具有抗氧化活性的含硒短肽的研制

【立论依据】 硒蛋白是微量元素硒发挥生物学功能的主要形式。人体中硒蛋白在抗氧化、抗肿瘤和调节免疫等方面都具有显著的作用,其中抗氧化活性是多种硒蛋白最核心的生物学功能。研制一种具有潜在应用价值的、类似于硒蛋白的抗氧化活性的含硒短肽具有重要意义。 【设计思路】 选取抗氧化活性最强的硒蛋白如硒蛋白P、谷胱甘肽过氧化物酶等,设计出3~5种含硒代半胱氨酸活性中心的硒蛋白截短型的短肽,根据硒蛋白基因表达的特殊性构建其表达载体及其哺乳动物细胞表达体系,实现此类含硒短肽的准确、高效的翻译,再通过抗氧化检测筛选出具有应用开发价值的短肽。 【实验内容】 (1)用于硒蛋白基因工程表达的哺乳动物细胞株的建立:选择在人类硒蛋白翻译过程中将编码硒代半胱氨酸密码子TGA正确解码时起着重要作用的3个反式作用因子,即SECIS 结合蛋白2(SBP2)、Sec特异延伸因子(EFSec)和核糖体蛋白L30(RPL30),将它们的编码基因分别克隆并构建为1个三基因表达载体pcDNA3.1-SBP2/Efsec/RPL30,稳定转染HepG2细胞系获得目的基因高表达的单克隆细胞株;(2)利用生物信息学的方法,筛选和设计硒蛋白截短型的短肽,并将其编码基因插入真核表达载体pcDNA4HisMaxB获得相应的重组载体;(3)利用各重组载体分别对已建立的转基因细胞株进行稳定转染,使目的基因表达并纯化获得含硒短肽;(4)利用常规的抗氧化检测方法,考察各种含硒短肽体外抗氧化活性,并筛选出最佳者用于后续研究。 【材料】 人肝癌细胞系HepG2;质粒pcDNA3.1、pcDNA4HisMaxB;各种基因工程工具酶及常规试剂;细胞培养及转染试剂;抗氧化检测试剂盒等。 【可行性】 硒蛋白复杂的翻译机制已经逐渐阐明,在原核生物细胞中利用反式作用因子提高硒蛋白表达已取得成功,为真核表达提供重要的启示,我们的设计在理论上是可行的;实验室相关技术方法及条件成熟,完全可满足本研究的要求。 【创新性】 具有抗氧化活性的硒蛋白分子量大限制了其药用价值,我们研究中将获得截短型的含硒短肽从而使其具有应用开发价值。此外,应用3个反式作用因子构建硒蛋白基因工程表达体系也是本研究的一个创新。     

pEGFP-N1-α-synuclein真核表达载体的构建

【目的】构建pEGFP-N1-α-synuclein真核表达载体,为研究帕金森病奠定基础。【方法】设计特异引物,PCR扩增α-synuclein cDNA并引入FLAG标签,克隆入pEGFP-N1质粒,对重组质粒进行酶切及测序,鉴定正确后转化Ecoh．DH5（大肠杆菌）,大量扩增重组质粒。试剂盒纯化重组质粒。用Lipofectamine^TM 2000将重组质粒转染2937细胞,Western blotting检测融合蛋白在细胞内的表达。【结果】pEGFP-N1-α-synuclein重组质粒构建成功,Westernblotting检测融合蛋白分子量为47kd,符合预期值。【结论】成功构建了人野生型α-synuclein与绿色荧光蛋白基因融合并加入FLAG标签的真核表达载体pEGFP-N1-α-svnuclein。     

重组人甲硫氨酸硫氧化物还原酶的原核表达、纯化及鉴定

目的：表达、纯化并鉴定人甲硫氨酸硫氧化物还原酶(hMsrA)。方法：将含有hMsrA基因的重组质粒转化大肠杆菌，经诱导表达，表达蛋白主要存在于上清中，经破菌、Ni-NTA Agarose亲和层析分离纯化目的蛋白。结果：SDS-PAGE显示纯化的蛋白相对分子质量为26000的单一条带；Western-blot鉴定该纯蛋白有免疫活性；酶活性测定表明，该纯化蛋白具有还原甲硫氨酸硫氧化物的能力。结论：hMsrA能在原核体系中良好表达，经纯化后具有催化活性，为大量制备并进一步研究抗氧化剂在动脉粥样硬化中的作用提供了科学途径。     

