利什曼原虫无鞭毛体蛋白的基因克隆化与序列分析

目的 克隆4株利什曼原虫表面无鞭毛体蛋白（amastin）的编码基因,并进行序列分析。方法 根据锥虫（T.cruzi)与利什曼原虫亲缘关系相近的原则,首先以锥虫无鞭毛体蛋白的基因为参考。对GenBank中的dbFST数据库检索,获得硕大利什曼原虫（L.major)一段309核苷酸片段,根据其序列合成探针,对硕大利什曼原虫基因组DNA文库筛选,首先获得硕大利什曼原虫无鞭毛体蛋白编码基因,再以硕大利什曼原虫无鞭 毛体蛋白编码 基因序列为依据,合成特异性引物,以多聚酶链反应（PCR）扩增获得亚马逊利会曼原虫（L.ama.)、巴西利什曼原虫（L.bra.)和墨西哥利什曼原虫（L.mex.)的无鞭毛体蛋白基因。结果 克隆了4株利什曼原虫无鞭毛体蛋白编码的基因。均为国际上首次克隆化基因,已被美国GenBank收录。结论 实现了4株利什曼原虫无鞭毛体 蛋白编码基因的克隆化。     

亚马逊利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因的克隆化与序列分析

目的：克隆亚马逊利什曼原虫（L.ama)无鞭毛蛋白（amastin)的编码基因,并对其同源基因序列进行分析,方法：根据我们首次克隆的硕大利什曼原虫（L.major)无鞭毛体蛋白的编码基因,设计并合成核苷酸序列特异性引物,以亚马逊利什曼原虫基因组DNA为模板,以多聚酶链反应PCR技术扩增无鞭毛体的编码基因DNA片段,并进行核苷酸 列测定以及核苷酸序列的同源性分析。结果：克隆了亚马逊利什曼原虫无鞭毛体蛋白的编码基因,含有单一开放读框,长度为552bp,编码的无鞭毛体蛋白由183个氨基酸残基（aa)组成,亚马逊利什曼原虫与硕大利什曼原虫无鞭毛体蛋白编码基因之间高度同源,在核苷酸与氨基酸残基序列水平上的同源性分别为96％和94％,结论：首次实现亚马逊利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因的克隆化。     

墨西哥利什曼原虫无鞭毛体蛋囟的基因克隆化与序列分析

目的　克隆墨西哥利什曼原虫(L.mer)WR972株的无鞭毛体蛋白(amastin)的编码基因,并对其同源核苷酸序列进行分析。方法　根据已克隆的亚马逊利什曼原虫无鞭毛体蛋白的编码基因序列,设计并合成无鞭毛体蛋白基因特异性引物,以墨西哥利什曼原虫VR972株的基因组DNA作为模板,进行多聚酶链反应(PCR)扩增。将扩增的DNA片段克隆到pCR2.1T载体中,进行测序,并对同源的核苷酸序列分析、比较。结果　从体外培养的墨西哥利什曼原虫WR972株提取基因组DNA,以无鞭毛体蛋白基因特异性引物进行PCR扩增获得550bp的DNA片段。克隆到pCR2.1T载体片段进行的序列测定结果　表明,获得了墨西哥利什曼原虫的无鞭毛体蛋白编码基因片段,与亚马逊利什曼原虫的无鞭毛体蛋白基因之间具有高度的同源性。结论　实现了墨西哥利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因的克隆化,为进一步研究其表达及作为疫苗研究的候选基因奠定了基础。     

墨西哥利什曼原虫无鞭毛体蛋白的基因克隆化与序列分析

目的 克隆墨西哥利什曼原虫（Ｌ．ｍｅｘ）ＷＲ９７２株的无鞭毛体蛋白（ａｍａｓｔｉｎ）的编码基因,并对其同源核苷酸序列进行分析。方法 根据已克隆的亚马逊利什曼原虫无鞭毛体蛋白的编码基因序列,设计并合成成无鞭毛体蛋白基因特异性引物,以墨西哥利什曼原虫ＷＲ９７２株的基因组ＤＮＡ作为模板,进行多聚酶链反应（ＰＣＲ）扩增。将扩增的ＤＮＡ片段克隆到ｐＣＲ２．１Ｔ载体中,进行测序,并对同源的核苷酸序列分析、比较     

