PEDF抑制乳腺癌转移机制:通过p-ERK和p-AKT途径介导减少纤连蛋白表达

【目的】 色素上皮细胞衍生因子(PEDF)是一种多功能分泌性糖蛋白,具有神经营养、抑制新生血管和抗肿瘤的作用。PEDF通过降低微血管密度从而抑制肿瘤的作用已有研究,但其在乳腺癌转移中的确切作用和机制尚不明了。 【方法】 体内实验中,我们使用稳定表达PEDF的MDA-MB-231乳腺癌细胞原位肿瘤模型评估裸鼠乳腺癌的肝转移和肺转移。体外实验中,在MDA-MB-231细胞和SKBR3细胞过表达PEDF,用Boyden小室检测其的侵袭和转移能力。此外,PEDF对乳腺癌细胞EMT相关的Maker、纤连蛋白(fibronectin)及p-AKT、p-ERK分别用qRT-PCR、蛋白质印迹法和荧光免疫细胞化学法测定。肿瘤血管新生密度用MVD分析。 【结果】 实验发现,体外实验和在体实验中,PEDF均明显抑制了乳腺癌的转移。PEDF抑制肿瘤转移是通过抑制fibronectin表达,而非逆转EMT途径,而增加fibronectin可抵消PEDF的抑制乳腺癌的作用。此外,PEDF抑制fibronectin蛋白的表达是通过层黏连蛋白受体(laminin receptor)及后续的p-ERK 和p-AKT信号通路起作用的。 【结论】 实验结果证实了PEDF在乳腺癌生长和转移中发挥重要作用,并且发现,PEDF是通过层黏连蛋白受体介导和抑制fibronectin表达得以实现的。这为今后的乳腺癌治疗提供了新的思路。     

JAM-A表达与肺腺癌侵袭转移的关系及机制

【立论依据】 JAM-A是上皮细胞紧密连接结构的重要成分,在紧密连接装配、白细胞迁移、血小板活化和血管生成等细胞过程中发挥重要作用,参与调节炎症反应,并与细胞极性和渗透性的调节有关。目前发现JAM-A参与肿瘤的进展过程,其过量表达可能与患者的不良预后有关。但JAM-A在肿瘤进展中的功能尚存争议,JAM-A在肺腺癌中侵袭和转移中作用及机制尚未阐明。 【设计思路】 本实验在组织、细胞和动物三个层面探究肺癌中JAM-A蛋白在肺腺癌侵袭、转移和预后中的作用,证实JAM-A过表达促进肺腺癌进展。 【实验内容】 (1)组织实验:量子点免疫荧光检测200例肺腺癌组织JAM-A表达,观察JAM-A表达情况与临床病理因素及预后的关系。(2)细胞实验:培养人肺腺癌细胞A549和人正常肺上皮细胞BEAS-2B,①用siRNA分别转染细胞系使JAM-A基因沉默;②质粒转染细胞系建立JAM-A基因高表达的模型;③对两个系列的肺腺癌细胞和正常肺上皮细胞均用共聚焦显微镜、蛋白质印迹法和直接测定TER观察细胞紧密连接结构变化,Transwell小室方法检测细胞侵袭和迁移能力,MTT法检测细胞增殖能力。(3)动物实验:建立JAM-A(-)裸鼠和正常同种裸鼠构建肺腺癌荷瘤模型,检测肿瘤细胞JAM-A的表达情况并比较两组肿瘤的生物学特征。 【材料】 肺腺癌组织,肺腺癌细胞系,JAM-A(-)裸鼠,JAM-A抗体,质粒转染试剂盒,量子点试剂盒等。 【可行性】 前期工作已明确JAM-A在肺腺癌中表达与一些临床病理参数相关。指导教师课题组一直从事肿瘤侵袭转移机制研究并取得一定成绩,本组成员有较扎实的基础理论知识以及较熟练的实验操作技能。 【创新性】 (1)探讨肺腺癌组织中JAM-A表达与临床病理参数及预后的关系。(2)证实JAM-A过表达与肺腺癌的侵袭转移有关,并探究其机制。     

CD70在肝细胞癌转移侵袭中作用的研究

【立论依据及设计思路】 CD70属于肿瘤坏死因子超家族成员,为II型跨膜蛋白,与淋巴细胞上CD27结合后发挥作用。其在包括肾癌在内的多种肿瘤中表达异常,与免疫逃离有关。但CD70在肝细胞癌中的表达及其作用目前尚不清楚,本课题组在前期实验中意外地获得了具有很强迁移侵袭能力的肝癌细胞,而在这种细胞中CD70表达显著下降,随后我们又分析了40例巴塞罗那(BCLC)不同分级肝癌患者肿瘤组织和癌旁组织中CD70的表达,发现肿瘤出现转移后,CD70的表达明显下调,说明肝癌发生转移时CD70的表达确实出现改变。因此本实验旨在研究CD70表达变化与肝癌细胞转移侵袭间的关系,为肝癌病程提供新的潜在的转移标志物. 【实验内容】 (1)选择HepG2、Huh7、Hep3B和BEL-7402不同肝癌细胞系,利用流式细胞分选技术,分选CD70阳性和CD70阴性的细胞进行培养。(2)运用相差显微镜、扫描电镜及透射电镜观察CD70表达情况不同的细胞形态;应用MTT的方法检测不同细胞的细胞活力;利用transwell实验检测不同的细胞迁移和侵袭能力;最后根据实验结果,查询与迁移有关的蛋白质并利用蛋白质印迹的方法进行检测。(3)分别采用裸鼠尾静脉注射观察肺部转移瘤和脾脏注射观察肝转移瘤的方法,评价CD70表达变化与肿瘤转移及注射后裸鼠生存率的关系;通过皮下注射检测不同细胞的成瘤性并保留照片和组织,进行免疫组化以及蛋白检测。(4)选择新鲜人肝癌组织,用流式细胞技术对这些组织进行CD70表达的检测并分选,再将分选好的新鲜人肝癌细胞异体移植到裸鼠体内以检测其细胞特性是否与体外培养的细胞一致。 【材料】 HepG2、Huh7、Hep3B、及BEL-7402细胞系,流式分选仪,CD70的流式抗体BD Pharmingen 555834,BD Pharmingen 555835,裸鼠,新鲜人肝癌组织 【可行性】 前期工作已证实CD70在肝癌细胞转移后表达下调,提示CD70可能参与肝癌的转移;能熟练操作课题中所需的方法;所属实验室为“肝脏保护与再生调节北京市重点实验室”,与北京佑安医院具有合作关系,能获得新鲜人肝癌组织。 【创新性】 首次发现CD70在肝癌转移过程中表达下调,同时本课题首次提出CD70表达下调可能促进肝癌转移。     