从人卵巢cDNA文库中筛选与蛋白激酶Wee1B相互作用蛋白及在小鼠1-细胞期受精卵中的功能验证

【目的】 筛选与蛋白激酶Wee1B相互作用的候选分子,证实该蛋白与Wee1B的相互作用及作用机制,并进一步探讨其对小鼠受精卵早期发育的影响,本研究对揭示小鼠受精卵早期发育的分子机制和生殖机理具有十分重要的意义,为优化人类辅助生殖提供理论和实验依据。 【方法】 构建pGBKT7-Wee1B诱饵质粒并转入酵母感受态细胞中检测其对酵母的毒性、自激活能力以及表达情况,再将含有pGBKT7-Wee1B的酵母感受态细胞与人卵巢cDNA文库相融合,利用酵母双杂交系统筛选出阳性克隆,提取阳性克隆的酵母质粒转化大肠杆菌后进行测序鉴定。经酵母重新转化验证后,在哺乳动物细胞中使用免疫共沉淀和免疫荧光共定位的方法确定候选分子与Wee1B蛋白激酶的相互作用。过表达或降低筛选分子,并显微注射入小鼠1-细胞期受精卵中观察Wee1B的蛋白激酶活性和定位的变化及候选分子是否通过Wee1B调控小鼠受精卵的早期发育。 【结果】 以小鼠Wee1B编码基因的pcDNA3.1/V5-His-TOPO-Wee1B-WT野生型质粒为模板,设计特异性引物构建出pGBKT7-Wee1B诱饵质粒;诱饵质粒pGBKT7-Wee1B对酵母感受态细胞无毒性,无自激活能力,通过蛋白质印迹法验证其在酵母感受态细胞中表达;酵母双杂交系统从人卵巢cDNA文库中筛选出了9个与Wee1B蛋白激酶存在相互作用的蛋白;免疫共沉淀证实蛋白激酶Wee1B与KHDRBS3蛋白在HEK293细胞中存在相互作用;免疫荧光共定位确定蛋白激酶Wee1B与KHDRBS3蛋白在小鼠受精卵中共定位;干预KHDRBS3影响Wee1B的蛋白激酶活性和定位,并影响小鼠受精卵的早期发育。 【结论】 成功构建pGBKT7-Wee1B质粒,并以此为诱饵,利用酵母双杂交系统从人卵巢cDNA文库筛选出KHDRBS3蛋白;免疫共沉淀证实KHDRBS3与Wee1B存在相互作用,且二者在小鼠1-细胞期受精卵中共定位。以上提示KHDRBS3蛋白可能通过调控Wee1B的蛋白激酶活性和定位进而参与小鼠受精卵的早期发育。     

H-2Kb/OVA257-264复合体的原核表达、折叠、纯化与鉴定

【目的】 目前pMHC复合体(即MHC分子与抗原肽的复合体)常被用来检测特异性T细胞的数量,还是T细胞功能分析、抗原表位验证以及T细胞靶向治疗等诸多方面的有力工具。但是其制备技术复杂,复性、折叠和纯化等步骤受多种因素限制,产出效率较低。国内目前尚无生产厂家,一定程度上限制了我国基础与临床免疫学的更快发展。本实验旨在制备小鼠H-2K^b/OVA_257-264复合体,验证其正确构象和与特异性T细胞TCR有效结合的功能,为在小鼠模型中进行移植排斥和肿瘤的生物治疗研究提供靶向工具。 【方法】 利用IPTG诱导编码小鼠H-2K^b蛋白重链的重组质粒和OVA-β2m 融合蛋白的重组质粒在大肠杆菌BL21中表达;通过超声粉碎、洗涤、化学纯化等方法收集两种重组蛋白,经SDS-PAGE鉴定重组蛋白的纯度和分子大小;再经稀释复性法在体外折叠并超滤浓缩;利用尺寸排阻层析法在FPLC系统中纯化收集H-2K^b/OVA复合体,经BCA法蛋白定量后分装保存;通过包被细胞大小的PLGA微球,用H-2K^b分子构象特异性单抗进行荧光染色,经流式分析验证该复合体的空间构象;利用OVA抗原特异性的OT-1细胞株和流式细胞术分析检测该自制分子与TCR的结合能力。 【结果】 两种重组质粒在大肠杆菌中表达后,经SDS-PAGE分析分子量同预计大小相等;复性、折叠、FPLC系统纯化洗脱后得到3个峰,其中第一个洗脱峰经SDS-PAGE鉴定证实含有重链蛋白和轻链蛋白,为H-2K^b/OVA复合体峰;流式荧光染色分析显示:该复合体包被PLGA后能与构象特异性抗体呈有效结合,提示构象正确;用该分子制备的PE-标记的H-2K^b/OVA四聚体染色OT-1转基因鼠的脾细胞,经流式检测:OT-1细胞占脾细胞群的16.35%。 【结论】 利用大肠杆菌成功表达了小鼠H-2K^b分子的重组重链和轻链,并经体外折叠和纯化成功制备了构象正确、能与特异性TCR结合的H-2K^b/OVA复合体。     

