MSCs成骨分化中BMP2对成骨转录因子SATB2表达的调控作用

目的探索间充质干细胞（MSCs）成骨分化中骨形态发生蛋白2（BMP2）对成骨转录因子SATB2表达的调控作用。方法体外培养小鼠间充质细胞系C2C12,腺病毒介导的BMP2（Adv-BMP2）诱导其向成骨细胞分化,建立并验证C2C12细胞成骨分化细胞模型。Real-Time PCR和Western blotting分别检测C2C12细胞成骨分化过程中经不同浓度Adv-BMP2处理不同时间时SATB2 mRNA和SATB2蛋白表达;以经相应浓度Adv-β-Gal处理细胞作对照。结果经150 pfu/cell Adv-BMP2处理C2C12细胞5 d后,成骨细胞标志基因Ⅰ型胶原、骨唾液酸蛋白和骨钙素表达以及碱性磷酸酶活性均显著增加,MSCs成骨分化模型构建成功。150 pfu/cell Adv-BMP2诱导C2C12细胞成骨分化过程中,SATB2 mRNA和SATB蛋白表达随分化进程而增加;Adv-BMP2浓度为0～225 pfu/cell时,SATB2表达随Adv-BMP2浓度升高而增加。结论 BMP2可调控SATB2的表达,从而影响MSCs成骨分化。     

二甲双胍通过调控MSTN抑制小鼠骨骼肌细胞C2C12分化

目的：探讨二甲双胍对小鼠骨骼肌细胞C2C12分化的影响及其分子机制。方法：将小鼠骨骼肌C2C12细胞系分为对照组和二甲双胍（5 mmol/L）组,用含5%马血清分化培养基诱导C2C12细胞分化,观察肌管形成情况。qPCR检测肌球蛋白重链（MyHC）和肌肉生长抑制素（MSTN）mRNA水平。Western印迹检测My HC、Ⅰ型肌球蛋白重链（MyHCⅠ）、Ⅱa型肌球蛋白重链（MyHCⅡa）、Ⅱb型肌球蛋白重链（MyHCⅡb）、Ⅱx型肌球蛋白重链（MyHCⅡx）和MSTN蛋白表达。应用siRNA下调MSTN的表达,并将小鼠骨骼肌C2C12细胞系分为MSTN敲低阴性对照组（siNC组）,MSTN敲低阴性对照+二甲双胍组（siNC+metformin组）,MSTN敲低组（siMSTN组）,MSTN敲低+二甲双胍组（siMSTN+metformin组）,检测二甲双胍是否通过升高MSTN抑制C2C12细胞分化。结果：显微镜观察显示,与对照组相比,二甲双胍组肌管数量减少、肌管直径较小。qPCR结果显示,与对照组相比,二甲双胍组My HC mRNA水平降低（t=29.47,P<0.000 1）,...     

蒲黄总黄酮抑制棕榈酸培养下C2C12骨骼肌细胞白细胞介素6的表达

目的：观察蒲黄总黄酮（Pollen Typhae total flavones，PTF）对棕榈酸培养下C2C12骨骼肌细胞白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）表达的影响，探讨PTF改善骨骼肌胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）的可能机制。 方法：0．25mmol／L棕榈酸培养建立骨骼肌细胞IR模型。根据处理方法不同，设对照组、模型组、核转录因子κB（nuclear factor-kappaB，NF-κB）抑制剂PDTC组、罗格列酮（rosiglitazone，ROS）组、ROS＋PDTC组、PTF组和PTF4-PDTC抑制剂组。处理16h后，^3H-脱氧葡萄糖摄入法观察细胞对葡萄糖的转运率，实时定量多聚酶联反应检测IL-6 mRNA的表达，酶联免疫吸附测定法检测细胞培养上清中IL-6蛋白水平。 结果：0．25mmol／L棕榈酸培养16h，C2C12细胞葡萄糖摄取率下降30．43％，IR模型建立；PTF可使IR模型细胞葡萄糖转运率增加32．39％。IL-6 mRNA表达及细胞培养上清液中IL-6蛋白水平均显著下降，差异有统计学意义（P＜0．05）；加入PDTC后，细胞IL-6 mRNA表达及细胞培养上清液中IL-6蛋白水平上升（P〈0．05）。 结论：PTF通过抑制NF-κB通路而抑制C2C12骨骼肌细胞IL-6 mRNA表达及蛋白分泌，可能是其减轻骨骼肌炎症状态和改善IR的机制之一。     

