G蛋白偶联受体激酶2活性和表达的调控

G蛋白偶联受体(G Protein-coupled Receptor,GPCRs)是一类重要的细胞表面受体,广泛存在于从真菌到哺乳动物几乎所有的有机体中,能通过传导细胞外信号参与调节许多生物学效应的蛋白质超家族。在激动剂持续存在的情况下,GPCRs介导的细胞内效应往往降低,产生失敏(减敏)状态。在触发迅速失敏的过程中,G蛋白偶联受体激酶(G Protein-coupled Receptor Kinases,GRKs)起关键作用。体外实验显示GRK2能磷酸化并调节多种GPCRs。探讨这些调控机制是理解不同生理、病理状态下GRK2如何参与GPCRs信号传导的重要理论基础。下面对GRK2的表达、亚细胞定位及调控机制进行简要综述,初步探讨它的病理生理学意义。     

帕金森病α-Synuclein转基因小鼠模型中G蛋白偶联受体激酶5的表达

目的 观测G蛋白偶联受体激酶5 (G protein-coupled receptor kinase, GRK5) 在帕金森病α-synuclein转基因小鼠模型中的表达变化情况,了解GRK5在帕金森病中的可能作用,为发现帕金森病发病机制和探索更好的治疗方法提供新的方向.方法采用Western blotting和实时荧光定量PCR技术对具有不同的人alpha synuclein(h-α-syn)表达水平的帕金森病α-synuclein转基因模型小鼠以及3月龄,6月龄以及9月龄A53T突变型帕金森病α-synuclein转基因模型小鼠脑组织进行GRK5的RNA和蛋白水平检测,与同窝阴性对照小鼠进行比较.结果各组帕金森病α-synuclein转基因小鼠与阴性对照小鼠相比,GRK5蛋白表达水平均有不同程度的增加,并且随着转入的h-α-syn蛋白表达水平的高低而有所变化.3月龄和6月龄帕金森病转基因模型小鼠与同月龄阴性对照组小鼠相比,GRK5的mRNA和蛋白水平没有变化;而9月龄帕金森病转基因模型小鼠与同月龄阴性对照组小鼠相比,GRK5的mRNA和蛋白水平都有所增加.结论帕金森病α-synuclein转基因模型小鼠具有更高表达水平的GRK5.     

G蛋白偶联受体激酶5在大肠杆菌中的表达纯化

通过RT-PCR扩增得到了人G蛋白偶联受体激酶5(GProtein-coupledreceptorki-nase,GPK5)的基因,将其克隆到表达载体pET-28a中,并将该质粒转入大肠杆菌BL21(DE3),在10μmol/L异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPIG)诱导培养下表达,通过分离纯化,得到部分纯化的GRK5蛋白。体外活性测定表明,纯化后的GPK5能够特异性地磷酸化视紫红质。动力学常数Km=4.3μmol/L,Vmax=25nmol/(mg·min),与文献报道的从真核表达系统中纯化得到的GRK5相近。     

G蛋白偶联受体激酶2与肿瘤的关系及其调节机制研究进展

G蛋白偶联受体激酶2(GRK2)是一种多功能蛋白,可通过调节G蛋白偶联受体(GPCR)信号转导,以及通过磷酸化或直接与大量的非蛋白相互作用来充当信号转导枢纽.GRK2可影响细胞增殖生存的级联调节网络,调控细胞代谢网络的关键途径,肿瘤细胞内的血管生成和炎性反应也与其有关.此外,GRK2还可与多种非GPCR及非受体底物(包...     