结核分枝杆菌38KD蛋白对小鼠树突状细胞的功能影响

【立论依据】 结核分枝杆菌(MTB)是结核病的病原菌,属胞内寄生菌。MTB感染机体后由抗原提呈细胞(APC)将抗原分子提呈给初始T细胞,诱导体内产生以细胞免疫为主的适应性免疫应答。树突状细胞(DC)作为提呈能力最强的APC在机体抗结核免疫中起着重要作用。有研究表明MTB可通过影响DC的功能来调节淋巴细胞的应答。如Palma 等发现MTB的PstS1蛋白可刺激DC诱导记忆性T细胞增殖并分泌更多的IFN-γ 和 IL-22;Byun 等则发现Rv0315(一种新的MTB抗原)可促进DC的成熟进而诱导Th1型免疫应答。而38KD蛋白作为MTB的一种具有强免疫原性的免疫原,其对树突状细胞的影响尚不清楚。本课题通过体外诱导表达MTB-38KD蛋白,刺激小鼠DC,研究其相关分子的变化情况,以明确38KD蛋白对DC的功能影响。 【设计思路】 构建38KD载体,诱导蛋白表达纯化后体外刺激小鼠DC,在不同时间点检测DC相关分子表达情况。 【实验内容】 38KD蛋白基因从MTB提取扩增验证后,将其构建到pET28a质粒上转入大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导蛋白表达并纯化,以不同浓度38KD蛋白刺激小鼠骨髓源DC,在不同时间点用流式细胞术检测表面CD11c、B7、MHC-Ⅱ等分子表达、ELISA检测培养上清IL-4、IL-10、IL-12、IFN-γ分泌情况。 【材料】 昆明小鼠、MTB菌株、质粒pET28a、BL21(DE3)、DNA纯化试剂盒、质粒提取试剂盒、SDS-PAGE配胶所需试剂、相关细胞因子ELISA检测试剂盒、荧光标记抗体(抗CD11c、B7、MHC-Ⅱ)等。 【可行性】 已有研究表明MTB的抗原成分与DC有关,38KD蛋白作为MTB的主要免疫原,极有可能对DC的功能有一定的影响;项目组已构建38KD蛋白原核表达载体,并参与发表相关科研文章,具有一定的结核研究基础,并可提供相关理论和技术支持。 【创新性】 本课题首次观察MTB-38KD蛋白对小鼠DC的影响,为后续抗MTB感染机制的研究提供理论基础。     

宿主因子NF90调节流感病毒复制的研究

【目的】 研究流感病毒的宿主因子NF90对流感病毒复制的影响。 【方法】 从 293T细胞中提取总RNA,以Oligo(dT)反转录cDNA。根据Gen Bank 中NF90的基因序列,设计上下游引物。以转录出的cDNA为模板扩增出NF90基因。用EcoR I 和Not I两种核酸内切酶对NF90 PCR扩增产物和PCDNA3.1-V5-HIS载体进行双酶切,酶切产物用高效DNA连接酶连接,然后鉴定选取正确的重组质粒,并命名为PCDNA3.1-NF90-V5-HIS。把PCDNA3.1-NF90-V5-HIS重组质粒转染至293T细胞,转染36 h后感染流感病毒A/WSN/1933 Moi 0.01,感染16 h后提取293T细胞的总蛋白,用蛋白质印迹法检测PCDNA-NF90-V5-HIS 重组质粒和流感病毒NP蛋白的表达。 【结果】 PCDNA3.1-NF90-V5-HIS重组质粒转染至细胞后,NP蛋白表达下降,流感病毒复制减弱。 【结论】 宿主因子NF90可以抑制流感病毒的复制。     

Livin siRNA表达质粒的构建及其对宫颈癌HeLa细胞的作用

 【目的】 构建和鉴定针对人抑凋亡基因livin的siRNA质粒载体,并研究其对宫颈癌HeLa细胞的作用&#65377;【方法】 设计和合成针对人livin基因的siRNA寡核苷酸,定向克隆入质粒载体pmU6,脂质体瞬时转染入HeLa细胞中,用RT*9鄄PCR技术检测livin基因的mRNA表达水平,Western Blot技术检测Livin蛋白表达水平&#65377;用MTT法分析HeLa细胞增殖改变,流式细胞仪检测HeLa细胞周期变化&#65377;【结果】 livin siRNA表达质粒能高效而特异地剔除HeLa细胞中livin的表达,抑制肿瘤细胞增殖(P < 0.05),将HeLa 细胞阻止在G1期&#65377;【结论】 livin基因的siRNA对HeLa细胞增殖和细胞周期调控有重要影响,细胞凋亡可能是导致其细胞死亡的主要原因&#65377;     