探究DLC1与RhoA-ROCK通路对乳腺癌淋巴道转移的影响

【立项依据】 转移是恶性肿瘤的基本特征,且癌细胞转移与细胞运动密切相关,而RhoA-ROCK通路可作用于肌球蛋白,参与细胞骨架重组,影响细胞运动。那么RhoA-ROCK通路与癌细胞转移是否有一定相关性呢?查阅相关资料得知,RhoA-ROCK通路确实能影响癌细胞转移,并可受DLC1调控抑制肝癌、胃癌、前列腺癌等恶性肿瘤的生长,另有文献报道,用real-time PCR方法分析DLC1的mRNA表达量在乳腺癌非转移细胞系中比高转移细胞系中多。由此我们猜想DLC1与RhoA-ROCK通路对乳腺癌转移可能产生一定影响。于是我们拟选择DLC1、RhoA作为测定指标,探究DLC1与RhoA-ROCK通路对乳腺癌淋巴道转移的影响。 【实验内容】 分别选取已发生淋巴结转移和未发生转移的乳腺癌病变组织标本各25例,应用免疫组织化学法和蛋白质印迹法检测DLC1、RhoA在两组标本中的表达,对实验结果进行分析。 【材料】 已发生淋巴结转移和未发生转移的乳腺癌病变组织标本,DLC1抗体,RhoA抗体,相关试剂盒。 【可行性】 (1)应用免疫组织化学法预实验结果显示,发生转移与未发生转移的乳腺癌病变组织比较:DLC1表达较少,RhoA表达较多,二者间差异有统计学意义,用spearman等级相关分析显示DLC1与RhoA间存在相关性,由此提示乳腺癌淋巴道转移与DLC1、RhoA-ROCK通路可能存在一定联系。(2)已有文献报道从理论上支持我们通过检测两组标本中DLC1、RhoA的表达来探究其与乳腺癌淋巴道转移的关系。 【创新性】 (1)学习《病理生理学》,获知RhoA-ROCK通路可影响细胞运动,而学习《病理学》,我们知道癌细胞转移是恶性肿瘤的基本特征,本课题将病理生理学与病理学知识相联系,由RhoA-ROCK通路影响细胞运动联想到乳腺癌淋巴道转移。(2)大量文献报道DLC1能通过抑制RhoA-ROCK通路发挥抑癌作用,但其是否会影响乳腺癌淋巴道转移的文献却未见发表。(3)经实验探究,初步认识到DLC1能通过抑制RhoA-ROCK通路而抑制乳腺癌淋巴道转移,若进一步探究DLC1抑制RhoA-ROCK通路的机制,将为临床上抑制乳腺癌淋巴道转移提供新的治疗靶点和理论依据。     

SRPX1基因在卵巢癌组织的表达和作用

【立论依据】 SRPX1(别名drs/EXT1),在人类的多种肿瘤细胞系(包括结肠、膀胱、睾丸、肺等)以及癌组织中drs mRNA的表达量显著降低,暗示了drs基因在抑制肿瘤形成过程中所发挥的作用。由drs基因介导的细胞凋亡和自我吞噬反应可以作为其肿瘤抑制作用的分子基础。 【设计思路】 以正常卵巢组织为对照进行临床病例分析:设5个实验组:正常卵巢组织、卵巢良性黏液性肿瘤组、卵巢交界性黏液性肿瘤组、卵巢恶性黏液性肿瘤组(腺癌,原发灶)、卵巢恶性黏液性肿瘤组(腺癌,转移灶)。应用免疫组化的方法,检测SRPX1表达状况,探索SRPX1基因与肿瘤发生及患者生存率和复发率等临床参数的关系;采用代表性的HO-8910(低转移性的人卵巢癌细胞株)、HO-8910pm(高转移性的人卵巢癌细胞株)为研究对象,用免疫组化和蛋白质印迹法检测SRPX1蛋白表达情况;采用基因敲除技术,特异性的敲除正常卵巢组织细胞的SRPX1基因,用免疫组化和蛋白质印迹法检测SRPX1蛋白表达情况,并观察正常卵巢组织细胞的生长情况。 【实验内容】 为了阐述SRPX1基因在上皮型卵巢癌的发生、转移中所发挥的作用,本研究通过临床病例分析,细胞培养和特异性的敲除正常卵巢组织细胞的SRPX1基因,检测和分析SRPX1基因在卵巢癌组织的表达和作用。 【材料】 临床病理组织,细胞培养基,试剂,抗体,操作器械,实验仪器。 【可行性】 和正常卵巢上皮组织对比,SRPX1蛋白在人卵巢癌细胞株中表达明显降低,与恶性程度相关,在高转移的细胞系表达减低。 【创新性】 本项目所要阐明的实验现象和机制,即对SRPX1基因在卵巢癌组织的表达和作用分析后,为开发新的肿瘤治疗药物提供理论依据。本课题基于我们最新的发现基础上,目前国际上还没有这方面的研究报告,据有很好的创新性和前沿性。     