G蛋白和G蛋白偶联受体

对近年来Ｇ蛋白和Ｇ蛋白偶联受体的研究进行了综述。着重阐明了Ｇ蛋白及其偶联受体的结构和功能。通过建筑Ｇ蛋白偶联受体的三维结构模型来研究受体与配基的相同作用,从而设计合成有效化合物。同时,在研究新药时,不仅要研究与Ｇ蛋白偶联受体相关的药物,而且要考虑Ｇ蛋白抑制剂或激动剂以及与效应器有关的药物,这样有可能提高设计命中率。     

G蛋白偶联受体激酶2对EGF诱导的cAMP生成的调控

目的研究G蛋白偶联受体激酶2（G protein-coupled receptor kinase 2,GRK2）对表皮生长因子（Epidermal growth factor,EGF）诱导cAMP生成的调控作用及其可能的机制.方法用放射免疫竞争法测定EGF刺激前后细胞内cAMP浓度.用免疫共沉淀的方法检测GRK2与EGF受体（EGF receptor,EGFR）的相互作用.结果（1）EGF刺激使HEK293细胞内第二信使cAMP的浓度显著升高,约是Forskolin刺激诱导的cAMP浓度升高的30%～40%.而过表达GRK2后,EGF刺激诱导的cAMP的浓度升高仅为Forskolin刺激诱导的cAMP浓度升高的不足10%（P＜0.01）,说明过表达GRK2能显著抑制EGF刺激的cAMP的生成.（2）免疫共沉淀实验的结果显示EGF刺激后,EGFR受体免疫沉淀复合物中检测到大量GRK2,说明EGF刺激能诱导EGFR-GRK2复合物的形成.结论GRK2对EGF刺激诱导的第二信使cAMP生成有负反馈调控作用,这种调控作用可能是通过EGF刺激的GRK2与EGFR的相互作用来实现的.     

海鞘G蛋白偶联受体激酶cDNA的克隆

目的 从海鞘体内分离可能存在的编码G蛋白偶联受体激酶（GRK）的cDNA克隆，确定其分子特征、研究其转录产物表达情况。方法 采用逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）、序列分析、3‘RACE等方法。结果 得到了海鞘的一种GRKcDNA克隆，将其命名为Ci-GRK1。从序列分析及分子遗传分析的结果可以看出Ci-GRK1与人类GRK5的同源性最高，其次是果蝇GRK2。Ci-GRK1mRNA在海鞘胚胎发育的整个过程及其在幼虫体内均有表达。结论 Ci-GRK1有可能在海鞘胚胎发育中起着非常重要的作用。     

免疫性肝纤维化大鼠肝组织G蛋白偶联受体激酶2的表达

目的 探讨G蛋白偶联受体激酶2(GRK2)在猪血清诱导的免疫性肝纤维化模型中表达的变化及其意义.方法 Wistar大鼠腹腔注射猪血清建立免疫性肝纤维化模型,在造模的第0、3、6、9、12、16周不同时间点采用Masson染色对肝脏组织作病理检查;免疫组化染色法、蛋白免疫印迹法检测肝脏中GRK2表达水平的变化.结果 大鼠腹腔注射猪血清在16周时可以成功建立免疫性肝纤维化模型.与正常大鼠相比,免疫性肝纤维化大鼠肝脏中GRK2的表达量随造模时间的延长而明显降低.结论 免疫性肝纤维化大鼠肝脏中GRK2表达水平下调,提示GRK2可能在免疫性肝纤维化过程中发挥重要作用.     

G蛋白偶联受体结构的多样性

G蛋白偶联受体（G-protein-coupled receptors,GPCRs）是具有7个跨膜螺旋的受体,是迄今发现的最大的超家族受体,其成员有上千种,它是极为重要的药物靶点。了解它们精细结构的多样性和复杂性将有助于研究其对生理和病理方面的影响,同时,也大大提高结构依赖性药物设计的针对性。近年来,随着研究GPCRs结构的手段的发展,使得GPCRs结构的解析工作取得可喜的进展,为解析更多的GPCRs精细结构和相关药物研发奠定重要基础。     