Effect of chronic electrical stimulation on transformation of myosin heavy chain isoforms in differentiated C2C12cells

目的 研究钙调神经磷酸酶(calcineurin,CaN)在低频复合生理频率慢性电刺激(chronic electrical stimulation with lower physiological frequency,CESLPF)对骨骼肌细胞肌球蛋白重链(myosin heavy chain,MHC)亚型表达的影响.方法 以体外2％马血清诱导小鼠成肌母细胞C2C12成肌分化为模型.实验分3组:对照组、CsA组和KN93组.对照组为正常分化的细胞;CsA组和KN93组在细胞诱导分化3d后,分别用CaN抑制剂环孢菌素A(CsA,8μmol)、Ca2+/钙调蛋白依赖的蛋白激酶(CaMK)抑制剂KN93(6μmol)单一或联合CESLPF(10 +40 Hz,1.5 h/d,共2d)处理.通过RT-PCR、Western blot检测观察成肌分化过程中肌球蛋白重链亚型的表达水平及其转换情况,采用比色法检测CaN的活性.结果 在成功构建的体外成肌分化模型上发现,CsA和KN93能够抑制C2C12细胞MHC Ⅰ的mRNA及蛋白的表达.与分化对照组MHC Ⅰ mRNA相对表达量(0.79 ±0.04)相比,CsA组(0.62±0.03)和KN93组(0.69±0.05)能够抑制C2C12细胞MHC Ⅰ型纤维的表达(与对照组比P＜0.05);对照组、CsA和KN93处理组MHC Ⅰ蛋白相对水平分别是(0.91±0.05)、(0.36±0.01)和(0.66±0.02).对照组MHCⅡb相对表达量为(0.53±0.01),CsA(0.63±0.02)和KN93 (0.75±0.03)促进MHCⅡb型纤维的表达(与对照组比较,P＜0.05);CESLPF能够逆转上述改变(与对照组比较,P＞0.05).CsA能够抑制CaN的活性表达;CESLPF能够显著提高CaN活性(P＜0.05),但仍显著低于正常水平(P＜0.05).结论 CaN和CaMK是骨骼肌细胞MHCⅡ型向MHC Ⅰ型转变的重要调控酶,CESLPF可能是经CaN通路和非CaN通路联合作用促进肌型转换,该结果为临床应用CESLPF治疗OSAS提供了实验依据.     

喉癌中Hsp70、p53、PCNA的表达及意义

目的 探讨热休克蛋白70（Hsp70)在喉癌中的表达及临床意义。方法 采用免疫组化ABC法检测Hsp70、p53蛋白及增殖细胞核抗原（PCNA）在喉癌组织中的表达情况。结果 分化差的喉癌组织中Hsp70表达水平明显增高（P＜0．01）;Hsp70与p53在喉癌组织中的表达呈密切相关性（P＜0．01）;Hsp70与PCNA增殖指数的表达呈明显相关（P＜0．001）,提示Hsp70的高表达可能是喉癌细胞高度增殖的结果;有淋巴结转移的喉癌组织中,Hsp70表达水平显著高于无淋巴结转移的癌组织（P＜0．05）。结论 Hsp70与p53蛋白在喉癌的演变过程中可能具有协同作用;Hsp70在喉癌癌变过程中起重要作用。     