SHP2/Hook1通过上皮间质转化调控肺肿瘤转移的机制研究

【立论依据】 肿瘤转移是肿瘤患者死亡的最主要原因,而上皮间质转化在肿瘤转移的起始过程中发挥重要作用。原癌基因ptpn11表达的蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2在多种肿瘤中存在突变或高表达现象,提示SHP2参与肿瘤的发生与进展。本项目的前期研究发现SHP2促进上皮间质转化过程,且需要其酶活性的参与;新发现的SHP2相互作用蛋白Hook1在上皮间质转化中具有相反的抑制作用,而Hook1与SHP2的催化结构域结合。 【设计思路】 本项目对Hook1是SHP2的内源酶抑制剂这一假设进行研究,并探究SHP2与Hook1形成的蛋白复合物通过调节上皮间质转化过程影响肺肿瘤转移的可能性。 【实验内容】 (1)原核表达与纯化带有His标签的SHP2和Hook1蛋白,通过测定SHP2蛋白磷酸酶的活性探讨Hook1能否抑制SHP2的酶活性;(2)定量PCR、蛋白质印迹方法比较侵袭能力不同的肺上皮细胞中SHP2和Hook1在mRNA与蛋白水平上的差异;(3)miRNA干扰或过表达方法改变两种蛋白的表达水平,观察其对肿瘤细胞的迁移及侵袭能力的影响;(4)构建破坏SHP2与Hook1相互作用的截短或点突变质粒,探究Hook1对上皮间质转化以及细胞侵袭的影响是否需要SHP2的参与;(5)体内实验验证改变SHP2或Hook1的表达是否影响肿瘤细胞在小鼠体内的成瘤能力。 【材料】 原核表达质粒PET21a,His亲和纯化树脂,非小细胞性肺癌细胞株A549,SHP2siRNA,pCDNA3.1-SHP2及突变体表达载体,Hook1siRNA,pCDNA3.1-Hook1及突变体表达载体,抗SHP2、Hook1抗体,4组(每组9只,共36只)NOD/SCID小鼠。 【可行性】 前期研究发现SHP2的蛋白酪氨酸磷酸酶活性能够促进肺上皮细胞的上皮间质转化过程;SHP2的催化结构域相互作用蛋白Hook1则抑制上皮间质转化过程。在此基础上我们推测SHP2和Hook1通过上皮间质转化从而对肿瘤的转移产生影响,并且Hook1的作用需要SHP2的参与。故本研究具有较强的可行性。 【创新性】 新发现的与SHP2催化结构域相互作用的Hook1有可能成为首个SHP2的内源抑制蛋白。明确SHP2/Hook1复合物在上皮间质转化以及肿瘤转移中的作用,有助于认识SHP2与肿瘤转移的关系,所揭示的分子机制有望为肿瘤转移的早期诊断及临床治疗提供新的潜在靶点。     

致婴幼儿腹泻星状病毒非结构蛋白诱导宿主细胞凋亡的分子机制

星状病毒(human astrovirus,HAstV)是导致婴幼儿腹泻的重要病原体,发病率高,易造成群体感染,威胁公共卫生安全。目前HAstV导致腹泻的致病机制尚不明确。本研究前期工作基础表明HAstV非结构蛋白nsP1a能够诱导细胞凋亡,是病毒诱发腹泻的主要原因。基于前期研究结果,本研究以nsP1a蛋白为研究对象,深入探讨nsP1a诱导细胞凋亡的能力及信号通路,并筛选鉴定nsP1a蛋白诱导细胞凋亡的关键结构域。【立论依据】 文献表明,病毒诱导的腹泻大多与小肠上皮细胞凋亡密切相关。前期研究表明HAstV野毒株能诱导Caco-2细胞凋亡,非结构蛋白nsP1a起到主要作用。基于前期实验结果,本研究深入开展nsP1a诱导Caco-2凋亡的分子机制研究。 【设计思路】 以nsP1a蛋白为研究对象,探讨nsP1a蛋白诱导细胞凋亡的分子机制,明确nsP1a蛋白诱导的凋亡是通过何种途径发挥作用;筛选鉴定nsP1a蛋白促凋亡作用的关键结构域。 【实验内容】 构建nsP1a蛋白真核表达载体转染宿主细胞,建立稳定表达细胞株。采用流式细胞技术检测蛋白诱导细胞凋亡的能力。实时定量及蛋白质印迹法检测细胞caspase3、caspase8、caspase9、FADD蛋白、Bcl-2、Bax的表达变化。综合分析受体途径和线粒体途径参与诱导细胞凋亡的机制。构建nsP1a蛋白不同位点的删除突变体,流式细胞仪分析筛选nsP1a蛋白中诱导细胞凋亡的主要结构域。 【材料】 载体pEGFP-N3,Caco-2细胞, Lipofectamine 2000, caspase3、6、8、9,细胞色素C、FADD、PARP、LaminA/C,EGFP抗体等。 【可行性】 本研究由国家自然基金青年基金项目(81201285)及辽宁省大学生创新创业训练计划项目(201210160005)支持。 【创新性】 本研究内容国内外未见报道。本研究为探明nsP1a蛋白参与的星状病毒致腹泻机制提供理论依据,同时也为星状病毒抗腹泻药物的筛选提供有效靶点。     

维甲酸诱导基因I对氧固醇7α羟化酶的调控作用研究

【立论依据】 基因芯片结果显示,敲除维甲酸诱导基因I(RIG-I)的小鼠体内氧固醇7α羟化酶(下文称CYP7B1)基因水平发生变化,说明两者存在慢反应联系,本实验目的旨在探究这两个基因之间是否存在直接调控的快反应联系。 【设计思路】 本实验首先需要对基因芯片的结果进行确定,随后通过多种方式改变RIG-I的表达水平(干扰素刺激、质粒转染等),观察CYP7B1是否存在明显的协同表达变化。如果能确定两者之间确实存在直接调控关系,将进一步探究调控的具体机制,从分子水平阐释调控的环节。 【实验内容】 利用real-time PCR检测基因芯片结果;利用IFNγ上调RIG-I表达水平,并运用real-time PCR检测CYP7B1的表达水平变化;构建载有RIG-I基因的质粒并进行质粒转染,运用real-time PCR和蛋白质印迹法检测CYP7B1的基因表达和蛋白表达变化情况;转染RIG-I promoter,探究其调控CYP7B1的具体机制。 【材料】 细胞:293T细胞、Hela细胞、HepG2细胞等;其他:RIG-I、CYP7B1引物、一抗、二抗及其他常规所需试剂。 【可行性】 预实验中已经确定了RIG-I与CYP7B1间存在慢反应调控关系,同时也确定了相关文献中IFN-γ对RIG-I的上调作用,实验器材、试剂齐备。 【创新性】 本实验首次提出RIG-I基因与CYP7B1及其所参与的脂代谢过程有调控关系,对胆固醇代谢、神经甾体代谢、及CYP7B1缺乏所引起的一系列疾病的研究也可以提供一定的实验依据和理论支持。     