丝氨酸缺乏和p53依赖的代谢重构对乳腺癌细胞的影响

【立论依据】 丝氨酸对肿瘤细胞增殖具有重要作用。丝氨酸缺乏可导致肿瘤细胞氧化应激,对其增殖产生抑制。肿瘤抑制基因p53在抗氧化代谢中发挥不可或缺的作用,因此p53可帮助肿瘤细胞耐受丝氨酸缺乏。这与p53的抑癌功能是一对矛盾,利用此矛盾可为肿瘤治疗提供新的思路。 【设计思路】 选取p53突变或缺失的三阴性乳腺癌细胞系,给予丝氨酸缺失的培养环境,观察其增殖情况、相关基因和蛋白表达情况。以p53阳性的乳腺癌细胞和正常培养基作对照 【实验内容】 MDA-MB-157(P53 null)或HCC1937(P53 mutant)分别用不含丝氨酸的培养基(-SG)、加入丝氨酸的-SG、加入丙酮酸和GSH的-SG,进行72 h培养,每24 h用流式细胞仪检测细胞数量、细胞周期和细胞内ROS水平,酶标仪检测抗氧化能力、GSH和GSSG水平,Real-time PCR检测P53、PHGDH的mRNA转录,蛋白质印迹检测p53、PHGDH的蛋白表达。MCF-7(P53 wildtype)作为P53的阳性对照。 【材料】 MCF-7、MDA-MB-157或HCC1937、MEM培养液(HyClone SH30024)、丝氨酸、丙酮酸、GSH,相关的试剂盒和试剂。 【可行性】 已进行预实验,已实践过实验内容中提及的操作,已观察到MCF-7在丝氨酸缺乏时增殖先受抑制后恢复、细胞内ROS水平上升、PHGDH表达上升 【创新性】 p53对肿瘤细胞代谢的影响已成为研究热点。多数肿瘤中近一半存在p53基因的突变,丝氨酸在肿瘤增殖中的重要地位,使得丝氨酸、p53以及相关的信号调节通路和酶可能成为肿瘤治疗的新靶点。     

探究DATS通过调节ERK/NF-κB凋亡通路和诱导自噬而抑制宫颈癌的作用机制

【立题依据】 宫颈癌在发展中国家女性癌症中的死亡率居第二位,主要化疗药物顺铂存在耐药问题,使化疗遇到瓶颈,故需寻找新的有效化疗方案改善现状。研究发现大蒜素(allicin)及其代谢产物二烯丙基三硫化物(DATS)均对肿瘤生长有抑制作用,但DATS在宫颈癌中的作用未见报道。研究表明 DATS在诱导乳腺癌细胞凋亡中抑制了ERK表达,而ERK下调可减少NF-κB活化,且ERK和NF-κB在宫颈癌发生发展中起重要作用,故推测DATS可能通过ERK/NF-κB通路诱导宫颈癌细胞凋亡。Allicin在肝癌中可诱导自噬抗癌,但DATS能否通过自噬抗癌尚无报道。综上,课题探究DATS是否通过调节ERK及NF-κB凋亡通路和自噬通路抗宫颈癌。 【设计思路】 通过体外实验明确DATS对宫颈癌细胞的抑制作用并探究其是否调节ERK及NF-κB凋亡通路和自噬通路抗宫颈癌;体内实验验证DATS调节ERK及NF-κB凋亡通路和自噬通路抗宫颈癌。 【实验内容】 明确DATS对宫颈癌细胞的抑制作用,筛出敏感细胞系和最佳作用浓度及时间点;上下调ERK、NF-κB的表达,探究DATS是否通过调节ERK及NF-κB通路促进宫颈癌细胞凋亡;检测自噬小体形成率及自噬相关蛋白BAD,Beclin1的表达,并通过上下调其表达水平,探究DATS是否诱导宫颈癌细胞自噬;构建裸鼠移植瘤模型,验证DATS通过ERK及NF-κB凋亡通路和自噬通路抗宫颈癌。 【材料】 HeLa、SiHa、CaSki细胞系,DATS,ERK、NF-κB、Bcl2及 GFP-LC3表达质粒,ROS、NF-κB及BAD抑制剂,3-MA,裸鼠。 【可行性】 理论可行:文献报道Allicin可抗癌,其代谢产物DATS也能抑制肿瘤生长。目前DATS在宫颈癌中的作用虽无报道,但发现DATS在乳腺癌细胞中抑制ERK表达,而ERK表达与NF-κB活化正相关,且ERK/NF-κB在宫颈癌中起重要作用。文献报道Allicin可诱导肝癌细胞自噬,但其代谢产物DATS是否通过自噬抗癌尚无报道。技术可行:课题所用实验技术,在本科室有扎实的技术支持,研究者已掌握大部分技术。 【创新性】 DATS对宫颈癌的作用及诱导ERK/NF-κB凋亡通路和自噬通路无报道,具有理论创新性;完善DATS的抑癌机制,为研发新抗癌药物提供理论基础,具有实践创新性。     

