EV71临床毒株分离及其VP1单克隆抗体制备

目的 对手足口病肠道病毒71型 (EV71) 流行临床株进行分型和鉴定,制备抗EV71外壳蛋白VP1的特异性单克隆抗体,为EV71生物学特征研究和疫苗株的筛选奠定基础。方法 从患者咽拭子中分离出流行的EV71毒株,原核表达纯化该毒株EV71 VP1衣壳蛋白,以此蛋白为免疫原制备VP1的特异性小鼠单克隆抗体,采用免疫荧光法（ELISA）观察抗体能否特异性识别EV71感染的细胞。结果 测序结果显示分离出的EV71病毒株为肠道病毒C4亚型。筛查出12株分泌针对VP1蛋白的抗体杂交瘤细胞株,将其中结合特异性和结合力最强的一株命名为11T12。复苏的11T12活化后接种于液体石蜡免疫的小鼠腹腔,收集腹水经过protein-G柱纯化后对抗体的效价进行ELISA评价,结果显示纯化抗体稀释10万倍后仍可以结合蛋白,证实成功制备了抗EV71 C4亚型外壳蛋白VP1单克隆抗体。抗体结合特征分析结果显示该抗体具有特异性识别能力。结论 从感染的临床样本中分离到一株C4型EV71毒株,以该病毒VP1蛋白为免疫原获得一株相应的单克隆抗体11T12,该单克隆抗体的获得为病毒的检测、试剂盒的研发提供了核心材料。     

1株肠道病毒71型毒株的分离与鉴定

目的 探讨手足口病病原体肠道病毒71型(EV71)的分离与鉴定方法。方法 采集手足口病疑似病例的咽拭子标本1份接种于人横纹肌肉瘤细胞(rhabdomyosarcoma cell, RD细胞),通过观察病毒的细胞病变效应(cytopathic effect, CPE)来分析EV71的分离效果。分别利用荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)及免疫印迹分析(Western Blotting)方法来鉴定EV71病毒特异性核酸和蛋白。扩增EV71VP1区全长基因,对其序列进行同源性比较及遗传进化分析。结果 手足口病疑似病例咽拭子标本接种RD细胞传代至第2代后出现CPE。RT-PCR和Western Blotting检测结果均显示,感染组RD细胞中有EV71病毒特异性条带,暂命名为EV71分离株2016SHYP001。序列分析结果显示,2016SHYP001株病毒的VP1区核苷酸与C型代表株的同源性较高,为93.1%~98.3%;其中与C4a亚型代表株的同源性最高,为98.3%。进化树分析发现本地流行株与深圳地区流行株的亲缘较近。结论 成功分离出一株新的EV71病毒株2016SHYP001,其株型为C4a亚型。     

六安地区手足口病患儿肠道病毒分离鉴定与临床表现

目的 对六安地区手足口病流行区患儿标本进行病毒分离与鉴定,为进一步预防和控制该病流行奠定基础.方法 采集手足口病患者咽拭子和疱疹液标本,进行病毒分离、中和实验和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)特异性扩增进行鉴定,同时对肠道病毒71型(EV71)抗原决定簇部位VP1区进行核苷酸序列测定与分析.结果 14份咽拭子和8份疱疹液标本中分离得到6株病毒,经中和实验、RTPCR及VP1片段检测与测序证实为EV71型,与BrCr-ts株、台湾分离株、深圳分离株一致性分别为98%、84%和83%.结论 该流行区2008年爆发的手足口病病原体为EV71型.     