弓形虫重组粘附蛋白复合体MIC2-M2AP的制备、鉴定及免疫保护效应

【立论依据】 弓形虫微线体分泌的粘附蛋白MIC2与M2AP(MIC2相关蛋白)以1∶1的比例形成MIC2-M2AP六聚复合体,转移到弓形虫顶端与宿主细胞膜之间形成的连接区域,协助虫体进入宿主细胞。 【设计思路】 制备弓形虫重组粘附蛋白复合体MIC2-M2AP,鉴定其免疫原性和免疫反应性及其在抗弓形虫入侵宿主细胞中的作用,为筛选MIC2-M2AP作为弓形虫疫苗候选抗原的研究奠定基础。 【实验内容】 RT-PCR扩增弓形虫MIC2和M2AP基因,克隆至组成型表达的毕赤酵母表达载体pGAPZαA中,构建重组真核表达质粒 pGAPZαA-MIC2和pGAPZαA-M2AP,利用同源重组的方法将MIC2和M2AP基因整合到同一毕赤酵母细胞X33的基因组中进行发酵表达获得重组MIC2-M2AP复合体,His标签Ni-NTA柱亲和层析纯化后免疫小鼠,采用免疫小鼠血清和弓形虫感染鼠血清进行蛋白质印迹鉴定重组MIC2-M2AP复合体的免疫原性和免疫反应性,免疫小鼠抗重组MIC2-M2AP复合体多抗血清体外中和实验观察阻断弓形虫入侵宿主细胞效应,重组MIC2-M2AP复合体免疫小鼠的抗弓形虫感染效应。 【材料】 弓形虫RH株速殖子,毕赤酵母表达载体pGAPZαA。 【可行性】 国外文献已经证实MIC2-M2AP复合体在协助虫体的滑移运动和侵入细胞中发挥重要的作用,敲除MIC1基因后,弓形虫株对宿主细胞的入侵率下降50%,敲除MIC2的结合蛋白M2AP后,弓形虫株对宿主细胞的入侵率下降80%以上,因此重组MIC2-M2AP复合体有可能作为弓形虫疫苗候选抗原。目前我们已成功构建了重组真核表达载体 pGAPZαA-MIC2和pGAPZαA-M2AP,其核苷酸序列与GenBank中的序列同源性为100%。 【创新性】 国内外在弓形虫疫苗候选抗原筛选研究中,目前报道较多的是弓形虫表面抗原(SAG)、棒状体蛋白(ROP)、致密颗粒抗原(GRA)等可能作为弓形虫疫苗候选抗原的研究,而关于微线体蛋白(MIC)尤其是MIC2-M2AP复合体可作为弓形虫疫苗候选抗原的研究未见报道,而根据已报道的微线体蛋白相关研究成果,我们推测重组MIC2-M2AP复合体免疫会产生较强的免疫保护效果。     

泰山银杏外种皮多糖对食管癌细胞增殖和凋亡的影响

【目的】 探讨泰山银杏外种皮多糖(Ginkgo biloba exocarp polysaccharides,GBEP)对体外培养的食管癌细胞增殖和凋亡的影响及其作用机制。 【方法】 通过沸水浸提,有机溶剂沉淀,并通过sevage法除去蛋白,获得GBEP。利用MTT法检测不同浓度的GBEP对食管癌细胞EC-9706增殖的影响;流式细胞术检测细胞周期的分布;Annexin-V/PI双染分析凋亡率;蛋白质印迹法检测与细胞周期及细胞凋亡相关的蛋白表达变化。 【结果】 GBEP显著抑制EC-9706细胞的增殖,并呈时间、剂量依赖性。其半数抑制浓度(IC50)为138.9 μg/mL。细胞周期分析结果表明,GBEP处理后G1期细胞比例由52.25%增加至69.76%,蛋白质印迹结果显示细胞周期蛋白D1的表达呈浓度依赖性下降。说明GBEP诱导EC-9706细胞G1期阻滞。流式细胞术分析结果表明,GBEP诱导的EC-9706细胞凋亡随剂量和作用时间增加而增加。同时GBEP抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,增加促凋亡蛋白Bax的表达,促进caspase3的激活和PARP的剪切。 【结论】 泰山银杏外种皮多糖抑制食管癌细胞的增殖,诱导细胞G1期阻滞,并激活内源性细胞凋亡。     

