家族性高胆固醇血症致病基因PCSK9的研究进展

家族性高胆固醇血症(FH)是一种常染色体单基因显性遗传性疾病,其主要的临床特征为血浆低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平明显升高、肌腱或皮肤黄色瘤、早发冠状动脉粥样硬化和冠状动脉粥样硬化性心脏病等。人类枯草溶菌素转化酶9(PCSK9)基因是FH的致病基因之一。PCSK9通过调节低密度脂蛋白受体在肝脏降解,从而间接调节LDL-C水平。PCSK9基因突变可分为失功能性突变和功能获得性突变,是目前降脂药物的研究热点。     

一个中国X性连锁少汗型外胚层发育不良家系的遗传变异分析

【目的】 前期,课题组在临床工作中发现了一个X性连锁少汗型外胚层发育不良(XLHED)疑似患者家系。该家系共四代24例,男性15例,女性9例,患者4例。鉴此,课题组拟通过分子水平的研究,分析鉴定该家系的致病基因和遗传突变,探讨可能的分子致病机制,为疾病的预防与治疗奠定一定的基础。 【方法】 课题组对该家系资料进行了收集和整理,绘制出了遗传图谱。本课题对疾病家系中所有患病及未患病个体进行了详细的临床检查,并获得患者口腔的临床和X线照片。遗传分析中课题组运用直接测序的方法对候选致病基因进行序列分析,并与300例正常对照人群的基因序列进行序列比对。 【结果】 在该家系中,4例患者均为男性,另有5例女性确认为是携带者。测序结果显示,所有患者和携带者中EDA基因的第220个密码子发生点突变(C→T),造成密码子CCA转变为CTA,对应的氨基酸残基由脯氨酸转变为亮氨酸。同时,在该家系的其他健康成员以及随机选取的300例正常对照人群中均未检测到该突变。 【结论】 XLHED是一种X连锁的遗传疾病,目前研究发现XLHED的发生发展与3个基因有关,分别是位于Xq12-q13.1的EDA、位于2q11-q43的EDAR和位于1q42.2-q43的EDARADD。本XLHED家系是由EDA基因突变引起的。已知EDA蛋白具有4个功能区,包括:跨膜区、弗林蛋白酶切割位点、(Gly-X-Y)19胶原样结构域、TNF同源结构域。其中(Gly-X-Y)19胶原样结构域及TNF同源结构域位于细胞外,构成细胞外C末端结构域。本课题组所鉴定的突变c.659C>T是一个新的,且从未被报道过的错义突变。在19个(Gly-X-Y)胶原样结构域中,本次鉴定的突变发生在第13个(Gly-X-Y)的Y位,造成脯氨酸残基被亮氨酸残基替代。由于脯氨酸和亮氨酸侧链基团的差异,很可能造成肽链上该位点之后氨基酸残基的空间走向改变,影响EDA蛋白的空间构象,进而造成EDA-EDAR结合障碍,使之无法有效激活NF-κB的信号传导途径。进一步阻断或削弱了外胚层发育所必须的基因表达。本课题的完成将进一步丰富EDA基因突变谱,并为XLHED致病机制的研究提供新思路和新线索。     

中国早发2型糖尿病家系MODY 1-5基因测定

 【目的】 通过对早发2型糖尿病家系先证者进行直接测序,寻找中国人群中可能存在的青少年的成人发病型糖尿病(MODY) 1-5基因突变｡【方法】 对19个早发2型糖尿病家系的先证者进行MODY 1-5基因扩增和DNA直接测序｡【结果】 19个先证者未发现MODY基因突变,但发现MODY 1-5基因分别存在6､5､15､1､1种多态性｡【结论】 MODY相关基因突变具有种族异质性,MODY 1-5基因突变不是该19个早发糖尿病家系的致病因素｡     