肠道病毒71型VP1蛋白单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的:制备肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)VP1外壳蛋白单克隆抗体。方法:利用重组纯化的EV71-VP1蛋白为抗原免疫BALB/c鼠,按常规杂交瘤技术进行细胞融合,对阳性杂交瘤细胞进行筛选及亚克隆,获得1株能稳定分泌抗EV71-VP1抗体的杂交瘤细胞株6F2B9,细胞体外扩大培养后的上清用Protein G柱纯化,超滤后用BCA法测其浓度,用免疫球蛋白亚类鉴定试剂盒鉴定单克隆抗体亚型,间接ELISA方法检测其效价和特异性,间接免疫荧光法检测其与EV71病毒的特异性结合能力。结果:本研究得到的抗EV71-VP1抗体DSE-136,纯化后浓度为1.9 g/L,免疫球蛋白亚类为IgG2b,轻链属于κ链;间接ELISA检测效价为1∶3.2×105;间接免疫荧光结果显示其可与EV71病毒特异性结合。结论:成功制备出1个效价高、特异性好的抗EV71-VP1单克隆抗体DSE-136,为VP1抗原诊断、疫苗研发及其效果评价奠定了基础。     

重庆地区2009年手足口病病原分离鉴定及病毒基因组特征

目的 对2009年重庆市手足口病(hand-foot-mouth disease, HFMD)患儿粪便标本的病原进行分离鉴定及全基因组序列测定,并同相关毒株序列进行同源性比对和进化分析,以了解新分离病毒基因组序列特征及可能的传播来源.方法 将47例手足口病患儿临床标本接种人横纹肌肉瘤细胞(human rhabdomyosarcoma,RD)进行分离培养,采用EV、EV71、Cox A16特异性引物对出现细胞病变的细胞上清进行PCR鉴定,同时电镜观察病毒颗粒形态,将鉴定的病毒基因组分为4个片段进行RT-PCR扩增,扩增产物纯化后进行PCR测序.通过末端重叠序列拼接成全长病毒基因组序列,利用生物信息学软件对序列进行比对分析,绘制进化树.结果 在47例HFMD患儿临床标本接种RD细胞培养中,有7份观察到明显的细胞病变,通过RT-PCR检测有3份呈EV特异性引物及EV71特异性引物阳性,而所有标本Cox A16特异性引物检测为阴性,EV71特异性引物的PCR产物测序结果证实为EV71病毒,同时用电镜观察形态病毒感染的RD细胞,为圆形无包膜病毒颗粒,证实所分离病毒为EV71.测序获得的3株EV71病毒基因组全长分别为7 409、7 406 nt和7 404 nt,其VP1氨基酸序列同源性达99%以上.Blast分析表明重庆毒株Chongqing-2-09-China(GQ994990.1)、Chongqing-3-09-China (GQ994991.1)均与安徽阜阳2008年分离的3株EV71毒株同源性较高,重庆毒株Chongqing1-09-China (GQ994989.1)与2005年台湾分离984 polyprotein、1235 polyprotein序列毒株同源性最高,进化分析表明属于C4基因亚型.结论 新分离的重庆EV71毒株基因组序列符合肠道病毒特征,与国内2008年安徽阜阳及台湾2005年分离的EV71病毒可能具有相同来源.     

2009年重庆地区手足口病病毒分离鉴定

目的:对2009年2～4月重庆地区流行的手足口病(Hand-food-and-mouth disease,HFMD)病原进行分离鉴定,以调查本地区HFMD流行病原学情况.方法:采集47例手足口患儿脑脊液、疱疹液、粪便、咽拭子、肛拭子共100份标本,分别接种于人横纹肌肉瘤细胞(Human rhabdomyosarcoma,RD)中进行病毒分离培养,对出现细胞病变(Cytopathic effect,CPE)的细胞上清,分别用肠道病毒通用引物、EV71属特异性引物和柯萨奇A16属特异性引物进行RT-PCR检测,并对PCR产物进行回收克隆测序鉴定,以确定本次疫情中肠道病毒(Enteroviruses,EV)的病原,将测序结果用生物学软件Bioedit同国际代表BrCr株进行序列比对及同源性相关分析,以鉴定此毒株遗传变异情况.结果:在处理后的100份HFMD患儿临床标本的细胞培养中,有7份观察到明显的细胞病变,通过RT-PCR检测有7份呈肠道通用引物阳性,EV71特异性引物检测有3份呈阳性结果,而CAl6特异性引物检测结果均为阴性,这3份EV71阳性临床标本来自2例门诊患儿和1例临床诊断疑似病例患儿,其PCR产物测序结果也证实为EV71病毒.结论:重庆地区2～4月发生的HFMD疫情主要是由EV71型引起的.     

