进动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)的发生和发展中起着关键性的作用。广泛存在于食品中的反式脂肪酸,能促进LDL的氧化修饰最终导致AS,有实验提示,反式脂肪酸是通过细胞膜上的脂质筏引起后续导致AS的各种反应,因此抗氧化治疗的维生素E等药物不能有效地阻止AS的发生。目前阻止体内LDL被氧化成为治疗AS的焦点,于是探究氧化LDL的分子机制变得至关重要。神经节苷脂(ganglioside,GM1)作为脂质筏的标志分子,已有研究显示其与LDL的氧化及分布密切相关,而其与LDL氧化的识别机制以及氧化环境的建立尚有待研究。 【设计思路】 本项目通过分析LDL诱导RAW264.7细胞前后,与神经节苷脂GM1特异结合的蛋白质向脂质筏的转位,从而找出介导LDL在微环境中进行氧化修饰的相关蛋白质因子。 【实验内容】 (1)细胞诱导和脂质筏分离:实验组,巨噬细胞RAW264.7与LDL共培养15 min;对照组,无LDL刺激;密度梯度离心分离脂质筏,非标记定量蛋白质组学鉴定产生的氧化应激相关蛋白。(2)细胞蛋白—GM1共沉淀:①收集巨噬细胞RAW264.7蛋白;②脂质体制备:实验组,制备原料加有GM1;对照组:原料不含GM1;③蛋白质-GM1结合:将收集的蛋白和制备的脂质体孵育结合,收集产物;④通过SDS-PAGE,质谱分析等找出与GM1特异结合的蛋白质分子。(3)蛋白质印迹法验证分析:分析步骤1和步骤2得到的共有蛋白,分别与LDL刺激细胞后分离的脂质筏成分以及与GM1特异结合的蛋白质进行蛋白质印迹法验证。 【材料】 RAW264.7细胞(武汉大学基础医学院);LDL( Pro Spec-Tany公司 );GM1(Sigma公司)。 【可行性】 预实验初步证实了LDL的氧化与脂质筏的形成有关;而且细胞膜“脂质筏”结构的主要组成成分糖鞘脂之一GM1参与了LDL的氧化,激光共聚焦显示GM1与LDL在RAW264.7细胞上的分布密切相关。 【创新性】 该项目首次证实了LDL与氧化微环境-脂质筏的形成有关,并寻找介导氧化的相关分子,从而进一步确认LDL氧化的具体机制。