凋亡抑制蛋白ILP-2对乳腺癌细胞MCF-7氧化应激损伤的保护作用

【立论依据】 文献表明氧化应激会损伤体内核酸等生物大分子物质而促进肿瘤的发生发展;凋亡抑制蛋白ILP-2在生长中的乳腺癌有高表达,由此,我们猜想乳腺癌中高表达的ILP-2可能与氧化应激的损伤作用存在联系 【设计思路】 实验以乳腺癌细胞株MCF-7制备氧化应激的细胞模型,研究氧化应激状态下MCF-7内ILP-2的表达情况;RNAi ilp-2基因表达,分析ILP-2与氧化应激损伤之间的关系 【实验内容】 利用H2O2对乳腺癌细胞株MCF-7进行氧化应激造模,流式细胞术(flow cytometry, FCM)检测细胞内活性氧簇(reactive oxygen species,ROS),分光光度法检测丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)水平;通过瞬时转染敲低MCF-7 ilp-2表达,利用RT-PCR和蛋白质印迹法检测基因和蛋白质表达情况;干扰细胞ilp-2表达并同时进行氧化应激处理,通过MTT、Scratch、FCM等方法检测细胞的存活状态 【材料】 乳腺癌细胞株MCF-7,H2O2,转染试剂,RNeasy Mini Kit,QuantiFast Probe Assay,RIPA 裂解液,一抗,二抗,ROS试剂盒,GSH试剂盒,MDA试剂盒,MTT试剂盒等。 【可行性】 该研究内容所需技术在生物分子研究领域已经非常成熟,所需设备完善,可操作性强 【创新性】 首次研究ILP-2促癌细胞生长作用与氧化应激损伤之间的关系,为进一步阐明ILP-2的作用机制奠定基础。     

辛辣物质对肺癌细胞增殖侵袭的影响研究

【立论依据】 辛辣食物是不少人的偏爱,对于食欲不振及消化不良,辛辣食物有健胃、助消化的功能,风寒感冒时,辛辣物质可增强辛温解表药的作用。目前英国学者研究发现辣椒素能够杀死培养的癌细胞,但是否对人体癌细胞有杀伤力还无试验证明,而中医对于肿瘤病人的饮食要求忌辛辣。癌症的发病就中医角度来解释,不外正虚与邪实,正虚可为气、血、阴、阳失调,邪实则有外感与内伤之分,外感六淫(风、寒、暑、湿、燥、火)侵袭人体与内伤(痰瘀、湿毒、气滞、郁热),在治疗癌症与饮食调理方面宜选用健脾和胃、气血双补、凉血解毒、滋补肝肾之品,不宜食用刺激性食物和燥热生痰的食物,如辣椒、葱姜蒜等。所以,对于肿瘤来说,辛辣物质是好、是坏,仍是一个问题。 【设计思路】 本课题拟通过不同剂量辣椒素、大蒜素、姜黄素处理肺癌细胞,比较不同组间肺癌细胞的增殖和侵袭能力;裸鼠皮下注射肺癌细胞使局部成瘤,同时分组给予不同剂量的辣椒素,30 d后测量肿瘤形成的大小,探讨不同剂量的辛辣物质对肺癌的影响。 【实验内容】 (1)A549人肺癌细胞系应用不同辛辣物质处理,分别分为辣椒素、大蒜素、姜黄素高、中、低和空白对照组,共12组;(2)各组处理后24、48、72、96 h分别MTT测细胞增殖能力,划痕实验测其侵袭能力,提取蛋白,蛋白质印迹检测增殖相关蛋白PCNA、Ki67和侵袭相关蛋白MMP2、MMP9的表达;(3)裸鼠20只1×10⁶/mL A549细胞同一时间皮下注射,分为4组,对照组和大蒜素高中低剂量组,饲养30 d后比较每组肿瘤形成的大小。 【材料】 实验仪器:细胞培养箱、酶标仪、电泳仪、光学显微镜等;试剂:辣椒素、大蒜素、姜黄素、DMEM培养液、胎牛血清、MTT试剂盒等。 【可行性】 实验所需动物、药品、试剂、耗材均已购得;本课题所涉及方法和技术课题组同学均已掌握并可独立完成;预实验已进行20 d,实验中观察到不同浓度大蒜素对肺癌细胞的增殖能力影响不同,高剂量组明显抑制肺癌细胞的增殖,而低剂量组却促进肺癌细胞增殖。 【创新性】 已有研究证实辛辣物质对培养的癌细胞有杀伤作用,但小剂量和大剂量的辛辣物质对癌细胞增殖和侵袭的影响是否不同未见报道,本研究首次探讨不同剂量的辣椒素、大蒜素、姜黄素对肺癌细胞增殖和侵袭的影响,明确辛辣物质对肿瘤是好还是坏,研究设计具有一定的创新性。     