惠州市重症手足口病病原谱及EV71型VP1区基因特征分析

目的分析惠州市手足口病重症病例的病原谱构成,了解惠州市肠道病毒71型分离株的VP1区基因特征,为科学防治手足口病提供科学依据。方法采集300例重症手足口病(HFMD)患者标本,采用实时荧光RT-PCR检测肠道病毒核酸,并对肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A16型(CoxA16)进行分型检测;选择8株EV71分离株进行VP1区基因全长序列测定,测序结果利用DNASTAR软件进行核苷酸、氨基酸序列分析和同源性比较,并用Mega5.0软件构建亲缘性进化树。结果通过实时荧光RT-PCR特异性检测,EV71阳性结果 154份,阳性率为51.33%;CoxA16阳性结果 38份,阳性率为12.67%。测序结果表明,8株EV71之间的VP1基因核苷酸同源性为96.9%~99.2%,氨基酸同源性为99.3%~100%。VP1区基因遗传进化分析表明,8株EV71分离株与C4基因亚型的代表株处于同一分支,均属于C4基因亚型的C4a进化分支。结论惠州市手足口病疫情主要病原EV71病毒均属于C4a基因亚型,与2004年以来的中国大陆EV71病毒流行的基因型一致,未产生明显的抗原漂移及变异。     

实时荧光PCR法和病毒分离培养法在手足口病病毒检测中的应用分析

目的 筛选快速准确的检测方法,为手足口病监测与防控工作提供及时可靠的病原学依据。方法 采用病毒分离培养法和实时荧光PCR检测法对2014年牡丹江市手足口病监测哨点医院采集的手足口样病例标本进行检测,比较检测结果。结果 2014年采集的206份标本中,实时荧光PCR法检测肠道病毒EV 71型42例、Cox A16型9例、肠道病毒通用型37例,阴性118例。病毒分离培养法检测肠道病毒EV 71型4例、Cox A16型4例、肠道病毒通用型6例。实时荧光PCR法、病毒分离培养法检测阳性率分别为42.72%和6.80%;与实时荧光PCR法相比,病毒分离培养法灵敏度、特异度分别为15.91%、100.00%。结论 实时荧光PCR法比病毒分离培养法更灵敏快捷、特异性强、敏感度高等,适用于手足口病病原体的检测。     

深圳地区手足病肠道病毒5′端非编码区部分基因克隆和序列分析

目的：分析深圳地区手足口病病人肠道病毒（EV）5′端非编码区（5′UTR）部分基因序列，了解本地区手足口病病人EV感染的基因型。方法：设计特异性引物，建立检测EV的RT－PCR方法，对临床疑诊为EV感染的病人的粪便和／或咽拭子、脑脊液标本进行检测，并对5例典型手足口病病人中分离株的PCR阳性扩增产物进行克隆和序列测定。结果：分离出的5株EV5′UTR基因的核苷酸同源性为85.5%－99.3%，与EV71 BrCr原株、CVA9、CVA16和CVB同源性为86.3% -93.3%。结论：深圳地区手足口病EV5′UTR与几种常见的肠道病毒血清型同源性均较高，提示可能存在多种基因型的肠道病毒感染。     