家族性高胆固醇血症的药物治疗现状和进展

家族性高胆固醇血症(FH)是基因突变所致血脂紊乱,常见的致病基因有低密度脂蛋白(LDL)受体基因、载脂蛋白B(ApoB)基因、前蛋白转换酶枯草溶菌素9型(PCSK9)基因等.FH是早发冠心病的重要原因.诊断主要根据血清LDL-C升高、早发冠心病、黄色瘤、基因检查结果等.目前,治疗FH的药物主要是他汀类,可联合胆固醇吸收抑制剂或胆汁酸螯合剂.近年,多种新型降胆固醇药物已被批准用于FH的治疗,包括PCSK9抑制剂、微粒体甘油三酯转运蛋白(MTTP)抑制剂和ApoB合成抑制剂等.     

酪氨酸羟化酶基因新突变导致多巴反应性肌张力障碍家系分析

【目的】研究多巴反应性肌张力障碍（DRD）家系TH基因突变特点。【方法】提取先证者及其父母和两个姐姐外周血基因组DNA,使用高通量测序（NGS）的方法对已知肌张力及运动障碍相关的256个致病基因进行检测。【结果】家系中2例患者（先证者和其大姐）的酪氨酸羟化酶（TH）基因外显子14、9存在c.1481C>T（p.Thr494Met）、c.943G>A（p.Gly315Ser）复合杂合突变,父母分别携带一个杂合突变,其表型正常的二姐和50名正常对照者均未检测到该突变。【结论】TH基因c.1481C>T（p.Thr494Met）、c.943G>A（p.Gly315Ser）突变导致了该DRD家系的基因异常,并且发现了新的TH基因突变,扩展了DRD基因型与临床表型的关系谱,对DRD的早期精准诊断和治疗是改善预后的关键。     

家族性高胆固醇血症(FH)致病基因的研究进展

 家族性高胆固醇血症(familial hypercholesterolemia,FH)的临床特征为血总胆固醇升高,尤其是低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-c)升高,沉积于组织,形成皮肤或肌腱黄色瘤,导致动脉粥样硬化甚至早发冠心病。FH的发病机制为LDL受体(LDL receptor,LDLR)或apoB基因突变引起LDL受体途径功能缺陷,主要为常染色体显性遗传疾患,具有基因剂量效应;部分患者为常染色体隐性遗传,机制为LDL受体衔接蛋白1(LDL receptor adaptor protein 1,LDLRAP1)失功能型突变,导致LDL内化活性降低。罕见的人类枯草溶菌素转化酶9 (proprotein convertase subtilisin/kexin type 9,PCSK9)发生功能型突变也可引起严重的FH表型。PCSK9通过降解LDLR蛋白间接下调LDL受体途径,其失功能突变可致血浆LDL水平下降。因此PCSK9是目前降脂药物的研究热点。     

单纯型大疱性表皮松解症的角蛋白基因突变分析

目的检测单纯型大疱性表皮松解症(EBS)致病基因角蛋白5(K5)和角蛋白14(K14)基因突变,分析基因型和表型之间的相关性。方法采用PCR和直接测序法对中国汉族人3个EBS家系进行K5基因和K14基因的突变检测,以100例健康人作为正常对照。结果K5基因发现2个突变,一个为移码突变c.1649delG,另一个为错义突变c.508G>A;K14基因发现一个错义突变,为c.1237G>A;在正常对照中未发现上述突变。结论K5或K14基因突变导致该3个家系中患者发病。     

