应用伴侣分子在大肠杆菌表达系统高效表达家蝇天蚕素

目的应用伴侣分子在大肠杆菌表达系统中高效表达家蝇天蚕素,研究伴侣分子对家蝇天蚕素基因在大肠杆菌中表达的影响。方法RT-PCR克隆家蝇的天蚕素成熟肽(mature cecropin,MC)与泛素(ubiquitin,UBI)基因,利用生物信息学方法分析硫氧还蛋白(thioredoxin,Trx)-MC和MC分子结构及Trx-MC分子和Trx-UBI-MC两种融合蛋白mRNA5'端的二级结构的异同。分别构建pET32a-MC和pET32a-UBI-MC两种重组质粒,转化入大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)中。检测Trx-MC融合蛋白的表达和pET32a-MC和pET32a-UBI-MC在相同诱导时间及诱导剂浓度的条件下,融合蛋白表达量的差异。结果生物信息学分析结果显示MC分子被Trx分子包裹在其内部,MC分子的细胞毒性被去除,使其可以在大肠杆菌中正常表达。分子生物学实验结果进一步验证了生物信息学分析结果的正确性。同时,也显示UBI分子的加入,未影响融合蛋白质Trx-UBI-MC与Trx-MC的mRNA5'端二级结构。并且Trx-UBI-MC融合蛋白在全菌蛋白中的含量明显高于Trx-MC。结论Trx作为伴侣...     

重组蛋白在大肠杆菌中可溶性表达的策略

重组蛋白技术在许多领域已成为一种必要的工具,但有时表达的目的蛋白却未进行正确的折叠而被蛋白酶降解或聚集形成包涵体.因此,人们在表达不同的目的蛋白时采用了多种方法以期获得具有生物学功能的蛋白质,包括共表达分子伴侣、融合表达、定位表达、改善诱导条件、添加促折叠试剂和选择宿主细胞等.本综述整理了近年来优化蛋白表达的成功经验,从以上方面讨论了如何提高目的蛋白表达的可溶性和促进目的蛋白的正确折叠.     

承载分子PaP3.30在小分子活性肽融合表达中的应用

目的：筛选并克隆—个承载分子，研究其在肽抗生素及其他小分子活性肽融合表达中的应用。方法：根据肽抗生素为小分子活性肽，通常带正电荷的特性，从绿脓杆菌噬菌体(PaP3)基因组中筛选一承载分子，构建其与肽抗生素hPAB-β的融合蛋白表达载体，确认该承载分子能在大肠杆菌中融合表达肽抗生素后，再选择一组不同来源、不同大小、不同等电点的小肽分子作为研究对象，分别构建它们与承载分子的融合蛋白表达载体，转化大肠杆菌进行表达。根据表达情况，分析所选择的承载分子融合表达生物活性小肽的能力。结果：从PaP3基因组中成功地筛选到ORF-30编码的162个氨基酸组成的蛋白作为承载分子(PaP3．30)；构建该承载分子与肽抗生素hPAW-β的融合蛋白表达质粒pQE-PaP30-hPAB-β，在大肠杆菌中表达的融合蛋白占细菌总蛋白的30％以上；对所选择的不同来源(人、蜜蜂、爪蟾、大肠杆菌)、不同大小(相对分子质量为700—5300)、不同等电点(pⅠ2．9—12)的六种小肽分子PaP3．30，均能实现其在大肠杆菌中高效融合表达，表达量为细菌总蛋白的35％-44％。结论：所筛选的承载分子PaP3．30具有很强的融合表达小分子活性肽的能力，为建立高效表达和制备活性小肽的技术平台创造了条件。     