慢性电刺激对成肌分化的C2C12细胞肌型转换的影响

目的研究钙调神经磷酸酶(calcineurin,CaN)在低频复合生理频率慢性电刺激(chronic electrical stimula-tion with lower physiological frequency,CESLPF)对骨骼肌细胞肌球蛋白重链(myosin heavy chain,MHC)亚型表达的影响。方法以体外2%马血清诱导小鼠成肌母细胞C2C12成肌分化为模型。实验分3组:对照组、CsA组和KN93组。对照组为正常分化的细胞;CsA组和KN93组在细胞诱导分化3 d后,分别用CaN抑制剂环孢菌素A(CsA,8μmol)、Ca2+/钙调蛋白依赖的蛋白激酶(CaMK)抑制剂KN93(6μmol)单一或联合CESLPF(10+40 Hz,1.5 h/d,共2 d)处理。通过RT-PCR、Western blot检测观察成肌分化过程中肌球蛋白重链亚型的表达水平及其转换情况,采用比色法检测CaN的活性。结果在成功构建的体外成肌分化模型上发现,CsA和KN93能够抑制C2C12细胞MHCⅠ的mRNA及蛋白的表达。与分化对照组MHCⅠmRNA相对表达量(0.79±0.04)相比,CsA组(0.62±0.03)和KN93组(0.69±0.05)能够抑制C2C12细胞MHC I型纤维的表达(与对照组比P<0.05);对照组、CsA和KN93处理组MHC I蛋白相对水平分别是(0.91±0.05)、(0.36±0.01)和(0.66±0.02)。对照组MHCⅡb相对表达量为(0.53±0.01),CsA(0.63±0.02)和KN93(0.75±0.03)促进MHCⅡb型纤维的表达(与对照组比较,P<0.05);CESLPF能够逆转上述改变(与对照组比较,P>0.05)。CsA能够抑制CaN的活性表达;CESLPF能够显著提高CaN活性(P<0.05),但仍显著低于正常水平(P<0.05)。结论 CaN和CaMK是骨骼肌细胞MHCⅡ型向MHCⅠ型转变的重要调控酶,CESLPF可能是经CaN通路和非CaN通路联合作用促进肌型转换,该结果为临床应用CESLPF治疗OSAS提供了实验依据。     

促酰化蛋白受体C5L2在前脂肪细胞分化过程和脂肪酸负荷下的表达研究

目的 观察3T3-L1前脂细胞分化和游离脂肪酸（FFA）对3T3-L1（前）脂肪细胞C5L2基因和蛋白表达的影响。方法采用逆转录（RT）-PCR和流式细胞仪检测不同分化时段和FFA处理后（前）脂肪细胞C5L2mRNA和蛋白表达。结果 3T3-L1脂肪细胞C512mRNA表达呈分化依赖性增加,而C5L2蛋白表达水平在分化早期显著增强,诱导分化6hC5L2蛋白表达增加了21％（61％±18％VS51％±15％,P〈0．05）;分化12h达高峰,增加了38％（70％±12％VS51％±15％,P〈0．01）;分化3d基本恢复至0d水平。在3T3-L1成熟脂肪细胞,0．5mmol／L和1．0mmol／L油酸分别抑制46％（0．58±0．21 vs 1．08±0．46,P〈0．05）和84％（0．18±0．04VS1．08±0．46,P〈0．05）C5L2 mRNA表达,而0．125mmol／L油酸即能显著下调36％（35％±8％vs54％±7％,P〈0．01）C5L2蛋白表达。低浓度棕榈酸均能明显抑制C5L2mRNA和蛋白的表达,1．0mmol／L时c512mRNA和蛋白表达分别减少了41％（0．57±0．28vs0．97±0．41,P〈0．05）和55％（24％±13％VS54％±7％,P〈0．01）。油酸和棕榈酸对前脂肪细胞C512表达差异无统计学意义。结论促酰化蛋白／C5L2途径参与了脂肪细胞分化的调控过程。C512mRNA和蛋白表达的下调可能参与了油酸和棕榈酸诱导的成熟脂肪细胞胰岛素抵抗的发生。     

利用RNAi建立脊髓性肌萎缩症的细胞模型

目的：应用RNA干扰沉默SMNI基因的表达建立脊髓性肌萎缩症（SMA）的细胞模型。方法：将pshRNA—SMN1重组质粒转染人骨髓间充质干细胞（hMSCs）,经G418筛选得到能稳定表达目的shRNA的单克隆细胞系后将其诱导分化为神经元样细胞（NLCs）建立SMA细胞模型组。同期设立转染重组质粒pshRNA-0的对照组和未转染重组质粒的空白对照组。观察NLCs的细胞形态,采用免疫细胞化学染色分析NLCs的NSE和NF蛋白表达,用RT—PcR和免疫印迹方法检测NLCs的SMN mRNA及其蛋白表达。结果：诱导后各组细胞呈典型的神经元样细胞形态且NSE和NF蛋白表达阳性;其fl-SMNmRNA,△7-SMN mRNA及n—SMN蛋白表达均较诱导前增加（P＜0．05）,但SMA细胞模型组的fl-SMN mRNA及蛋白表达仍明显低于对照组（P＜0．01）;而诱导后△7-SMN mRNA的表达在各组间差异无统计学意义（P＞0．05）。结论：SMN1 mRNA及其蛋白被抑制的MSCs诱导分化为NLCs后可以作为SMA的细胞模型。     