丝氨酸缺乏和p53依赖的代谢重构对乳腺癌细胞的影响

【立论依据】 丝氨酸对肿瘤细胞增殖具有重要作用。丝氨酸缺乏可导致肿瘤细胞氧化应激,对其增殖产生抑制。肿瘤抑制基因p53在抗氧化代谢中发挥不可或缺的作用,因此p53可帮助肿瘤细胞耐受丝氨酸缺乏。这与p53的抑癌功能是一对矛盾,利用此矛盾可为肿瘤治疗提供新的思路。 【设计思路】 选取p53突变或缺失的三阴性乳腺癌细胞系,给予丝氨酸缺失的培养环境,观察其增殖情况、相关基因和蛋白表达情况。以p53阳性的乳腺癌细胞和正常培养基作对照 【实验内容】 MDA-MB-157(P53 null)或HCC1937(P53 mutant)分别用不含丝氨酸的培养基(-SG)、加入丝氨酸的-SG、加入丙酮酸和GSH的-SG,进行72 h培养,每24 h用流式细胞仪检测细胞数量、细胞周期和细胞内ROS水平,酶标仪检测抗氧化能力、GSH和GSSG水平,Real-time PCR检测P53、PHGDH的mRNA转录,蛋白质印迹检测p53、PHGDH的蛋白表达。MCF-7(P53 wildtype)作为P53的阳性对照。 【材料】 MCF-7、MDA-MB-157或HCC1937、MEM培养液(HyClone SH30024)、丝氨酸、丙酮酸、GSH,相关的试剂盒和试剂。 【可行性】 已进行预实验,已实践过实验内容中提及的操作,已观察到MCF-7在丝氨酸缺乏时增殖先受抑制后恢复、细胞内ROS水平上升、PHGDH表达上升 【创新性】 p53对肿瘤细胞代谢的影响已成为研究热点。多数肿瘤中近一半存在p53基因的突变,丝氨酸在肿瘤增殖中的重要地位,使得丝氨酸、p53以及相关的信号调节通路和酶可能成为肿瘤治疗的新靶点。     

PCSK9——高胆固醇血症的新靶点

前蛋白转化酶枯草溶菌素9基因(PCSK9)是近十年来发现的一种新的致病基因,基因突变主要有功能获得型、功能缺失型,前者通过介导肝脏低密度脂蛋白受体(LDLR)的降解、减少LDLR的数量、降低肝脏对LDLR的清除,引起高胆固醇血症,在脂质代谢中发挥着重要作用。血清中低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平与冠心病的发生风险呈正相关,使用他汀类等降脂药物后,大大降低了高胆固醇血症患者的LDL-C及冠心病的发病风险,但仍有大部分患者LDL-C未达到理想目标。动物实验及临床试验显示,PCSK9抑制剂可大幅度降低各种高胆固醇患者的LDL-C水平,给高胆固醇血症患者带来了福音;但其发挥作用的确切机制需进一步研究。     

探究3C蛋白酶切割p51在B组柯萨奇病毒致病毒性心肌炎中的作用

【立题依据】 B组柯萨奇病毒(CVB)是病毒性心肌炎的主要病原体,可引发扩张型心肌病,尚无治疗药物。CVB的3C蛋白酶切割前体蛋白形成结构蛋白,完成病毒复制,也通过切割宿主蛋白发挥致病作用。我们发现宿主细胞中一个长约51kDa的蛋白质(其功能尚不清楚,暂称为p51)有3C蛋白酶的特异性酶切位点,推测p51是CVB的作用靶点之一,3C蛋白酶切割p51可能是CVB致病的新机制。 【设计思路】 通过蛋白质过表达和沉默等分子生物学技术,在细胞和动物实验中证实CVB 3C蛋白酶可以切割p51,并通过通过切割p51发挥致病作用。 【实验内容】 本实验设计通过以下4方面研究CVB通过其3C蛋白酶切割p51致病的作用机制:(1)构建真核表达载体质粒pEGFP-p51;(2)细胞实验确定3C蛋白酶通过特异性位点切割p51;(3)细胞实验确定CVB通过3C蛋白酶切割p51发挥致病作用;(4)动物实验确定3C蛋白酶可以切割p51并在CVB致病毒性心肌炎中发挥作用。 【材料】 HeLa细胞;Balb/c小鼠;CVB3,嗜心肌CVB3 H3株;质粒:pEGFP-C1,pEGFP-2A,pEGFP-3C;干扰RNA:通过商业渠道购买。 【可行性】 本实验设计有充分依据表明p51有CVB 3C蛋白酶的酶切位点,CVB可能通过3C蛋白酶切割p51发挥致病作用,从而导致病毒性心肌炎和扩张型心肌病。 【创新性】 通过本实验,我们可能揭示CVB致病的新机制,能够更加全面地了解CVB致病毒性心肌炎的分子机制,为研发抗CVB药物提供新靶点,为临床治疗提供新方向,有广泛的应用前景。     