介导金黄色葡萄球菌侵袭细胞的关键蛋白FnBP功能肽段在E．coli中的可溶性表达及功能

目的：将介导金黄色葡萄球菌侵袭细胞的关键蛋白FnBP的重要功能肽段与GST蛋白在大肠杆菌中融合表达．方法：利用合成的特异性引物钓取金黄色葡萄球菌基因组中的目的片段,将其克隆人pGEX—KG载体,在大肠杆菌中与GST蛋白进行融合表达．结果：成功地表达了目的肽,可溶性的表达产物占细菌可溶性蛋白的20％左右,且目的肽与配基纤连蛋白Fn具有结合的能力．结论：成功地表达了介导金黄色葡萄球菌侵袭细胞的关键蛋白FnBP中的重要功能肽段,为研究金葡菌侵袭细胞的机制奠定了基础．     

血管内皮生长因子受体结合肽介导颗粒酶靶向性抗肿瘤血管生成

目的：观察血管内皮生长因子受体（VEGFR）结合肽－颗粒酶B（GraB）融合蛋白抗血管生成的作用。方法：抽提人外周血淋巴细胞总RNA，进行RT－PCR克隆GraBcDNA；抽提LoVo细胞总RNA，进行RT－PCR克隆VEGFR结合肽cDNA，用限制性酶切和DNA测序进行鉴定，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）分析表达产物，表达产物经亲和层析纯化后，以人血管内皮细胞（ECV304）和鸡胚尿囊膜血管测定其生物学活性。结果：表达产物以可溶性分子形式存在于菌体中，具有良好的抗原性和特异性，且具有抑内管内皮细胞增殖及破坏鸡胚尿囊膜血管形成的活性，结论：VEGFR结合肽－GraB融合蛋白具有抑制血管生成的功能，在肿瘤生物靶向治疗中有一定潜在价值。     

重组LTB-UreB融合基因工程菌发酵工艺研究

目的：研究大肠杆菌表达重组人幽门螺杆菌尿素酶B亚单位和大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位（LTB－UreB)融合基因工程菌BL21的发酵工艺，方法：采用德国B.Brau公司C－10型15L发酵罐发酵，对影响工程菌生长和目的蛋白的表达条件进行了优化，结果：在优化的条件下，15L发酵罐发酵工程菌，菌体收获量可达52．2g/L，目的蛋白表达量约占总蛋白的27％，结论：此发酵工艺可以提高工程菌收获和目的蛋白的表达。     

霍乱毒素ctxA基因的克隆及原核表达

目的 构建霍乱毒素A亚基基因（ctxA）的融合表达载体。并在原核细胞中表达,为霍乱弧菌肠毒素A亚基（CTA）免疫原性的研究及其作为免疫佐剂的研究提供基础。方法 以霍乱弧菌DNA为模板．PCR扩增获得霍乱弧菌ctxA基因,与带有硫氧还蛋白（Trx）基因的高效原核表达质粒pET32a（＋）定向重组,构建重组质粒．转化大肠杆菌BL21（DE3）,并经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,以IPTG诱导表达Trx—CTA融合蛋白,用SDS—PAGE及Western blot进行鉴定。结果 限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析表明,我们扩增出了霍乱弧菌787bp的ctxA基因,成功构建了重组质粒pET—ctxA,经SDS—PAGE及Western blot分析显示重组质粒pET—ctxA在原核细胞中得到了高效融合表达。结论 霍乱弧菌ctxA基因在大肠杆菌中得到了高效表达。     

多拷贝人C肽基因的构建及其原核表达研究

目的构建多拷贝的人C肽基因,选用合适的表达载体,以多拷贝基因的形式在大肠杆菌中高效表达人C肽。方法采用PCR、克隆、DNA序列分析、IPTG诱导表达和亲和层析等方法构建多拷贝的人C肽基因。结果构建成含5拷贝C肽基因的重组pET-30 a表达载体,经转化及诱导,可在大肠杆菌中高效稳定表达可溶性的带6个组氨酸标签的C肽融合蛋白。结论在大肠杆菌中获得了人C肽的高表达,为下一步C肽的功能研究创造了重要条件。     