人脐带间充质干细胞对肝癌细胞增殖性及凋亡的影响

目的 探讨人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchyma cell, MSC)对肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)癌细胞增殖和凋亡的影响,为HCC的治疗提供新的思路。 方法 取50%覆盖率的MSC培养皿,换上新鲜的DMEM/F-12培养基,待其培养至100%的覆盖率后收集培养基备用,即为MSC条件培养基。用新鲜DMEM/F-12培养基加上等量的MSC条件培养基的混合培养基培养HepG₂人类肝癌细胞株24、48和72h,使用MTT法测定HepG₂细胞的增殖活性、通过Hoechest33342和PI双染色后在荧光倒置显微镜下观察计数以测定HepG₂细胞的凋亡、用Transwell侵袭实验和黏附实验测定HepG₂细胞侵袭能力以及通过Western blot法检测凋亡相关信号通路蛋白的表达。 结果 混合培养基培养HepG₂细胞24h后,对其生长和凋亡及侵袭黏附能力没有显著影响(P>0.05)。但是培养延长到48h和72h后,HepG₂细胞的活性、增殖能力、侵袭能力和黏附能力都受到显著的抑制,这些变化伴随着细胞分裂相关因子Ki-67、PCNA和组蛋白H3磷酸化水平下调,以及细胞凋亡执行者caspase-3的激活和抗凋亡蛋白Bcl-2的抑制。 结论 体外间接共培养实验表明,人脐带间充质干细胞具有抑制肝脏肿瘤细胞增殖及促进其凋亡的作用。     

泰山银杏外种皮多糖对食管癌细胞增殖和凋亡的影响

【目的】 探讨泰山银杏外种皮多糖(Ginkgo biloba exocarp polysaccharides,GBEP)对体外培养的食管癌细胞增殖和凋亡的影响及其作用机制。 【方法】 通过沸水浸提,有机溶剂沉淀,并通过sevage法除去蛋白,获得GBEP。利用MTT法检测不同浓度的GBEP对食管癌细胞EC-9706增殖的影响;流式细胞术检测细胞周期的分布;Annexin-V/PI双染分析凋亡率;蛋白质印迹法检测与细胞周期及细胞凋亡相关的蛋白表达变化。 【结果】 GBEP显著抑制EC-9706细胞的增殖,并呈时间、剂量依赖性。其半数抑制浓度(IC50)为138.9 μg/mL。细胞周期分析结果表明,GBEP处理后G1期细胞比例由52.25%增加至69.76%,蛋白质印迹结果显示细胞周期蛋白D1的表达呈浓度依赖性下降。说明GBEP诱导EC-9706细胞G1期阻滞。流式细胞术分析结果表明,GBEP诱导的EC-9706细胞凋亡随剂量和作用时间增加而增加。同时GBEP抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,增加促凋亡蛋白Bax的表达,促进caspase3的激活和PARP的剪切。 【结论】 泰山银杏外种皮多糖抑制食管癌细胞的增殖,诱导细胞G1期阻滞,并激活内源性细胞凋亡。     

Fucoidan干预小鼠肝癌淋巴道转移及其分子机制研究

【立论依据】 我国有辽阔的海域,海洋药物资源丰富,开发潜力巨大。随着陆地资源的日益枯竭,海洋药物开发研究已迫在眉睫。褐藻多糖硫酸酯(Fucoidan)是从Undaria pinnatifida孢子叶中提取富含L-岩藻糖和硫酸根的天然水溶性胞外杂聚糖,研究表明其具有抗凝血、抗肿瘤、降血脂等作用。恶性肿瘤患者的死亡主要是由于肿瘤的转移造成的,其中淋巴道转移是肿瘤转移的重要方式。HGF、C-Met及VEGF-C、VEGFR-3是转移通路中重要的细胞蛋白和膜表面受体蛋白,在转移中起着极其重要的作用。 【设计路思】 本实验以探究Fucoidan对小鼠肝癌淋巴道转移的影响为目的,检测了药物处理后肿瘤细胞转移相关蛋白VEGFR-3、C-Met及细胞外分泌因子VEGFC、HGF的变化,为临床肿瘤转移药物的开发应用提供前期基础研究依据。 【实验内容】 本研究以小鼠肝癌细胞系Hca-F为细胞模型,采用蛋白质印迹法、酶联免疫吸附剂测定法、聚合酶链式反应法、Transwell法等,检测药物对Hca-F细胞的转移、侵袭相关蛋白表达以及基因转录的影响。 【材料】 大连海域自然生长的裙带菜(Undaria pinnatifida)孢子叶、小鼠肝癌Hca-F细胞系、细胞和分子生物学实验所需试剂、抗体、Transwell小室等。 【可行性】 本课题组从裙带菜孢子叶中提取Fucoidan,对其进行纯化及理化性质分析,并对其抗肿瘤、免疫调节等活性进行研究,已完成对Hca-F细胞生长因子受体VEGFR-3和C-Met表达,以及生长因子VEGF-C和HGF的分泌进行检测。本实验设计合理,具有可行性。 【创新性】 目前对Fucoidan的研究主要集中于诱导肿瘤细胞凋亡,对其抗肿瘤侵袭转移的研究却鲜有报道。本实验以Hca-F细胞株为研究对象,探究Fucoidan对小鼠高淋巴道转移细胞Hca-F侵袭转移的影响,具有一定创新性。     