家族性良性慢性天疱疮一家系及ATP2C1基因突变分析

目的 报道家族性良性慢性天疱疮一家系,并对ATP2C1基因突变进行分析。方法 收集家族性良性慢性天疱疮家系成员的一般资料,进行临床调查,绘制家系图谱。采用PCR及Sanger直接测序法对该家系中4例患者的ATP2C1基因进行检测,并以该家系3例健康者和100例无亲缘关系的正常人作为对照。结果 4例家族性良性慢性天疱疮患者ATP2C1基因的第21号外显子的第472位核苷酸由G变为A,该突变导致原先158位的天冬氨酸变为天冬酰胺（p.Asp158Asn）的错义突变。而家系中健康对照及无亲缘关系的正常人均未发现该突变。结论 ATP2C1基因的第21号外显子的第472位核苷酸由G变为A是ATP2C1基因新的突变位点,可能是家族性良性慢性天疱疮家系发病的主要原因。     

129个常染色体显性遗传性多囊肾病家系的致病基因检测及分析

目的 探讨中国常染色体显性遗传性多囊肾病（ADPKD）患者多囊肾病1型致病基因（PKD1）和多囊肾病2型致病基因（PKD2）的突变类型。方法 采用长链PCR和高通量测序方法对129个ADPKD家系的PKD1和PKD2基因进行突变分析,并用双脱氧链终止法测序技术对阳性突变进行验证。结果 在129个ADPKD遗传家系中共检测到116个家系存在PKD1或PKD2基因的118个突变位点,检出率为89.9%（116/129）。PKD1和PKD2的突变率分别为92.2%（107/116）和8.6%（10/116）。在这118个突变位点中,80个（67.8%）为新突变,38个（32.2%）为已知突变;109个位于PKD1（33个已知突变和76个新突变）,9个位于PKD2（5个已知突变和4个新突变）。结论 新发现的PKD1和PKD2突变位点将有助于ADPKD患者的早期诊断和预后预测,并为临床干预提供基本的遗传信息。     

一个家族性高胆固醇血症家系基因突变分析

目的:对临床确诊的一个家族性高胆固醇血症(FH)纯合子家系进行基因突变分析,分析基因型与临床表型之间的关系,探讨其发病机制。方法:在这个包括48名成员的家系中,16例患者有高胆固醇血症。提取患者及家系成员外周血基因组DNA,对患者聚合酶链反应扩增ApoB100基因Q3500R位点并进行测序,确定有无常见突变,同时对包括患者在内的48名成员针对与PCSK9基因相连锁的微卫星位点D1S417,D1S2797,D1S2890以及与LDL-R基因相连锁的微卫星位点D19S221,D19S394进行连锁分析。结果 :核苷酸序列分析未发现ApoB100基因Q3500R突变,数个常见的与LDL-R基因或PCSK9基因相连锁的微卫星多态位点与此FH无连锁。结论:对该FH家系,未发现常见的ApoB100突变,微卫星多态性分析未发现与LDL-R基因,PCSK9基因连锁的多态性存在。是否存在新的突变基因,尚需下一步通过全基因组扫描验证。     