美托洛尔对高龄老年慢性心衰患者外周血淋巴细胞GRK2表达的影响

目的 观察受体阻滞剂对高龄老年慢性心衰患者外周血淋巴细胞GRK2表达的影响.方法 选取80岁以上慢性心衰患者32例,随机分为两组:对照组和美托洛尔组.对照组行常规治疗,美托洛尔组在常规治疗基础上应用美托洛尔,共8周.治疗前后行心脏超声检查,并分别抽取外周血2ml,分离淋巴细胞,提取RNA,检测GRK2 mRNA的表达.结果 两组心脏超声各项指标无明显差异,但美托洛尔组外周血淋巴细胞GRK2 mRNA的表达明显低于对照组.结论 高龄老年慢性心衰患者经美托洛尔短期治疗后,虽未改善心脏射血分数等指标,但明显降低心衰患者外周血淋巴细胞GRK2 mRNA的表达.     

佐剂性关节炎大鼠脾脏组织GRK2免疫荧光法建立

建立了适合佐剂性关节炎大鼠脾脏组织G蛋白偶联受体激酶2(GRK2)免疫荧光测定法.考察了免疫荧光测定的4个关键条件:①渗透剂Triton X-100的影响;②不同抗原修复液:柠檬酸缓冲液和pH 9.0乙二胺四乙酸(EDTA)缓冲液的影响;③5％胎牛血清封闭不同时间(20、30、40、50min)的影响;④不同一抗浓度(1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶500)的影响.实验结果显示,Triton X-100通透增强了抗原的表达;1∶100的一抗浓度对荧光信号强度最合适;封闭50 min能显著去除背景非特异性染色;柠檬酸缓冲液优于pH 9.0 EDTA缓冲液,提高了抗原表达.     

苯磺酸氨氯地平抑制高糖诱导的H9C2细胞凋亡研究

目的 利用细胞实验探讨高糖培养对H9C2细胞凋亡的影响,并探讨苯磺酸氨氯地平的保护作用.方法 体外培养大鼠心肌细胞H9C2,分为5 mmol/L糖培养组(G1)、25 mmol/L糖培养组(G2)、50 mmol/L糖培养组(G3)和25 mmol/L糖培养组加钙离子通道抑制剂络活喜保护组(G2+N)、50 mmol/L糖培养组加络活喜保护组(G3+N)5组,每组分设48 h(a)、72 h(b)培养两个亚组共10组.AnnexinV/PI结合流式细胞仪检测细胞凋亡率,荧光染色观察[Ca2十]i.结果 细胞凋亡率随着高糖刺激时间和高糖浓度的增加而逐渐增高,加络活喜组细胞的凋亡率显著降低(P＜0.05).G2、G3组单细胞平均[Ca2+]i活性测定荧光值均较G1组升高(P＜0.05);G2+N、G3+N组单细胞平均[Ca2+]i活性测定荧光值分别较G2、G3组降低(P＜0.05).各a、b亚组间单细胞平均[Ca2+]i活性测定荧光值差异无统计学意义(P＞0.05).结论 高糖培养H9C2细胞可增加[Ca2+]i从而导致细胞凋亡,苯磺酸氨氯地平可抑制Ca2内流从而抑制细胞凋亡.     