C11orf17蛋白的原核表达及功能预测

目的 利用基因工程技术获取原核表达的C11orf17蛋白,结合生物信息学初步预测其功能. 方法 以K562细胞的cDNA为模板,PCR扩增C11orf17的基因序列;双酶切后将目的基因亚克隆至原核表达载体pET-32a上,将测序正确的重组表达质粒pET-32a-C 11 orf17转化到E.coli BL21,经诱导后SDS-PAGE及Western blot 检测融合蛋白表达,并分析其可溶性.采用UGET软件预测C11orf17共表达基因,蛋白质互作数据库挖掘C11orf17基因已知互作蛋白,在线软件Gather富集共表达基因生物功能. 结果 成功构建重组表达质粒pET-32a-C11orf17,此重组体经诱导后能在E.coli BL21高效表达C11orf17的融合蛋白,UGET分析C11orf17前300共表达探针中,包含267个已知基因,共表达基因主要富集细胞交流、信号传导、细胞周期基因功能本体.蛋白互作数据库表明,C11orf17与PRKACA蛋白互作,后者为细胞周期调控重要分子. 结论 在原核细胞中成功表达出C11orf17蛋白,生物信息预测其可能是细胞周期调控重要新分子,为后续研究提供了方向和线索.     

硫氧还蛋白在宫颈癌中的表达及作用机制

目的 研究硫氧还蛋白（Trx1）在宫颈癌中的表达水平及其作用机制。方法 在3对宫颈癌和癌旁组织中,采用蛋白质免疫印迹法（Western Blot）检测Trx1蛋白的表达水平;同时在3对宫颈癌和癌旁组织中,通过逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测与宫颈癌密切相关的SND1分子的表达水平;用免疫组织化学(IHC)检测宫颈癌组织中Trx1蛋白的表达水平以及亚细胞定位;用免疫荧光（IF）实验检测蛋白Trx1和HLA-DR在宫颈癌细胞中的表达水平以及通过不同的荧光标记后分析两种蛋白的荧光共定位情况。结果 Trx1蛋白在宫颈癌组织中显著高表达;SND1分子在宫颈癌组织中显著高表达;免疫组化显示Trx1在主要定位于宫颈癌细胞的细胞质中并且表达显著增加;细胞内绿色荧光标记的Trx1和红色荧光标记的HLA-DR在荧光显微镜下存在共定位现象（均P＜0.05）。结论 Trx1蛋白在宫颈癌组织中显著高表达,并且与HLA-DR共定位于细胞质中。     

预混胰岛素与甘精胰岛素联合口服降糖药治疗初诊2型糖尿病的疗效比较

目的：比较诺和灵30R与甘精胰岛素联合二甲双胍强化治疗初诊2型糖尿病（T2DM）的疗效。方法：80例初诊T2DM患者分为诺和灵30R组（A组,40例）和甘精胰岛素联合二甲双胍组（B组,40例）,疗程3个月。比较治疗前后两组血糖控制情况及胰岛B细胞功能。结果：治疗后两组空腹血糖（FPG）、餐后2h血糖（2hPG）、糖化血红蛋白（HbA1C）均显著下降（均P〈0.01）,胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）下降（P〈0.05）,胰岛素分泌指数（HOMA-β）升高（P〈0.01）。B组血糖达标更迅速。A组较B组低血糖发生率更高。结论：甘精胰岛素联合二甲双胍治疗初诊2型糖尿病安全有效。     

甘精胰岛素在精神病合并糖尿病患者中的临床应用

目的探讨甘精胰岛素在精神病合并糖尿病患者治疗中的疗效。方法 80例精神病合并糖尿病患者随机分为甘精胰岛素治疗组（A组）39例,常规胰岛素治疗组（B组）41例。观察两组患者治疗前后血糖变化、血糖调整时间、胰岛素用量、低血糖发生率。结果两组治疗后血糖均明显低于治疗前,A组能明显缩短调整期及治疗期的治疗时间（P〈0.01）,胰岛素用量少于B组（P〈0.01）,且低血糖发生率明显低于B组（P〈0.05）。两组治疗后血糖无明显差异（P〉0.05）。结论甘精胰岛素能迅速、有效、平稳地控制精神病合并糖尿病患者的血糖,不失为精神病合并糖尿病控制血糖的良好方法。     