双重实时荧光PCR在手足口病快速检测中的应用

目的 探讨双重实时荧光PCR 技术检测手足口病肠道病毒的应用效果.方法 用单一实时荧光PCR先检测标本中的肠道病毒通用病毒核酸,肠道病毒通用病毒核酸阳性再分别用双重实时荧光PCR及单一实时荧光PCR检测CoxA16型和EV71型特异性核酸,比较两种方法检测结果.结果 240份标本中肠道病毒通用型核酸阳性157份,双重实时荧光PCR法CoxA16阳性111份,EV71阳性1份,其他肠道病毒45份,单一实时荧光PCR法CoxA16阳性109份,EV71阳性1份,CoxA16+EV71阳性2份,其他肠道病毒45份.EV71和其他肠道病毒符合率为100%.结论 双重实时荧光PCR 检测技术可以准确检测手足口病肠道病毒,且特异性强、灵敏度高,又可以快速得到检测结果,是一种快速检测手足口病病毒的方法.     

新疆2011-2013年肠道病毒71型VP1区基因特征分析简

目的了解新疆肠道病毒71型（EV71）分离株VP1区基因特征。方法选取2011-2013年新疆部分地州手足口病病例标本,临床标本或其病毒培养物经实时荧光PCR鉴定后,通过RT—PCR法进行VP1区编码基因扩增,并对扩增产物进行序列测定,所得序列用ChromasPro1．7．4,BioEdit7．1．11和MEGA5．1软件进行序列校正、拼接、整理和分析,并与EV71各型及亚型参考序列构建基于VPl序列的系统进化树。结果新疆EV71分离株之间核苷酸和氨基酸序列同源性在92．8％～100．0％和97．9％～100．0％,22株病毒株与安徽阜阳和山东临沂C4a基因参考株最为相近,核苷酸和氨基酸序列序列同源性在93．9％～98．6％和98．6％～99．6％。而与A、B基因型参考株差异较大,核苷酸和氨基酸序列序列同源性在82．1％～84．8％和95．9％～98．3％。直接用临床标本进行核酸提取、扩增和序列测定的阳性率为30．0％,低于用病毒培养物的阳性率（100．0％）。结论2011—2013年新疆EV71分离株均为C4a基因型,与安徽和山东分离的EV71毒株可能有相同的起源。直接用临床标本进行核酸提取、扩增和序列测定可用于肠道病毒的分型鉴定。     

镇江地区肠道病毒71型VP1基因的检测及系统进化分析

目的检测我国镇江地区2008年手足口病(HFMD)散发病例中的肠道病毒71型(EV71),并进行毒株的种系进化分析。方法采集临床HFMD患者粪便标本,抽提病毒RNA,通过巢式聚合酶链反应技术进行特异性扩增。经琼脂糖凝胶电泳鉴定为阳性的标本,采用EV71特异性引物对其VP1区的核苷酸序列进行扩增。扩增的VP1片段经纯化后与测序载体PET32a(+)连接,转化大肠埃希菌DH5α,并对阳性质粒进行酶切和测序鉴定。利用Clustalx和MEGA4.0分析软件,进行系统进化分析。结果通过聚合酶链反应扩增获得EV71VP1基因,根据遗传进化分析发现该病毒株与1999、2000年在美国亚特兰大以及2000年中国北京地区流行的EV71型遗传距离较近,均属于C型。结论镇江地区HFMD患者中分离的EV71病毒株属C基因型。     

大连市肠道病毒71型基因特征分析

目的 了解大连市手足口病病原体肠道病毒71型(EV71)的VP1区段的基因特征.方法 用RT-PCR方法从手足口病患者临床标本中扩增EV71的VP1基因全序列,利用软件进行同源性分析和构建系统发生树.结果 测序获得的9株病毒基因与C4亚型代表株具有较高的核苷酸和氨基酸序列同源性.在系统进化树上,9株病毒基因与C4基因亚型代表株处于同一分支.结论 大连市EV71病毒株属C4亚型.     