亚洲牛带绦虫钙调神经磷酸酶B基因的原核表达 和免疫学分析

 【目的】 对亚洲牛带绦虫钙调神经磷酸酶B基因(CaN)进行克隆&#65380;表达和免疫学初步研究&#65377;【方法】 将亚洲牛带绦虫成虫钙调神经磷酸酶B基因克隆到原核表达质粒pET*9鄄30a(+)中,在大肠杆菌BL*9鄄21/DE3中用诱导表达,表达产物通过十二烷基磺酸钠*9鄄聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS*9鄄PAGE)进行鉴定,用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行纯化,纯化的重组蛋白用蛋白印迹进行免疫学分析&#65377;【结果】 PCR&#65380;双酶切及DNA测序结果均表明重组质粒pET*9鄄30a(+)*9鄄Ta CaN构建成功&#65377;SDS*9鄄PAGE结果表明目的基因能在大肠杆菌BL*9鄄21/DE3中表达,经亲和层析得到了纯化重组蛋白&#65377;重组蛋白能被感染了亚洲牛带绦虫的猪和患者的血清识别&#65377;【结论】 亚洲牛带绦虫成虫钙调神经磷酸酶B基因可在原核表达系统中获得具有免疫学活性的表达&#65377;为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础&#65377;     

探究3C蛋白酶切割p51在B组柯萨奇病毒致病毒性心肌炎中的作用

【立题依据】 B组柯萨奇病毒(CVB)是病毒性心肌炎的主要病原体,可引发扩张型心肌病,尚无治疗药物。CVB的3C蛋白酶切割前体蛋白形成结构蛋白,完成病毒复制,也通过切割宿主蛋白发挥致病作用。我们发现宿主细胞中一个长约51kDa的蛋白质(其功能尚不清楚,暂称为p51)有3C蛋白酶的特异性酶切位点,推测p51是CVB的作用靶点之一,3C蛋白酶切割p51可能是CVB致病的新机制。 【设计思路】 通过蛋白质过表达和沉默等分子生物学技术,在细胞和动物实验中证实CVB 3C蛋白酶可以切割p51,并通过通过切割p51发挥致病作用。 【实验内容】 本实验设计通过以下4方面研究CVB通过其3C蛋白酶切割p51致病的作用机制:(1)构建真核表达载体质粒pEGFP-p51;(2)细胞实验确定3C蛋白酶通过特异性位点切割p51;(3)细胞实验确定CVB通过3C蛋白酶切割p51发挥致病作用;(4)动物实验确定3C蛋白酶可以切割p51并在CVB致病毒性心肌炎中发挥作用。 【材料】 HeLa细胞;Balb/c小鼠;CVB3,嗜心肌CVB3 H3株;质粒:pEGFP-C1,pEGFP-2A,pEGFP-3C;干扰RNA:通过商业渠道购买。 【可行性】 本实验设计有充分依据表明p51有CVB 3C蛋白酶的酶切位点,CVB可能通过3C蛋白酶切割p51发挥致病作用,从而导致病毒性心肌炎和扩张型心肌病。 【创新性】 通过本实验,我们可能揭示CVB致病的新机制,能够更加全面地了解CVB致病毒性心肌炎的分子机制,为研发抗CVB药物提供新靶点,为临床治疗提供新方向,有广泛的应用前景。     

TNF-α/HIF-1α/VASP途径在肺癌A549细胞增殖和粘附中的作用研究

【目的】 肺癌是目前世界癌症导致死亡排名第一的肿瘤,其中肿瘤细胞的增殖和转移与肺癌的死亡率密切相关。最近的调查显示肿瘤坏死因子-α(TNF-α)与肿瘤的侵袭和转移相关,但是具体的机制仍不清楚。本实验旨在以肺癌A549细胞作为模型,研究TNF-α/HIF-1α/VASP途径在肺癌A549细胞的增殖和粘附中的作用。 【方法】 常规培养A549细胞,用MTT法和adhesion assay分别检测不同浓度的TNF-α对A549细胞增殖和粘附的影响。在随后的实验中采用高浓度的TNF-α刺激(120 ng/mL)作为刺激因素,分别用sh-RNA和pEGFP-C1-VASP敲除或过表达VASP、用siRNA和pEGFP-C1敲除或过表达HIF-1α,MTT法和adhesion assay分别检测细胞增殖和粘附水平,PCR检测HIF-1α和VASP在mRNA表达水平,蛋白质印迹法检测HIF-1α和VASP蛋白的表达。同时采用Luciferase assay 的方法检测HIF-1α与VASP启动子区域结合的状态。 【结果】 (1)高剂量TNF-α可以促进HIF-1α表达,从而下调VASP表达水平,抑制肺癌A549细胞增殖和粘附。(2)与空载质粒pEGFP-C1组相比,瞬时转染VASP过表达质粒pEGFP-C1-VASP后,A549细胞的增殖能力显著增加(P<0.05),粘附能力显著增加(P<0.05)。相反,与Scrambled-shRNA组比较,通过转染VASP shRNA特异性敲降VASP后,A549细胞的增殖能力显著降低(P<0.05),粘附能力显著降低(P<0.05)。(3)选择高浓度TNF-α(120 ng/mL)处理A549细胞24小时后,与空载质粒pEGFP-C1组相比,瞬时转染HIF-1α过表达质粒pEGFP-C1-HIF后,HIF-1α的表达在mRNA 和蛋白水平都显著增加(P<0.05),与此同时VASP的表达在mRNA和蛋白的水平显著降低(P<0.05)。相反,与Scrambled-siRNA组比较,通过转染HIF siRNA特异性敲降HIF-1α后, HIF-1α的表达在mRNA 和蛋白水平都显著降低(P<0.05),与此同时VASP的表达在mRNA和蛋白的水平显著增高(P<0.05)。(4)在给予肿瘤坏死因子-α诱导的细胞中,通过转染HIF siRNA特异性敲降HIF-1α表达后,TNF-α带来的HIF-1α的升高被部分抵消了(P<0.05)。(5)Luciferase assay 的检测结果提示HIF-1α可以与VASP启动子区域结合从而在转录水平上抑制VASP的表达。 【结论】 高浓度TNF-α通过增加HIF-1α的表达,调控并抑制VASP蛋白的表达,从而降低肺癌A549细胞增殖和粘附,从而发挥抗肿瘤的作用。     