低钾型周期性麻痹患者的临床及基因特征

目的 分析低钾型周期性麻痹患者的临床特征及基因突变特点。方法 对32例低钾型周期性麻痹患者进行基因筛查,发现6例存在基因突变,回顾性分析这6例患者的临床及基因特征,并进行家系研究。基因检测应用聚合酶链式反应后直接测序。结果 6例患者均青少年发病,5例发作有明确诱因,检测血钾低且补钾治疗有效。5例患者有明确低钾型周期性麻痹家族史。患者基因突变分别为CACNA1S基因c.1583G>A（p.Arg528His）、c.2627T>A（p.Val876Glu）、c.2690G>A（p.Arg897Met）及c.2700G>C（p.Arg900Ser）突变以及SCN4A基因c.2015G>A（p.Arg672His）和c.2024G>A（p.Arg675Gln）突变,其中CACNA1S基因p.Arg528His和SCN4A基因p.Arg672His为热点突变,Arg897Met为新的突变位点。结论 6例低钾型周期性麻痹患者临床表现典型,存在CACNA1S或SCN4A基因的胚系突变,CACNA1S Arg897Met为新的突变位点。     

铜绿假单胞菌中c-di-gmp相关的突变菌株的研究

【立论依据】 作为一种新型而广泛存在的第二信使,环鸟苷二磷酸(c-di-GMP)调控细菌的运动性、生物膜合成、细菌毒性、细胞周期等多种生理过程;而这些功能均与细菌的致病性及耐药性密切相关。在细菌中,环鸟苷二磷酸的代谢及胞内水平是由两种催化功能相反的酶共同起作用:鸟苷酸环化酶(diguanylate cyclase, DGCs)将两分子GTP转化生成一分子c-di-GMP; 而环鸟苷二磷酸特异的磷酸二酯酶 (phosphodiesterase,PDEs)则将c-di-GMP分解为pGpG,并最终水解为GMP。鸟苷酸环化酶具有高度保守的GGDEF蛋白结构域, 环鸟苷二磷酸特异的磷酸二酯酶则具有EAL结构域或较为少见的HD-GYP结构域,这些蛋白统称为环鸟苷二磷酸代谢蛋白(c-di-GMP metabolizing proteins)。铜绿假单胞菌模式菌株PAO1中有多达38个含GGDEF及EAL结构域的蛋白;然而,环鸟苷二磷酸是水溶性的小分子化合物;细胞内却存在如此多的担负环鸟苷二磷酸代谢功能的基因,这些具有“重叠性”的基因功能及其相互协调的机制完全不清楚。 【设计思路】 基因突变将导致表型变化,由此将表型与基因型相联系,从而使得对特定基因功能进行分析成为可能。 【实验内容】 本项研究利用细菌表型分析及PCR手段,比较不同的基因在细菌的生物膜合成及泳动性中的作用。 【材料】 以课题组拥有的多个GGDEF及EAL结构域突变的铜绿假单胞菌突变菌株为主要研究对象。 【可行性】 (1)已经拥有多个环鸟苷二磷酸代谢相关的突变菌株,实验材料有所保证;(2)涉及到的实验方法,例如细菌培养及PCR,均较为规范和易于掌握。 【创新性】 本项研究中涉及到的多个基因均未见详细的分析、鉴定;我们将以野生型为对照,在确定基因型的基础上,对突变体菌株的表型进行较为精细的分析、比较,由此为未来进一步的研究工作奠定基础。     

伴有酸中毒的家族性低钾型周期性瘫痪诊疗分析

【目的】探讨伴有酸中毒的家族性低钾型周期性瘫痪的诊断和治疗。【方法】分析先证者病史、临床表现、实验室检查和影像学特点,详细调查家系患病情况,应用二代测序技术检测低钾血症相关致病基因位点,对国内外相关文献进行归纳总结。【结果】明确诊断先证者为家族性低钾型周期性瘫痪,先证者的SCN4A基因有1个杂合突变,为c.2006G>A,导致氨基酸改变p.R669H。先证者的祖父、父亲和伯伯存在相同变异。【结论】伴酸中毒的家族性低钾型周期性瘫痪罕见,容易误诊为肾小管酸中毒,临床上要提高警惕。SCN4A基因c.2006G>A突变是该家系发病的分子基础。不同基因突变的临床表型存在差异,基因筛查有助诊断分型和治疗方案选择。     