EV71病毒对树鼩原代肾上皮细胞感染模型的建立

目的 建立EV71对树鼩原代肾细胞的感染模型。方法 胰蛋白酶消化法获得树鼩的原代肾细胞，用EV71感染树鼩肾细胞，测定1、2、4、6和8 d培养上清病毒滴度，分别用Western blot和间接免疫荧光法检测细胞中EV71病毒VP1蛋白的表达，以确定EV71病毒对树鼩原代肾细胞的感染性。结果 对分离得到的树鼩原代肾细胞进行传代纯化和形态鉴别，建立以树鼩原代肾细胞为主的细胞培养。用EV71病毒感染树鼩原代肾细胞，感染后48 ~ 96 h病毒滴度可达到1.3×10⁶ TCID₅₀/mL，说明EV71病毒可有效感染树鼩原代肾细胞并有效增殖。Western blot检测发现，EV71病毒VP1蛋白可在感染后2 ~ 8 d的树鼩原代肾细胞中有效检出，间接免疫荧光法则在感染后2 ~ 6 d细胞的细胞质中检测到病毒VP1蛋白的分布。结论 在成功建立树鼩原代肾细胞培养的基础上，确定了EV71病毒对树鼩原代肾细胞的感染性和病毒增殖特性，初步建立了EV71树鼩原代肾细胞感染模型。     

2010年天津市流行的肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组16型VPl区域序列分析

【目的】研究2010年天津市手足口病患者中肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组16型的VPl基因特征。【方法】采集60例天津地区2010年手足口病流行期间患儿的粪便标本,分别用EV71和CoxAl6的VPl区域引物对粪样中病毒RNA进行PCR检测。同时选取11株EV71扩增阳性和4株CoxAl6扩增阳性的样本,对其扩增产物的VPl区进行核苷酸序列测定,比照EV71和CoxAl6各基因型进行同源性分析,并构建系统发生树。【结果】从60例手足口病患儿粪便标本共检测出27例EV71阳性和4例CoxAl6阳性。经VPl区测序,11例EV71阳性与EV71C4基因型同源性94．4％～94．8％;4例CoxAl6阳性与CoxAl6C基因型同源性93．4％-94．7％。在系统发生树上,这11株EV71均属于EV71C基因型,与c4亚型属于同一分支;4株CoxAl6均属于CoxAl6的C基因型。【结论】2010年天津市手足口病患者粪便样本中检测出的EV71毒株属于EV71C4亚型,CoxAl6毒株属于CoxAl6C基因型。     

手足口病病毒分离方法研究

目的探讨影响手足口病病毒分离培养的可能因素以及方法的改进。方法取手足口病患儿的粪便、肛拭子或脑脊液、疱疹液、咽拭子,其中以粪便为主,经Hank’s平衡缓冲液（HBSS）重悬震荡后,离心取上清液接种于横纹肌肉瘤传代细胞（RD-A细胞）,二次传代后通过肠道病毒致细胞病变效应（CPE）分析及EV71、CA16及肠道病毒通用试剂盒进行荧光定量PCR的方法来鉴定病毒分离效果。结果 RD-A细胞能够有效的分离EV71、CA16和其他肠道病毒,采样时间在发病3日内,病毒分离效果达到66.7%,3日以上,病毒分离效果仅有29.1%。未添加万古霉素、阿米卡星和制菌霉素的病毒分离,污染率达到75%,分离效率为13.6%,添加三种抑制细菌和霉菌的抗生素后,污染率达到3.93%,分离效率达到54.9%。结论采样时间在发病3日内,有效的抑制细菌及霉菌的生长,合理的细胞接种密度可以明显提高病毒的分离培养效率。     