基于干细胞趋化特性的微流控芯片富集分选少突前体细胞的实验研究

【立论依据】 微流控芯片(microfluidic chip)是将微通道、微泵、微储液池集成一体,通过气液压等操纵细胞运动的实验室芯片,近年在细胞分选与免疫分析等方面显示出具有高灵敏度、设备微型化等优势。目前体外快速分离获取高纯度高活性的少突胶质前体细胞(OPCs)一直是难题。基质细胞衍生因子1(SDF-1)及其受体已证实广泛分布在多种干细胞中,高表达SDF-1对神经干细胞(NSC)具有显著的趋化吸引效应,是驱动NSC迁移的一类关键因子。先前对NSC分化研究提示,钙敏感受体(CaSR,与甲状旁腺素(PTH)特异亲和)在OPCs中表达量远大于神经元和星形胶质细胞,过表达CaSR的NSCs分化为少突胶质细胞的比例增加;CaSR敲除小鼠表现出严重的白质发育障碍。提示CaSR在NSC定向少突胶质细胞分化中扮演重要作用。 【设计思路】 本研究利用SDF-1对NSC趋化吸引的动力效应结合OPCs与PTH高特异亲和性,构建含高浓度SDF-1和PTH的半透膜流动腔和对应收集池的微流控芯片。近膜区可富集OPCs并进而收集分选出高纯度OPCs。 【实验内容】 (1)采用胚胎或新生大鼠脑组织制备细胞悬液。(2)以聚二甲基硅氧烷(PDMS)为微流控芯片基础材料,设计含半透膜分隔的两套管道系统及对应收集池。一侧灌注SDF-1和PTH液,一侧为受微压力驱动的混合细胞悬液通过池,依据SDF-1和PTH在半透膜区域形成的趋化动力,使具有干细胞特性又高表达CaSR的OPCs逐步靠近半透膜流动,通过独立出样口收集细胞。(3)细胞活性与纯度鉴定。通过Transwell细胞迁移分析细胞活性功能;将分选细胞、以及分选细胞加入OPCs分化液培养0、1、3 d后细胞进行免疫染色鉴定类型。 【材料】 实验动物、微流控芯片板、SDF-1、PTH、神经细胞各表型鉴定用抗体。 【可行性】 微流控芯片初样已设计成型,细胞培养预实验已有效可行。 【创新性】 利用高表达CaSR的OPCs对SDF-1和PTH具有趋化性特征,设计独特的微流控芯片集合板,在微压力驱动下实现对OPCs有效快速的招募富集与分选。理论上保持了分选细胞活性与功能属性。本研究为微流控芯片在生物医学中应用即高效快速纯化OPCs开拓了新思路,为OPCs功能的深入研究提供实验依据。     

人血管内皮生长因子165慢病毒载体的构建及其抗放射所致细胞凋亡的作用

 【目的】 构建人血管内皮生长因子165(hVEGF165)慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFPhVEGF165,并转染至HT22 细胞,并进一步观察其对放射线损伤所致的细胞凋亡的保护作用。【方法】 PCR扩增hVEGF165基因,克隆到pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP载体;通过酶切电泳,菌落PCR初步筛选和测序鉴定构建的pCDH-CMV-MCS-EF-GFP1-hVEGF165重组载体;采用磷酸钙共转染法转染293T细胞包装制备慢病毒液,并感染HT22细胞,采用实时RT-PCR及Western Blot检测hVEGF165基因在HT22细胞中的表达情况。进一步对单纯HT22细胞、空质粒转染组以及hVEGF165转染组HT22细胞进行0、5、10 Gy的X线照射,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。【结果】 hVEGF165基因片段重组到pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP载体,酶切后电泳结果显示均能得到与理论大小相符的片段,测序结果与GenBank序列完全一致,转染HT22后hVEGF mRNA及蛋白表达水平明显增高。而且同各对照组相比,hVEGF165可以降低细胞放疗后的凋亡率。【结论】 pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-hVEGF165 慢病毒表达载体构建成功,其转染HT22细胞后可获得高水平hVEGF165 mRNA和蛋白的表达,hVEGF165具有抗放射所致细胞凋亡的作用。     