Nogo-A分子对Neuro2A细胞突起生长的作用研究

【立论依据】 少突胶质细胞来源的Nogo-A分子,作为中枢神经系统损伤后重要的轴突抑制因子备受关注。近年来发现Nogo-A在神经元中呈现高表达,但是对于神经元中Nogo-A的自主性功能尚在起步研究阶段。我们更加关注,Nogo-A在神经元发育中潜在的功能。 【实验内容】 选择丙戊酸钠(VPA)诱导的神经母细胞瘤Neuro2A作为细胞分化模型,首先,考察Nogo-A分子在Neuro2A细胞未分化组,不同时间分化组中的表达模式;其次,利用RNA干扰技术下调Neuro2A细胞中内源性Nogo-A,考察细胞分化比例以及分化细胞中突起长度的变化情况。 【材料】 Neuro2A细胞系,VPA,DMEM培养基,胎牛血清,培养皿,Nogo-A抗体,免疫印迹相关耗材,shRNAs。 【可行性】 前期文献调研扎实。西安医学院科研平台拥有细胞培养室,可满足本实验中的细胞系培养。上述抗体已购置,针对Nogo-A的shRNAs已合成好。指导教师长期从事神经元分化与保护方面的研究,可提供了强有力的技术保障和实验指导。 【创新性】 少突胶质细胞表面的Nogo-A通过与神经元表面的NgR结合,激活RhoA-ROCK,进而抑制突起生长。近来大量的数据显示,神经元中的Nogo-A表达丰富,可能参与调控神经元的发生、分化。基于文献报道,本研究拟利用VPA诱导的Neuro2A细胞分化模型,明确Nogo-A在Neuro2A细胞分化过程中的表达变化,进一步利用RNA干扰策略下调内源性Nogo-A表达,通过细胞分化和突起生长的指标分析Nogo-A对Neuro2A细胞分化的影响,为研究神经元中Nogo-A的自主性功能提供依据。     

SHP2/Hook1通过上皮间质转化调控肺肿瘤转移的机制研究

【立论依据】 肿瘤转移是肿瘤患者死亡的最主要原因,而上皮间质转化在肿瘤转移的起始过程中发挥重要作用。原癌基因ptpn11表达的蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2在多种肿瘤中存在突变或高表达现象,提示SHP2参与肿瘤的发生与进展。本项目的前期研究发现SHP2促进上皮间质转化过程,且需要其酶活性的参与;新发现的SHP2相互作用蛋白Hook1在上皮间质转化中具有相反的抑制作用,而Hook1与SHP2的催化结构域结合。 【设计思路】 本项目对Hook1是SHP2的内源酶抑制剂这一假设进行研究,并探究SHP2与Hook1形成的蛋白复合物通过调节上皮间质转化过程影响肺肿瘤转移的可能性。 【实验内容】 (1)原核表达与纯化带有His标签的SHP2和Hook1蛋白,通过测定SHP2蛋白磷酸酶的活性探讨Hook1能否抑制SHP2的酶活性;(2)定量PCR、蛋白质印迹方法比较侵袭能力不同的肺上皮细胞中SHP2和Hook1在mRNA与蛋白水平上的差异;(3)miRNA干扰或过表达方法改变两种蛋白的表达水平,观察其对肿瘤细胞的迁移及侵袭能力的影响;(4)构建破坏SHP2与Hook1相互作用的截短或点突变质粒,探究Hook1对上皮间质转化以及细胞侵袭的影响是否需要SHP2的参与;(5)体内实验验证改变SHP2或Hook1的表达是否影响肿瘤细胞在小鼠体内的成瘤能力。 【材料】 原核表达质粒PET21a,His亲和纯化树脂,非小细胞性肺癌细胞株A549,SHP2siRNA,pCDNA3.1-SHP2及突变体表达载体,Hook1siRNA,pCDNA3.1-Hook1及突变体表达载体,抗SHP2、Hook1抗体,4组(每组9只,共36只)NOD/SCID小鼠。 【可行性】 前期研究发现SHP2的蛋白酪氨酸磷酸酶活性能够促进肺上皮细胞的上皮间质转化过程;SHP2的催化结构域相互作用蛋白Hook1则抑制上皮间质转化过程。在此基础上我们推测SHP2和Hook1通过上皮间质转化从而对肿瘤的转移产生影响,并且Hook1的作用需要SHP2的参与。故本研究具有较强的可行性。 【创新性】 新发现的与SHP2催化结构域相互作用的Hook1有可能成为首个SHP2的内源抑制蛋白。明确SHP2/Hook1复合物在上皮间质转化以及肿瘤转移中的作用,有助于认识SHP2与肿瘤转移的关系,所揭示的分子机制有望为肿瘤转移的早期诊断及临床治疗提供新的潜在靶点。     

17-AAG抑制piRNA-PIWI通路对神经母细胞瘤“干性”影响的研究

【理论依据】 piRNA是细胞内三大非编码RNA(nocodingRNA)之一,参与到干细胞干细胞“干性”的维持之中,同时与PIWI蛋白组成piRNA-PIWI通路,在大量不同类型的肿瘤细胞中高表达。类比miRNA领域取得的研究成果,例如组织工程学应用、抗肿瘤靶点等,探讨piRNA-PIWI通路是否具备相同的应用与靶点价值是本实验设计的核心所在。 【设计思路】 热休克蛋白90(hot shock protein 90)参与了piRNA负载到PIWI蛋白的关键过程,通过使用其抑制剂17-AAG能够间接的抑制piRNA-PIWI通路,同时以神经母细胞瘤的肿瘤干细胞为实验对象,探讨抑制piRNA-PIWI通路对于肿瘤干细胞“干性”的影响 【实验内容】 以小儿最常见的颅外实体瘤神经母细胞为实验对象:(1)神经母细胞瘤干细胞的富集:使用依托泊苷处理肿瘤细胞,进行肿瘤干细胞的富集。(2)实验对象的分组:①维甲酸组作为对照组;②17-AAG组;③RNAi-PIWIL2组。(3)实验检测指标:①PIWIL2 mRNA的检测;②细胞干性的评价:检测相关基因OCT4、SOX2、C-MYC与N-MYC基因的表达,甲基化相关酶(DNMT1、DNMT3)的表达,同时进行形态学观察、细胞凋亡以及细胞周期的监测。③piRNA-PIW通路功能的检测:检测代表性的转座子Line-1、IAP的表达,以及PIWIL2蛋白的表达。 【材料】 神经母细胞瘤细胞系IMR-32、SK-N-SH、SH-SY5Y;HSP90抑制剂17-AAG。 【可行性】 本实验室已在神经母细胞瘤的相关研究中取得研究成果,发表SCI论文,同时本实验的参与团队在校学习期间深入实验室研究过程之中,掌握了一定的实验技能。 【创新性】 探讨使用piRNA-PIWI通路的间接抑制剂17-AAG,从而研究抑制该通路对于神经母细胞瘤干细胞“干性”所造成的影响,为研究靶向抑制piRNA-PIWI通路作为抗肿瘤治疗新靶点奠定理论基础,同时亦为未来开发基于piRNA的组织工程学重编程细胞的新靶点进行前瞻性研究。     