罕见脑桥小脑发育不全家系临床研究及遗传学分析

目的 通过对一个脑桥小脑发育不全（PCH）家系的临床和基因进行研究,探讨它的临床特点及致病基因。方法 对一个脑桥小脑发育不全的家系成员进行临床资料的收集,绘制遗传系谱图,进行认知、脑电、头颅磁共振及全外显子组测序分析,筛选出相关的基因突变,然后对其进行Sanger测序,进行验证。结果 该家系成员中除先证者及其弟,其他成员没有类似疾患表现。先证者及其弟发病年龄、发病症状及神经系统查体结果相似。全外显子组测序：①未能发现该疾病已知的相关基因突变;②未能筛选出临床表型与遗传方式相匹配的突变基因作Sanger测序;③发现了1个基因突变,符合常染色体隐性遗传,但是否与该疾病相关,有待进一步的研究。结论 脑桥小脑发育不全可能有新的基因表达类型。     

华人遗传性混合息肉病综合征BMPR1A基因种系突变检测

【目的】探讨遗传性混合息肉病综合征华人家系中BMPR1A基因是否存在种系突变。【方法】34个家系成员外周血提取基因组DNA，利用聚合酶链式反应分别扩增BMPR1A基因全部外显子，进行DNA测序与突变分析，对突变外显子PCR扩增产物作变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。【结果】家系12和2所有发病成员BMPR1A基因2号外显子位于codon23处缺失11个碱基(AAAGTCAGAAA)，同时2号外显子PCR扩增产物变性聚丙烯酰胺凝胶电泳也发现异常迁移条带，而家系中正常成员的检测未发现这一突变。【结论】两华人HMPS家系中BMPR1A基因缺失突变与疾病共遗传，该基因极可能是HMPS华人家系的致病基因。     

近亲结婚1家系Leber先天性黑矇TULP1基因新突变

目的 检测近亲结婚Leber先天性黑矇(LCA)家系致病基因突变。方法 选择近亲结婚Leber先天性黑矇家系作为研究对象,收集家系成员眼科检查资料和病史,采集外周静脉血,提取DNA。先证者采用全基因组外显子测序技术进行致病基因突变筛查;通过生物信息学分析后得到候选致病突变位点。运用Sanger测序进行验证及家系共分离分析,确定致病性突变位点。结果 基因检测在先证者TULP1基因(MIM#602280)第11号外显子检测到新的纯和错义突变c.C1024G(p.R342G),编码区第1024位的核苷酸C(胞嘧啶)变异为G(鸟嘌呤),变异导致编码蛋白序列内的氨基酸改变p.R342G,第342号氨基酸由精氨酸(Arg)变异为甘氨酸(Gly)。342号氨基酸位点在不同物种间具有高度保守性。生物学信息预测提示为致病性。结论 TULP1基因纯和错义突变c.C1024G:p.R342G是该家系的致病原因。该纯合突变国内外均未见报道,是一种新发现的LCA致病基因突变。本研究扩大了LCA基因突变谱,为LCA基因治疗及发病机制研究提供了依据。     

颗粒状角膜营养不良Ⅱ型家系的TGFBI基因筛查

目的 对颗粒状角膜营养不良II型（GCD2）的家系进行TGFBI基因筛查,寻找患病原因。方法 对GCD2家系患者TGFBI基因的所有外显子进行突变检测,以GCD2家系中的健康成员和100例无亲缘关系的正常志愿者DNA样本作为对照。结果 GCD2家系所有患者TGFBI基因4号外显子的第370位碱基发生纯合或杂合的G>A突变,导致TGFBI基因编码的蛋白质的第124位氨基酸R变为H。结论 错义纯合和杂合R124H突变是导致GCD2家系角膜营养不良不同临床表型的主要病因。