杜氏利什曼原虫激活蛋白激酶C受体的基因克隆化与序列分析

目的　克隆杜氏利什曼原虫 (LeishmaniadonovaniLd) 1S株激活蛋白激酶C受体 (RACK ,receptorofactivatedpro teinCkinase)的编码基因 ,为应用这种编码T细胞抗原的基因进行基因疫苗的研究奠定基础。方法　体外培养杜氏利什曼原虫 1S株无鞭毛体 ,常规方法提取制备基因组DNA。以硕大利什曼原虫 (Leishmaniaamjor)的RACK基因的核苷酸序列为参照 ,设计并合成利什曼原虫RACK基因序列特异性的引物。以杜氏利什曼原虫的基因组DNA为模板 ,利用多聚酶链反应(PCR)技术 ,扩增获得了杜氏利什曼原虫RACK的全长编码基因。结果　基因序列测定结果表明 ,杜氏利什曼原虫 1S株RACK基因序列长度为 981bp ,开放读码框架由 831bp组成 ,编码产物为 2 76个氨基酸残基。获得的杜氏利什曼原虫 1S株的RACK基因与来源于硕大利什曼原虫的RACK基因序列同源性达 98% (2 6 4 / 2 6 7)。结论　本研究克隆了杜氏利什曼原虫的RACK基因 ,为应用诱导T细胞免疫应答抗原的编码基因进行杜氏利什曼原虫的基因疫苗研究奠定了基础     

杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因真核表达重组质粒构建

目的 构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白（amastin）编码基因的真核表达重组质粒pcDNA3.1-amastin。方法 提取杜氏利什曼原虫基因组DNA进行PCR扩增,将扩增出的无鞭毛体蛋白基因片段导入质粒载体pcDNA3.1（＋）,构建真核表达重组质粒pcDNA3.1-amastin。结果 扩增出大小约550bp的无鞭毛体蛋白基因;重组质粒pcDNA3.1-amastin经鉴定正确。结论 成功构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因真核表达重组质粒pcDNA3.1-amastin。     

杜氏利什曼原虫23kDa抗原编码基因克隆的表达

将已建立的杜氏利什曼原虫 c DNA文库基因 ,亚克隆于 p UC18质粒载体 ,诱导表达筛选两个克隆 ,即 P1、P2 ,表达的蛋白分子量皆为 2 3k Da,P1克隆表达的 2 3k Da蛋白分子 ,经 Western blot分析显示 ,可被兔抗杜氏利什曼原虫前鞭毛体抗血清及内脏利什曼病病人血清识别     

墨西哥利什曼原虫环形DNA1含有编码核苷酸结合蛋白基因

目的　对扩增的墨西哥利什曼原虫环形 DNA1(CD1)部分片段进行测序 ,确定具有蛋白编码功能的开放阅读框。　方法　通过脉冲电泳方法分离并使用琼脂糖酶方法回收 CD1,酶切的 CD1片段克隆于 p Zero载体 ,用 M13通用引物自动测序决定核苷酸序列 ,用 GCG- PCGENE程序分析序列。　结果　测出 4385个核苷酸序列 ,通过分析发现两个开放阅读框具有蛋白质编码功能 (编码核苷酸结合蛋白 )。　结论　墨西哥利什曼原虫 CD1遗传成分含有两个编码核苷酸结合蛋白基因     

杜氏利什曼原虫蛋白磷酸酶-2C的基因克隆化与序列分析

目的　克隆杜氏利什曼原虫 (Leishmaniadonovani,Ld) 1S株蛋白磷酸酶 2C(PP2C)的编码基因 ,为应用这种编码T细胞抗原的基因进行基因疫苗研究奠定基础。方法　体外培养杜氏利什曼原虫 1S株无鞭毛体 ,常规方法从虫体提取制备基因组DNA。以夏科氏利什曼原虫 (Leishmaniachagasi,Lc)的PP2C基因序列为参照 ,设计并合成利什曼原虫PP2C基因序列特异性的引物。结果　以杜氏利什曼原虫的基因组为模板 ,利用多聚酶链反应 (PCR)技术 ,扩增获得了杜氏利什曼原虫PP2C的全长编码基因。基因序列测定结果表明 ,杜氏利什曼原虫 1S株PP2C基因序列长度为 1317bp ,开放读码框架由 12 2 1bp组成 ,编码产物为 40 6个氨基酸残基。获得的杜氏利什曼原虫 1S株的PP2C基因与来源于夏科氏利什曼原虫的PP2C氨基酸残基序列的同源性为 95 % (387/ 40 6 )。结论　本研究克隆了杜氏利什曼原虫的PP2C基因 ,为应用诱导T细胞免疫应答抗原的编码基因进行杜氏利什曼原虫的基因疫苗研究奠定了基础     