利用CRISPR/Cas9系统构建Lrtm1基因敲除的C2C12细胞系

目的：利用CRISPR/Cas9技术构建稳定敲除Lrtm1（leucine-rich repeats and transmenbrane domains 1）基因的C2C12细胞系,为研究Lrtm1基因的作用提供实验基础。方法：设计3对针对Lrtm1基因的向导RNA（sgRNA）,将sgRNA插入载体pCRISPR-LvSG06中;利用慢病毒包装系统包装含有sgRNA的重组质粒pCRISPR-LvSG06;将病毒感染C2C12细胞,并加入嘌呤霉素筛选,将筛选嘌呤霉素阳性的细胞提取RNA,逆转录成cDNA;设计Cas9引物,利用cDNA为模版,PCR验证C2C12细胞中Cas9的表达,确认慢病毒成功感染C2C12细胞;利用96孔板挑选单克隆细胞的方法筛选得到单克隆细胞;将扩增的单克隆细胞提取基因组DNA,测序Lrtm1基因相关序列并与野生型Lrtm1基因进行对比,确认敲除成功的克隆细胞株;诱导敲除Lrtm1稳定细胞株成肌分化,检测成肌分化标志因子Myosin的蛋白表达,RT-PCR检测转录因子PAX7的mRNA表达,Western blot检测H3K27me3蛋白水平。结果：测序结果显示向导RNA（sgRNA）成功插入载体质粒;将单克隆细胞DNA测序结果显示A和C克隆成功敲除Lrtm1基因;敲除Lrtm1基因后成肌分化标志因子Myosin蛋白表达降低,成肌转录因子PAX7 mRNA的表达降低,在分化72和96 h组,H3K27me3蛋白水平较野生型组增高。结论：利用CRISPR/Cas9技术成功敲除Lrtm1基因,稳定敲除Lrtm1基因的C2C12细胞系构建成功;敲除Lrtm1后能抑制C2C12细胞成肌分化,并且抑制成肌转录因子PAX7的mRNA表达,PAX7 mRNA表达降低的原因可能为H3K27me3水平增高。     

组蛋白去乙酰化酶抑制剂Chidamide抑制C2C12骨骼肌细胞分化及其机制

目的:探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂西达苯胺（Chidamide）对C2C12小鼠骨骼肌细胞分化作用及其分子机制。方法:CCK-8（cellcountingKit-8）法检测0、0.5、1、2、4μmol/LChidamide处理后C2C12细胞的活力;将C2C12骨骼肌细胞分为对照组（control）和Chidamide组,Western印迹检测Chidamide处理后组蛋白H3乙酰化（Pan-acetylH3）水平,细胞免疫荧光染色肌管细胞分化成熟标志蛋白肌球蛋白重链（MyHC）,检测肌细胞分化,Western印迹和qPCR检测MyHC、成肌分化抗原（MyoD）、肌细胞生成素（MyoG）的表达及肌原纤维Ⅰ型（Myh7）、Ⅱa型（Myh2）、Ⅱb型（Myh4）和Ⅱx型（Myh1）的表达。结果:0、0.5、1、2、4μmol/L的Chidamide均不影响细胞活力。Chidamide升高Pan-acetylH3蛋白水平（t=3.22,P<0.05）。细胞免疫荧光结果显示,与对照组相比,Chidamide处理后肌细胞融合受损,分化程度降低。Western印迹和qPCR结果显示,与对照组相比,Chidamide下调MyHC、MyoD和MyoG蛋白水平（t=5.71、6.05、7.37,均P<0.01）和mRNA水平（t=26.87、5.81、4.86,均P<0.01）;降低Myh7蛋白（t=3.93,P<0.01）和mRNA水平（t=4.85,P<0.01）;降低Myh1、Myh2蛋白（t=14.13、5.05,均P<0.01）和mRNA水平（t=15.48、16.82,均P<0.001）,但不影响Myh4的蛋白（t=2.19,P>0.05）和mRNA水平（t=1.50,P>0.05）。结论:Chidamide可能通过下调MyoD和MyoG的表达抑制C2C12骨骼肌细胞分化,且主要抑制Ⅰ型、Ⅱa和Ⅱx型肌原纤维,不影响Ⅱb型肌原纤维。     