甘精胰岛素联合阿卡波糖治疗2型糖尿病的疗效观察

目的：观察甘精胰岛素联合阿卡波糖治疗2型糖尿病的临床疗效。方法：将42例口服降糖药物控制不佳的2型糖尿病患者,随机分为对照组和治疗组各21例,对照组采用预混胰岛素（诺和灵30R）治疗,治疗组采用甘精胰岛素联合阿卡波糖治疗。治疗12周,观察治疗前后血糖达标情况、低血糖发生事件、体重指数及腰围变化。结果：两组患者的FBG、2hPG、HbA1C均较治疗前明显降低（P＜0.01）,两组治疗达标率对比无意义,治疗组达标率高于对照组,且低血糖发生率低（治疗组2人（9.5％）,对照组5人（23.8％）, P＜0.05）。结论：甘精胰岛素联合阿卡波糖治疗2型糖尿病可显著改善胰岛β功能、降低血糖,低血糖发生率低,临床效果显著,是一种较为理想联合治疗方法。     

口服降糖药治疗2型糖尿病失效联合甘精胰岛素治疗疗效观察

目的观察口服降糖药治疗2型糖尿病失效后,联合甘精胰岛素治疗糖尿病的疗效。方法筛选68例单用口服降糖药血糖控制不理想的2型糖尿病患者,睡前（21：30）加用甘精胰岛素（来得时）,治疗14周,比较前后空腹血糖（FPG）、餐后2h血糖（2hPG）、糖化血红蛋白（HbA1c）、空腹C肽、餐后2hC肽、体重变化及低血糖的发生。结果加用甘精胰岛素组治疗14周后,患者FPG、2hPG、HbA1c较治疗前明显下降（P〈0．01）,餐后2hC肽较治疗前明显升高（P〈001）,未见低血糖发生,体重指数影响不大。结论对单用口服药效果不佳的2型糖尿病,需及时加用甘精胰岛素治疗。     

甘精胰岛素联合阿卡波糖治疗初诊2型糖尿病的疗效观察

目的：探讨甘精胰岛素联合阿卡波糖治疗初诊2型糖尿病的临床效果。方法：将在我院治疗的初诊2型糖尿病患者52例随机分为观察组和对照组,对照组给予诺和灵治疗,观察组给予甘精胰岛素联合阿卡波糖治疗。结果：治疗后观察组患者空腹血糖、餐后2h血糖优于对照组（P〈0．05）。观察组血糖达标时间、胰岛素用量明显优于对照组（P〈0．05）。观察组低血糖发生率明显低于对照组（P〈0．05）。两组患者均未见其他明显的药物不良反应。结论：甘精胰岛素联合阿卡波糖治疗初诊2型糖尿病效果显著,副作用少,值得应用。     

甘精胰岛素治疗2型糖尿病患者的临床效果和安全性分析

目的分析甘精胰岛素在2型糖尿病患者中应用效果及其安全性。方法研究对象来自浙江省温岭市第四人民医院内分泌科2011年1月~2013年1月收治的120例2型糖尿病患者,随机其分为对照组和实验组各60例。对照组采用低精蛋白重组人胰岛素治疗,实验组采用甘精胰岛素治疗,比较两组患者临床疗效和安全性。结果 14 d后,两组患者空腹血糖、餐后2 h血糖、空腹C肽、糖化血红蛋白均优于治疗前,但是,两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。实验组患者血糖达标平均时间和血糖达标平均费用均明显少于对照组(P<0.05)。结论甘精胰岛素和低精蛋白重组人胰岛素控制空腹血糖、餐后2h血糖、空腹C肽和糖化血红蛋白效果相当,从经济学角度,可优先考虑甘精胰岛素。     