LDL诱导RAW264.7细胞前后与神经节苷脂结合的蛋白质向脂质筏的转位

【立论依据】 氧化修饰的低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein, Ox-LDL)在促进动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)的发生和发展中起着关键性的作用。广泛存在于食品中的反式脂肪酸,能促进LDL的氧化修饰最终导致AS,有实验提示,反式脂肪酸是通过细胞膜上的脂质筏引起后续导致AS的各种反应,因此抗氧化治疗的维生素E等药物不能有效地阻止AS的发生。目前阻止体内LDL被氧化成为治疗AS的焦点,于是探究氧化LDL的分子机制变得至关重要。神经节苷脂(ganglioside,GM1)作为脂质筏的标志分子,已有研究显示其与LDL的氧化及分布密切相关,而其与LDL氧化的识别机制以及氧化环境的建立尚有待研究。 【设计思路】 本项目通过分析LDL诱导RAW264.7细胞前后,与神经节苷脂GM1特异结合的蛋白质向脂质筏的转位,从而找出介导LDL在微环境中进行氧化修饰的相关蛋白质因子。 【实验内容】 (1)细胞诱导和脂质筏分离:实验组,巨噬细胞RAW264.7与LDL共培养15 min;对照组,无LDL刺激;密度梯度离心分离脂质筏,非标记定量蛋白质组学鉴定产生的氧化应激相关蛋白。(2)细胞蛋白—GM1共沉淀:①收集巨噬细胞RAW264.7蛋白;②脂质体制备:实验组,制备原料加有GM1;对照组:原料不含GM1;③蛋白质-GM1结合:将收集的蛋白和制备的脂质体孵育结合,收集产物;④通过SDS-PAGE,质谱分析等找出与GM1特异结合的蛋白质分子。(3)蛋白质印迹法验证分析:分析步骤1和步骤2得到的共有蛋白,分别与LDL刺激细胞后分离的脂质筏成分以及与GM1特异结合的蛋白质进行蛋白质印迹法验证。 【材料】 RAW264.7细胞(武汉大学基础医学院);LDL( Pro Spec-Tany公司 );GM1(Sigma公司)。 【可行性】 预实验初步证实了LDL的氧化与脂质筏的形成有关;而且细胞膜“脂质筏”结构的主要组成成分糖鞘脂之一GM1参与了LDL的氧化,激光共聚焦显示GM1与LDL在RAW264.7细胞上的分布密切相关。 【创新性】 该项目首次证实了LDL与氧化微环境-脂质筏的形成有关,并寻找介导氧化的相关分子,从而进一步确认LDL氧化的具体机制。     

在小鼠肝纤维化中β-catenin信号转导途径是否介导瘦素抑制SREBP-1c的表达

【立论依据】 肥胖易发肝纤维化并且大多数肥胖病人会有高瘦素血症。脂肪因子瘦素在肝纤维化的发生中发挥着独一无二的作用。在肝纤维化的发生中肝星状细胞(HSCs)的激活是一个关键的步骤而且固醇调节元件结合蛋白(SREBP-1c)能够抑制HSCs的激活。在已有的研究中,Leptin可以抑制SREBP-1c的表达而导致肝纤维化,β-catenin途径可以调节跟脂肪细胞分化有关的基因转录调节因子的表达,因此我们旨在认清β-catenin途径能否介导在小鼠肝纤维化中瘦素抑制SREBP-1c表达的作用。 【设计思路】 确认Leptin与β-catenin信号通路的关系;研究β-catenin是否介导Leptin诱导SREBP-1c表达的降低;β-catenin信号通路对SREBP-1c表达的影响。 【实验内容】 小鼠肝纤维化模型制备、HSCs分离与培养、蛋白质印迹分析、mRNA分离和real-timePCR检测、质粒的制备和质粒转染检测分析、各蛋白表达的免疫组化及免疫荧光分析、肝纤维化组织检测、抑制剂的使用、荧光素酶的检测。 【材料】 Leptin,MaleC57BL/6Job/obmice,Ad.DKK-1,Ad.Fc,HSCs,SREBP-1c,primers,plasmid pSREBP1c-Luc,Plasmid pdncatenin,plasmid pwtcatenin,plasmid Plxre-luc,normal serum。 【可行性】 肝纤维化与HSCs的激活密不可分,而HSCs的激活是和瘦素水平的上调以及连续的SREBP-1c表达的下调联系在一起的;相关实验表明β-catenin信号转导途径可以调节脂肪细胞的增殖与分化也参与了胆管结扎导致的肝纤维化,所以就很有必要去研究肝纤维化中Leptin、β-catenin以及SREBP-1c三者之间的关系。 【创新性】 确定β-catenin信号传导通路在Leptin诱导肝纤维化中的作用,以及β-catenin信号通路对SREBP-1c表达的影响,可为以瘦素作为靶点治疗肝纤维化提供新的见解。