在大鼠胶质瘤C6细胞中过表达Pygo2促进其细胞增殖

 目的 通过构建过表达Pygo2的重组体上调Pygo2表达,探讨其在大鼠胶质瘤C6细胞增殖中的作用及机制。方法 重组体经EcoR I和Hind Ⅲ双酶切鉴定和DNA测序后,用脂质体2000将其转染大鼠胶质瘤C6细胞,采用Western blot检测外源Pygo2蛋白表达,应用克隆形成实验和MTT法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期,采用Western blot检测过表达Pygo2对C6细胞中cyclinD1、β-catenin水平的影响,并采用细胞免疫荧光法检测其对C6细胞中cyclinD1、β-catenin亚细胞定位的影响。结果 双酶切和测序鉴定结果证实插入序列正确,重组体能有效上调Pygo2表达。将重组体转染C6细胞上调Pygo2表达后,细胞的生长增殖被显著促进,克隆形成显著增多,细胞周期进程从G1期至S期转变显著增强;且cyclinD1水平随之增高,亚定位无改变,β-catenin水平和亚细胞定位无明显改变。结论 成功构建了过表达Pygo2的重组体,过表达Pygo2通过增高cyclinD1水平,促进细胞从G1期进入S期,从而促进大鼠胶质瘤C6细胞增殖。     

HSP70在化学性缺氧诱导毛细胞损伤中的作用

目的：探讨热休克蛋白70（heat shock protein 70,HSP70）在氯化钴（cobalt chloride,CoCl2）诱导听细胞损伤中的作用。方法：应用CoCl2处理HEI-OC1听细胞,建立化学性缺氧诱导耳蜗外毛细胞损伤的体外模型。细胞计数试剂盒-8（cell count kit 8,CCK-8）比色法检测细胞存活率,免疫印迹法（Western blot）检测HSP70的蛋白表达。结果：在150-750μmol/L浓度范围内,不同浓度的CoCl2处理听细胞24 h可引起明显的细胞毒性,使细胞存活率呈剂量依赖性地降低。300μmol/L CoCl2作用听细胞30-240 min可时间依赖性地上调HSP70的蛋白表达。HSP70抑制剂槲皮素（quercetin,Quer）可在蛋白水平下调CoCl2引起的听细胞内HSP70表达增加。Quer通过抑制HSP70的表达可加重CoCl2诱导的听细胞缺氧性损伤。结论：适应性HSP70表达增加可保护听细胞对抗缺氧诱导的损伤。     

脑梗死大鼠模型急性期抗凋亡蛋白Bcl-2和热休克蛋白70的动态表达

【目的】观察SD大鼠大脑中动脉闭塞模型（middlecerebralarteryocclusion,MCAO）急性期热休克蛋门70（heatshockresponse70,Hsp70）和抗凋亡蛋门Bcl-2（Bcelllymphoma／leukemia2）随时间变化的动态表达,探讨其变化的规律,为临床治疗靶点提供实验依据。【方法】选用健康雄性SD大鼠36只,采用完全随机设计方法分为3组,空白对照组n=4）、假手术组（n=16）、手术组（n=16）。手术组采用改良线栓法建立急性大脑中动脉闭塞模型,术后0．5h、2h、3h、6h、12h、24h、3d、7d共8个DI采血。用ELISA法测定Bcl-2和Hsp70的OD值,绘制标准曲线并计算对应的浓度。【结果】（1）Bcl-2的表达：手术组Bcl-2术后6h显著升高,12h到达高峰,3d时下降接近空F1对照组水平。手术组与假手术组在6、12、24h时问点比较差异有统计学意义（P〈0．05）;手术组与空白对照组在2h、3h、6h、12h、24h、3d、7d时间点比较差异有统计学意义（P〈0．05）;手术组内6、12、24h与其他时间点比较差异有统计学意义（P〈0．05）。（2）Hsp70的表达：手术组Hsp70在术后0．5h就开始表达,24h达到高峰,3d时逐渐下降接近对照组水平。手术组内24h与各时间点内表达水平比较差异有统计学意义（P〈0．05）。【结论]Bcl-2和Hsp70在脑梗死急性期均显著升高,参与神经元缺血缺氧的病理过程,在神经细胞损伤早期发挥重要作用。二者的表达水平呈正相关性。     