甘精胰岛素联合二甲双胍治疗2型糖尿病临床观察

目的:观察甘精胰岛素联合二甲双胍对血糖控制不佳的超重或肥胖2型糖尿病患者的疗效.方法:对86例体重指数(BMI)≥24 kg/m2,并且使用口服降糖药治疗后糖化血红蛋白(HbA1C)≥7.0％的2型糖尿病患者,在制定合理的饮食加运动治疗方案的基础上,采用甘精胰岛素加二甲双胍联合治疗.根据血糖水平调整甘精胰岛素及二甲双胍...     

西格列汀联合甘精胰岛素治疗2型糖尿病疗效观察

目的：探讨西格列汀联合甘精胰岛素治疗糖尿病的效果。方法：收治糖尿病患者58例,将入组的所有患者采用随机的方式进行分组,一组为观察组共30例患者,本组服用西格列汀联合甘精胰岛素进行治疗;一组为对照组共28例患者,本组服用阿卡波糖联合甘精胰岛素进行治疗。将两组疗效进行比较,观察两组治疗后FBG、2hPG、HbA1C、低血糖发生率。结果：两组治疗后,FBG、2hPG、HbA1C指标均较前下降（P〈0.01）。且观察组低血糖发生率低于对照组（P〈0.05）。结论：西格列汀联合甘精胰岛素能有效控制血糖,低血糖发生率低,具有安全方便的特点。     

甘精胰岛素联合口服药物治疗2型糖尿病的临床疗效分析

目的探讨甘精胰岛素联合口服药物治疗2型糖尿病的临床疗效。方法将2010年3月至2011年4月辽河油田总医院收治的120例2型糖尿病患者依据随机数字表法分为两组:治疗组(62例)采用甘精胰岛素联合口服药物治疗;对照组(58例)采用预混胰岛素治疗,比较两组患者的治疗效果以及并发症情况。结果两组患者治疗前和治疗后的空腹血糖、餐后2 h血糖比较差异均无统计学意义(P>0.05),治疗组血糖达标时间显著少于对照组(P<0.05);治疗组患者低血糖发生率显著低于对照组(19.4%vs 37.9%),胰岛素用量显著少于对照组(P<0.05)。结论甘精胰岛素联合口服药物方案治疗2型糖尿病疗效显著,低血糖发生率较低。     

甘精胰岛素联合那格列奈治疗2型糖尿病疗效观察

目的 观察甘精胰岛素联合那格列奈治疗2型糖尿病的疗效性和安全性.方法 120例2型糖尿病患者随机分为研究组和对照组.意向性分析（ITT）人群共120例,研究组60例、对照组60例;符合方案集分析（PP）人群共108例,研究组55例、对照组53例.研究组给予甘精胰岛素和那格列奈治疗,对照组给予重组人胰岛素注射液（甘舒霖R）和低精蛋白重组人胰岛素注射液（甘舒霖N）,疗程2个月.比较2组的糖化血红蛋白（HbA1C）、空腹血糖（FBG）、餐后2h血糖（2hPG）、临床疗效和不良反应.结果 ITT人群分析,研究组总有效率为93.3％,明显高于对照组的81.7％ （P ＜0.05）;PP人群分析,研究组总有效率为96.4％,明显高于对照组的86.8％ （P ＜0.05）.与治疗前基线值比较,2组治疗后的HbA1C、FBG和2hPG均明显下降（P＜0.05）.治疗后研究组的HbA1C、FBG和2hPG均明显低于对照组（P＜0.05）.研究组和对照组分别有7例（11.7％,7/60）和22例（36.7％,22/60）出现低血糖,研究组低血糖发生率明显低于对照组（P＜0.05）.结论 那格列奈和甘精胰岛素联合用于治疗2型糖尿病,能明显降低血糖,提高临床疗效,并且低血糖发生率更低。