漳州市肠道病毒71型分离株的VP1区基因特征分析

目的了解漳州市肠道病毒71型分离株的VP1区基因特征。方法对2010年漳州市的5株肠道病毒71型分离株进行VP1区基因全长序列测定,测序结果利用DNASTAR软件进行核苷酸、氨基酸序列分析和同源性比较,并用Mega4．0软件构建系统发生树。结果5株肠道病毒71型分离株的VP1区核苷酸序列全长均为891bp,且与2008年安徽阜阳流行株Fuyang．Anhui．P．R．C-17．08-2的VP1区核苷酸序列同源性和氨基酸序列同源性最高,分别为98．2％-98．8％和99．7％-100．0％。5株肠道病毒71型分离株间的核苷酸序列同源性为97．2％-99．8％．氨基酸序列同源性为99．3％～100．0％。氨基酸在98位和218位这两个位点发生了特异性变异。VP1区基因遗传进化分析表明,漳州市所有分离株均属于C4基因亚型的C4a进化分支。结论5株肠道病毒71型分离株均属于C4基因亚型的C4a进化分支．与2004年以来的中国大陆EV71病毒流行的基因型完全-致。     

抗肠道病毒71型外壳蛋白1卵黄抗体的制备和鉴定

目的 克隆肠道病毒71型（EV71）BrCr株外壳蛋白1（VP1）基因,构建原核表达载体PET28a/VP1,表达VP1重组蛋白,以VP1免疫产蛋母鸡,获得抗VP1的鸡免疫球蛋白（IgY）.方法 培养Vero细胞,利用Vero细胞增殖肠道病毒EV71 BrCr株,提取病毒总RNA,利用RT-PCR扩增出VP1目的基因,目的基因插入克隆载体pGEM-T,提取重组质粒,经BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切获得目的基因,插入原核表达载体pET-28a,重组子同时BamHⅠ,EcoRⅠ双酶切和测序鉴定,转化入感受态工程菌E.coli BL21（DE3）,获得阳性重组工程菌,经IPTG诱导获得表达融合蛋白,试剂盒纯化蛋白,经SDS-PAGE和Western blotting鉴定后,用VP1蛋白免疫开产母鸡,收集鸡蛋,利用EGG stractTM IgY Purification System试剂盒提取卵黄抗体IgY,间接ELISA测滴度,SDS-PAGE和Western blotting验证其表达量和免疫活性.结果 本实验成功扩增出肠道病毒EV71 BrCr株VP1基因,获得了含重组表达质粒pET28a/VP1的阳性工程菌株,经IPTG诱导能高效表达VP1蛋白,VP1经SDS-PAGE和Western blotting鉴定后,利用纯化后VP1蛋白免疫产蛋母鸡,提取的IgY经ELISA 鉴定后其滴度为1：104,SDS-PAGE和Western blotting证实为抗VP1的特异性IgY.结论 成功的从EV71 BrCr株扩增出VP1基因,构建了PET28a/VP1表达载体,获得高效表达融合蛋白,免疫产蛋母鸡后制备高效价抗VP1蛋白的特异性IgY.     

形觉剥夺树鼩视皮质17区的可塑性

目的 探讨肠道病毒71型(EV71)对树鼩肾细胞的感染特性.方法 通过组织块贴壁法分离培养树鼩原代肾细胞,观察细胞形态并进行传代培养,利用细胞角蛋白18对树鼩肾细胞进行间接免疫荧光鉴定.用EV71感染树鼩肾细胞,通过倒置显微镜观察细胞病变情况,结合间接免疫荧光实验观察细胞中病毒蛋白的表达情况,采用实时荧光定量PCR技术检测病毒载量,以Vero细胞为对照,研究EV71对树鼩肾细胞的感染情况.结果 通过组织块贴壁法可以快速获得树鼩原代肾细胞,并可进行多次传代培养,细胞为梭形,贴壁呈铺路石状,免疫荧光鉴定为肾上皮细胞.EV71可以感染树鼩肾细胞,使之出现明显的细胞变圆、脱落或解体等病变,免疫荧光实验可以观察到病毒蛋白的分布,实时荧光定量PCR检测病毒载量最高可达105拷贝/mL,病变情况和增殖趋势与Vero细胞相似.结论 EV71可以体外感染树鼩肾细胞,该细胞模型可为EV71药物筛选和感染机制研究提供平台.