BMP2诱导C3H10T1／2细胞成软骨分化的分子机制研究

目的：探讨骨形态发生蛋白2（BMP2）诱导鼠胚胎间充质干细胞C3H10T1／2向成软骨分化的可能分子机制。方法：20μg／mLBMP2诱导C3H10TI／2细胞0,4h,1,3,6,10,13,15d后,RT—PCR检测BMP信号通路中关键分子BMPRI,BMPRII,Smadl／5／8的表达,Westernblot检测smad蛋白及MAPK信号通路中p38磷酸化水平变化,QRT—PCR检测成软骨标志基因aggrecan,Col2a1以及成软骨相关转录因子FGFR3,Sox9表达水平,同时用Alcine Blue染色,观测C3H10T1／2细胞成软骨分化情况。结果：经BMP2诱导后,C3H10T1／2细胞表现出成软骨分化,smad蛋白及p38磷酸化水平有所上升,同时成软骨标志基因col2a1以及成软骨相关转录因子FGFR3,Sox9表达水平都有增加。与未诱导组相比,Col2a1,FGFR3,Sox9在3d的表达与对照组相比差异有统计学意义（P〈0．05）,FGFR3,Sox9在6d的表达与对照组相比差异有统计学意义（P〈0．05）。结论：在一定培养条件下,BMP2具有诱导C3H10T1／2细胞成软骨分化能力。     

钙调神经磷酸酶在兔胆囊切除术后早期Oddi括约肌改变中的作用

目的观察胆囊切除术后早期Oddi括约肌超微结构改变、肌球蛋白重链（MHC）及钙调神经磷酸酶（CaN）催化亚单位α、β（CnAα、CnAβ）2种亚型的表达变化,探讨胆囊切除术后Oddi括约肌的改变及其可能的机制。方法52只新西兰大白兔,分为4组,A、D组各14只,B、C组各12只;A组仅行开腹术暴露胆囊,术后4周取Oddi括约肌标本;B、C、D组行胆囊切除术,分别于术后2、4、8周切取标本。A、D组各取2只行透射电镜检测。余行RT-PCR、Western blot检测CnAα、CnAβ mRNA和蛋白表达变化,Western blot检测MHC蛋白表达变化。结果①Western blot检测到术后2周、4周、8周MHC蛋白表达逐渐增加（P〈0.01）;透射电镜示术后8周平滑肌细胞内密体增多。②RT-PCR检测到术后4周、8周与对照组比CnAβ mRNA表达增加,8周比4周降低（P〈0.01）。③Western blot检测到术后2周、4周、8周CnAβ蛋白表达逐渐增加（P〈0.01）。④CnAα mRNA及蛋白表达均无显著变化。结论兔胆囊切除术可致Oddi括约肌组织超微结构发生改变、肌球蛋白重链表达增加;肌球蛋白重链表达增加可能与CnAβ表达增高有关,这可能是Oddi括约肌功能紊乱（SOD）多发生于胆囊切除术后患者的分子机制之一,可能在胆囊切除术后SOD的发病过程中起一定的作用。     