人肝癌乳酸脱氢酶的细胞膜定位和酶学特性研究

【立论依据及设计思路】 已有研究表明在人肝癌组织中,间质细胞的线粒体会在癌细胞的驱动下会发生线粒体自噬,只进行糖酵解,且糖酵解相关酶的表达水平显著升高,尤其是间质细胞特异高表达LDHA(乳酸脱氢酶A),将糖酵解产物丙酮酸转化成乳酸,排出间质细胞。而排出的乳酸被邻近的肝癌细胞摄取,肝癌细胞特异表达LDHB,将乳酸转变成丙酮酸。肝癌细胞具有完整的氧化磷酸化过程,能利用间质细胞提供的乳酸,经三羧酸循环、糖异生和脂肪合成,为肿瘤细胞的增殖提供物质和能量。间质细胞的糖酵解和肿瘤细胞的氧化磷酸化之间代谢偶联,是维持肿瘤细胞快速增殖的重要机制。前期实验发现肝癌细胞表达膜型LDHB,而膜型LDHB的功能尚不清楚。本课题拟研究LDHA和LDHB在人肝癌间质细胞和肝癌细胞中的表达和定位和酶学特征,阐述LDH在肝癌组织能量代谢偶联过程中的生化机制,同时评价LDH作为人肝癌能量代谢干预靶点的可能性。 【实验内容】 第一部分:人体肝癌组织标本中肝癌细胞和间质细胞线粒体功能和反向Warburg效应的检测,利用免疫组化的方法检测线粒体标志物和线粒体自噬标志物及LDHA和LDHB的表达分布;第二部分:建立肝癌细胞SMMC-7721和正常人成纤维细胞的共培养体系;第三部分:检测LDH在肝癌细胞及肝癌相关成纤维细胞中的膜定位及表达水平;第四部分:对细胞膜上的LDH进行酶活性检测,明确其酶活性和代谢特征;第五部分:在细胞水平上研究LDH抗体,抗寄生虫药,单羧酸转运体抑制剂对能量代谢偶联的抑制作用;第六部分: 裸鼠模型的抗体和阿苯达唑的抗肿瘤实验。 【材料】 人肝癌SMMC-7721细胞株及成纤维细胞株,特异性LDH抗体,抗寄生虫药物(吡喹酮,阿苯达唑),免疫组化相关材料,qPCR相关材料,免疫印迹相关材料,MTT比色法相关材料。 【可行性】 本实验室已完成了人LDHA和LDHB的克隆表达和酶学特性研究,已实验证实人肝癌细胞SMMC-7721只表达LDHB, 且定位于细胞膜上。 【创新性】 提出肝癌组织中,间质细胞和实质细胞分别表达膜型LDHA和LDHB,不仅负责丙酮酸和乳酸之间的相互转化,而且可能是产物的转运体;抗寄生虫LDH的抗体和药物可以抑制人LDH的酶活性,抑制肿瘤的生长和转移。     

氯离子通道蛋白-3对宫颈癌细胞生长、转移的影响

目的 探讨氯离子通道蛋白-3（CIC-3）对宫颈癌细胞生长和转移的影响。方法 通过免疫组织化学、qRT-PCR和Western blotting检测60例宫颈鳞癌组织和相应癌旁组织中CIC-3的表达。使用靶向CIC-3的siRNA转染SiHa细胞,并通过CCK-8、流式细胞术、伤口愈合实验和Transwell实验考察CIC-3对细胞生长和转移的影响。使用Western blotting检测细胞中PI3K、p-AKT、Bcl-2和p21的表达。此外,通过将转染CIC-3 siRNA的SiHa细胞接种到BALB/c-nu/nu裸鼠背部复制体内肿瘤异种移植模型。结果 免疫组织化学染色结果显示,CIC-3蛋白主要表达于子宫颈鳞状上皮细胞胞质区。癌组织CIC-3的阳性染色评分、CIC-3 mRNA相对表达量、CIC-3/β-actin相对表达量较癌旁组织高（P <0.05）。SiHa细胞CIC-3 mRNA相对表达量、CIC-3/β-actin相对表达量较H8细胞高（P <0.05）。不同肿瘤直径、TNM分期和是否有淋巴结转移患者CIC-3高表达率比较,差异有统计学意义（P <0.05）。下调CIC-3能抑制SiHa细胞的增殖、迁移和侵袭,并促进细胞凋亡（P <0.05）。在接种si-CIC-3转染的细胞后,裸鼠的肿瘤体积变小（P <0.05）。下调CIC-3能抑制PI3K、p-AKT和Bcl-2的蛋白表达,但促进p21的表达。结论 CIC-3在宫颈鳞癌中高表达,下调CIC-3可抑制宫颈鳞癌的生长和转移。CIC-3对宫颈鳞癌细胞凋亡的调控作用部分通过PI3K-AKT信号通路介导。     