杜氏利什曼原虫蛋白鳞酸酶—2C的基因克隆化与序列分析

目的 克隆杜氏利什曼原虫（Leishmania donovani,Ld)1S株蛋白磷酸酶2C（PP2C）的编码基因，为应用这种编码T细胞抗原的基因进行基因疫苗研究奠定基础。方法 体外培养杜氏利什曼原虫1S株无鞭毛体，常规方法从虫体提取制备基因组DNA。以夏科氏利什曼原虫（Leishmania chagasi,Lc)的PP2C基因序列为参照，设计并合成利什曼原虫PP2C基因序列特异性的引物。结果 以杜氏利什曼原虫的基因组为模板，利用多聚酶链反应（PCR）技术，扩增获得了杜氏利什曼原虫PP2C的全长编码基因。基因序列测定结果表明，杜氏利什曼原虫1S株PP2C基因序列长度为1317bp，开放读码框架由1221bp组成，编码产物为406个氨基酸残基。获得的杜氏利什曼原虫1S株的PP2C基因与来源于夏科氏利什曼原虫的PP2C氨基酸残基序列的同源性为95％（387／406）。结论 本研究克隆了杜氏利什曼虫的PP2C基因，为应用诱导T细胞免疫应答抗原的编码基因进行杜氏利什曼虫的基因疫苗研究奠定了基础。     

日本血吸虫亲环素A和乳酸脱氢酶编码基因的克隆及序列分析

目的　识别和克隆日本血吸虫新基因。方法　对本实验室获得的EST进行同源性分析 ,识别血吸虫新基因 ;根据EST设计引物 ,用锚着PCR法从cDNA文库中扩增出新基因全长cDNA ,并将其克隆入原核表达载体 pGEX - 4T - 1,用生物信息学技术对获得的编码基因进行结构与功能的分析。结果　EST同源性分析得到一个完整编码基因 ,开放阅读框(ORF) 4 95bp ,编码 16 4个氨基酸 ;锚着PCR法获得另一EST的 3’端所缺序列 ,得到完整编码阅读框 ,其ORF 999bp ,编码 332个氨基酸。利用生物信息学技术确定它们分别为日本血吸虫亲环素A(CyPA)和乳酸脱氢酶 (LDH)的编码基因。重组质粒经双酶切及测序鉴定证明日本血吸虫CyPA和LDH原核表达质粒构建成功。 结论　克隆到日本血吸虫亲环素A和乳酸脱氢酶编码基因的全长cDNA ,为进一步的功能研究打下了基础     

杜氏利什曼原虫四川分离株无鞭毛体蛋白基因的克隆及真核表达

目的克隆、真核表达杜氏利什曼原虫四川株的无鞭毛体蛋白(amastin)编码基因。方法PCR扩增杜氏利什曼原虫四川汶川人株L．d．SC10H2与四川南坪犬株L．d．SC7的无鞭毛体蛋白基因,将该基因导入pcDNA3．1( ),构建真核表达重组质牲,转染NIH3T3细胞,采用免疫荧光法鉴定重组质粒的瞬时表达;RT-PCR和Western blotting鉴定稳定表达,结果2株杜氏利什曼原虫均扩增出552 bp的无鞭毛体蛋白基因。同源性为86％。转染后在NIH3T3细胞膜和细胞内观察到较强的绿色荧光,表明无鞭毛体蛋白基因在NIH3T3细胞中获得短暂表达。细胞裂解产物经Western blotting,在相对分子质量(Mr)约20000处检测到阳性杂交信号,表明无鞭毛体蛋白基因在NIH3T3细胞内获得了稳定表达。结论获得了我国杜氏利什曼原虫四川分离株L．d．SC10H2和L．d．SC7的无鞭毛体蛋白基因序列,并在NIH3T3细胞中稳定表达。     

原因不明性肝炎血清蛋白结合蛋白的筛选和鉴定

目的应用噬菌体表面展示技术寻找原因不明性肝炎血清蛋白成分在肝细胞表面的结合蛋白,探讨原因不明性肝炎发病机制。方法将原因不明性肝炎患者血清蛋白作为固相筛选分子,对噬菌体正常人肝细胞T7 cDNA文库进行4轮生物筛选,经噬斑PCR测序,获得原因不明性肝炎血清蛋白结合蛋白的cDNA序列,将其在GenBank中搜索,比对可能与原因不明性肝炎血清蛋白相结合的蛋白。结果筛选出已有功能研究的蛋白9个和未知功能蛋白3个。结论发现了12种可能与原因不明性肝炎血清蛋白结合的肝细胞表面蛋白,为进一步研究原因不明性肝炎的发病机制提供基础。