家兔半膜肌各亚部肌球蛋白重链表达差异的实验研究

目的利用家兔半膜肌各亚部肌纤维类型的分布特征,观察骨骼肌两型肌纤维肌球蛋白重链（MHC）的构成特点,为进一步探讨两型肌纤维的区别以及两型肌纤维转化机制奠定基础。方法取成年家兔半膜肌,通过改良肌球蛋白ATP酶染色法观察半膜肌四个亚部肌纤维类型的构成,应用RT-PCR方法检测各亚部4种MHC亚型mRNA的表达情况。结果固有半膜肌只含有慢肌（Ⅰ型）肌纤维,表达MHCⅠ型和少量MHCⅡa型基因。副半膜肌腹侧亚部除含有少量Ⅰ型肌纤维外,主要含有快肌（Ⅱ型）肌纤维,表达少量MHCⅠ型基因以及MHCⅡa、MHCⅡb和MHCⅡx型基因等四种类型;而副半膜肌背侧和外侧亚部只含有Ⅱ型肌纤维,仅表达MHCⅡa、MHCⅡb和MHCⅡx型基因。结论家兔半膜肌各亚部肌纤维类型几乎均呈单一类型分布。固有半膜肌亚部主要表达MHCⅠ型基因;副半膜肌各亚部主要表达MHCⅡa、MHCⅡb和MHCⅡx型基因,以MHCⅡx型基因为主,各亚部之间存在细微差别。     

HnRNPE2 decoy RNA恢复C/EBPα活性诱导32D-P210的细胞粒系分化

目的：采用核不均一核糖核蛋白E2（hnRNP E2）decoy RNA靶向阻断CCAAT增强子结合蛋白alpha（C/EBPα）基因的异常翻译,诱导小鼠白血病样32D-P210细胞株向粒系分化,并进一步探讨其分子机制.方法：电穿孔法分别将野生型和突变型hnRNP E2 decoy RNA表达质粒转染入32D-P210细胞,经G418筛选出稳定株后,RT-PCR检测C/EBPa,粒细胞集落刺激因子受体（G-CSFR）与髓过氧化物酶（MPO）基因的mRNA水平;WesternBlot检测C/EBPa,G-CSFR的蛋白表达水平;瑞氏染色观察粒细胞集落刺激因子（G-CSF）刺激前后细胞形态;流式细胞仪检测分化抗原Gr-1,CD11b的表达.结果：筛选到分别稳定表达野生型或突变型hnRNP E2 decoy RNA的TG细胞株和TGA细胞株.与未转染组32D-P210细胞相比,TG细胞株C/EBPa mRNA水平无改变,但42ku-C/EBPa蛋白、G-CSFR mRNA和MPO mRNA水平分别升高了（43.8±4.9）%,（69.1±3.2）%和（37.8±4.2）%（P〈0.05）;G-CSF刺激后,TG细胞出现中、晚幼粒细胞甚至成熟粒细胞形态学特征;同时Gr-1分化抗原的表达率上升至40.3%,未转染组32D-P210细胞的Gr-1表达率5.5%（P〈0.05）;然而CD11b在3组细胞都是高表达,没有明显的变化（P〉0.05）;以上各参数在TGA细胞株与未转染组32D-P210细胞株间均无显著性差异（P〉0.05）.结论：hnRNP E2 decoy RNA能够诱导32D-P210细胞向粒系分化,其机制可能与decoy RNA特异性阻断hnRNAE2与C/EBPα mRNA非翻译区结合,调节C/EBPα mRNA翻译,恢复42ku-C/EBPα表达,上调其下游G-CSFR和MPO等分化基因的表达有关.G-CSF可加速这一作用从而促进32D-P210细胞的分化过程.     

丙型肝炎病毒1b基因型C区氨基酸70替代对干扰素刺激应答元件的影响

目的 探讨丙型肝炎病毒（hepatitis C Virus,HCV） 1b基因型（genotype 1b,GT-1b）C区氨基酸（amino acid,aa）70替代对干扰素刺激应答元件（interferon-stimulated response element,ISRE）的影响.方法 首先构建HCV GT-1b C区aa70野生型和变异型核心蛋白表达质粒,测序鉴定后瞬时转染肝瘤细胞系Huh7细胞,Western blot法鉴定HCV核心蛋白的成功表达;然后利用ISRE双荧光素酶报告基因实验检测核心蛋白表达对ISRE活化的影响,并以SYBR Green real-time PCR检测3种主要干扰素刺激基因（interferon stimulated genes,ISGs）的表达情况.结果 构建了HCV aa70野生型和变异型核心蛋白表达质粒,并在体外培养细胞中成功表达.但野生型和变异型核心蛋白表达对ISRE活化及3种主要ISGs表达的影响无明显差异.结论 单纯R70Q/H变异的核心蛋白似乎并不足以直接导致IFNα耐药.