红甜菜提取物对HeLa细胞增殖和荷瘤鼠瘤体生长的影响

目的 研究红甜菜提取物对人宫颈癌HeLa细胞增殖和对荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用。方法 采用细胞计数法观察红甜菜提取物对HeLa细胞的抑制作用,在人宫颈癌荷瘤鼠模型上观察红甜菜提取物对肿瘤生长的抑制作用,并用病理切片观察瘤体细胞变化。结果 甜菜提取物对人宫颈癌HeLa细胞具有抑制作用,并具有剂量–时间依赖关系。荷瘤鼠动物实验表明,红甜菜提取物对裸鼠肿瘤生长也具有抑制作用,剂量为20 mg/d时抑瘤率为40%;摄入红甜菜提取物组的裸鼠瘤体细胞出现坏死。结论 红甜菜提取物对HeLa细胞的生长和对荷瘤裸鼠肿瘤生长具有抑制作用。     

巨噬细胞通过分泌抗菌肽LL-37/hCAP-18调控卵巢癌细胞的增殖

目的 研究巨噬细胞是否通过分泌抗菌肽LL-37/hCAP-18对卵巢癌细胞的生长增殖进行调控。方法 采用Millicell插入式细胞培养皿共培养人巨噬细胞和卵巢癌细胞株SKOV3;通过细胞计数法检测巨噬细胞对卵巢癌细胞增殖能力的影响;流式细胞术检测共培养上清中的相关细胞因子及LL-37的水平;实时定量反转录聚合酶链反应在mRNA水平检测巨噬细胞和SKOV3细胞中LL-37 mRNA的表达水平;应用LL-37中和抗体抑制LL-37的功能及活性,进而通过MMT细胞增殖实验探讨LL-37对巨噬细胞对卵巢癌细胞增殖的调控。结果 细胞计数法检测结果显示,巨噬细胞与卵巢癌细胞SKOV3共培养后,可促进其增殖;共培养的上清中,LL-37及IL-6水平明显升高;实时定量RT-PCR在mRNA水平共培养中的巨噬细胞其LL-37基因表达升高,且其表达水平随时间的延长而增加;应用LL-37的中和抗体,可明显抑制巨噬细胞对SKOV3细胞的增殖促进作用。结论 在与卵巢癌细胞共培养的环境中,巨噬细胞通过增强抗菌肽LL-37的表达和分泌水平促进卵巢癌细胞的增殖,LL-37在巨噬细胞促进卵巢癌的发展中扮演重要角色。     

ISL-1表达水平对胃癌细胞化疗耐药性的影响及机制探究

【立论依据】 化疗是一种重要的胃癌辅助治疗方法,但由于不同患者对化疗药物的耐药性差异极大,而影响其治疗效果。哪些因素会导致胃癌细胞呈现不同的耐药性目前尚未阐明。最新的研究表明,自噬可以帮助细胞对抗微环境中的化疗药物,导致耐药。胰岛因子1(Islet-1,ISL1),在正常成体胃组织中不表达,但我们发现ISL1在人胃癌组织中呈中等丰度的表达,且不同胃癌细胞系表达量有明显差异,并对胃癌经典化疗药物5-氟尿嘧啶(5-FU)的敏感性亦不同。胃癌细胞中ISL1表达量的差异是否与化疗耐药性相关,目前国内外尚未见报道。我们还发现,5-FU处理下,ISL1表达丰度高的胃癌细胞,其自噬发生标志LC3的剪切也明显增加,那么ISL1是否通过增强肿瘤自噬能力来介导胃癌细胞的化疗耐药性?故本课题试图阐明胃癌细胞中ISL1表达量的差异可导致肿瘤细胞产生不同的化疗耐药性,其分子机制与ISL1能够增强肿瘤自噬能力有关。 【设计思路】 (1)明确胃癌细胞中ISL1表达量的差异能否导致肿瘤细胞产生不同的化疗耐药性;(2)证实胃癌细胞中自噬与耐药性的关系;(3)探究ISL1与自噬之间的相关性,阐明ISL1促进肿瘤耐药性的机制是通过促进自噬来实现的。 【实验内容】 (1)CCK-8实验和蛋白质印迹实验分别检测ISL1表达量不同的两株胃癌细胞系对5-FU的耐药性差异和自噬强度;(2)过表达/敲低ISL1,检测两种细胞对5-FU的耐药性变化和自噬强度;(3)在过表达或敲低ISL1基础上抑制或增强自噬,检测两株胃癌细胞系在5-FU处理下的自噬强度和各自耐药性的改变。 【材料】 人胃癌细胞系MGC803、MKN28;5-FU;CCK-8试剂盒;过表达或抑制ISL1的质粒;雷帕霉素;3-甲基腺嘌呤;各蛋白抗体。 【可行性】 本实验所涉及的转录因子ISL1为本实验室主要研究对象,因此,本实验在理论指导、材料准备上都有很大的可行性。 【创新性】 自噬与肿瘤耐药之间的关系尚无定论;自噬在胃癌细胞耐药性中的作用也未见报道。因此,本实验属理论创新,且具有应用价值,对肿瘤治疗乃至药物靶点设计方面都有一定意义。