不同CYP2C9基因型的2型糖尿病患者服用磺脲类药物的比较

目的：探讨不同CYP2C9基因型的2型糖尿病服用磺脲类药物后的达标情况.方法：对283例2型糖尿病患者进行CYP2C9基因型检测,检测出CYP2C9＊1/＊1野生型个体及CYP2C9＊1/＊3突变型个体.入选患者分成CYP2C9＊1/＊1野生型组和CYP2C9＊1/＊3突变型组,所有患者均单独使用磺脲类药物治疗（使用的磺脲类药物包括格列美脲2 mg、格列齐特缓释片30 mg、格列吡嗪5 mg）.比较两组患者治疗前、治疗后3个月末及6个月末的空腹血糖（FPG）、餐后2 h血糖（2HPG）和糖化血红蛋白（GHbA1c）达标情况.结果：CYP2C9＊1/＊3突变型组患者[治疗后6个月空腹血糖（6.27±0.62）mmol/L、GHbA1c（6.46±0.62）mmol/L]比CYP2C9＊1/＊1野生型组患者[治疗后6个月空腹血糖（7.04±0.97）mmol/L、GHbA1c（6.96±0.68）mmol/L]具有更高的达标率.结论：在治疗前检测2型糖尿病患者的CYP2C9基因型,能指导选择治疗方案,对于CYP2C9＊1/＊3突变型个体选用磺脲类药物.在避免低血糖发生的情况下可更有效控制患者的空腹血糖（FPG）、餐后2 h血糖（2HPG）和糖化血红蛋白（GHbA1c）的水平.     

2型糖尿病人群中PSMD9基因多态性与血糖和高血压的相关性

目的分析蛋白酶调解因子9（PSMD9）基因的IVS3+nt460A＞G、IVS3+nt437T＞C、E197GA＞G3个单核苷酸多态性（SNP）位点的多态性与2型糖尿病（T2DM）及T2DM合并高血压（HTN）之间的关系,探讨其作为国人T2DM合并高血压分子标记物的可能性。方法采用直接测序法检测研究对象PSMD9基因的IVS3+nt460A＞G、IVS3+nt437T＞C、E197GA＞G3个SNP位点的多态性,包括T2DM无高血压患者50例（T2DM组）、原发性高血压血糖正常患者50例（HTN组）、T2DM合并高血压患者100例（T2DM-HTN组）以及健康对照者50例（NC组）,并测定血压、空腹血糖及糖化红蛋白。结果PSMD9IVS3nt460A＞G、IVS3+nt437T＞C和E197GA＞G3个位点基因型均符合HardyWeinberg平衡,表明本研究具有群体代表性。连锁不平衡检验结果显示这3个SNP位点之间存在连锁不平衡现象,其中IVS3nt437和IVS3nt460两个SNP位点完全连锁不平衡(D''=1.00,r2=1.00,P＜0.01),E197G与IVS3nt437和IVS3nt460之间存在很强的连锁不平衡(D''=0.96,r2=0.88,P＜0.01)。PSMD9基因IVS3+nt460A＞G、IVS3+nt437T＞C、E197GA＞G3个SNP位点与血糖、高血压均无关,但PSMD9基因的A/T/G单倍型与血糖存在关联,而且与国人的T2DM合并高血压呈正相关。结论PSMD9的IVS3+nt460A＞G、IVS3+nt437T＞C、E197GA＞G3个SNP位点多态性与T2DM患者的血糖及T2DM合并高血压的发病相关,因此,PSMD9可以作为T2DM合并高血压的一个候选基因来研究。     

扫描式葡萄糖监测系统在2型糖尿病患者血糖和饮食管理中的应用研究

目的探讨扫描式葡萄糖监测系统对2型糖尿病血糖控制和饮食控制的影响。方法选取2018年2～10月就诊的2型糖尿病患者64例,将患者随机分成研究组与对照组,其中研究组32例,采用扫描式葡萄糖监测系统进行血糖监测,对照组32例,采用常规血糖检测仪。在筛选访视和第3个月随访时收集并完成患者相关资料采集。结果研究组血糖波动最大幅度、血糖漂移幅度均值及低血糖发生例次均小于对照组(P0.05);研究组患者血糖达标天数高于对照组(P0.05);研究组患者的血糖自我监测行为得分明显高于对照组(P0.05);3个月随访时,研究组患者的TG、TC、HDL-C、LDL-C低于对照组(P0.05)。结论扫描式葡萄糖监测系统可便捷、及时的监测血糖,提高患者血糖自我监测的积极性与参与度,并通过血糖监控结果及时调整饮食结构,是2型糖尿病患者血糖监测和管理的有效手段。     

黄精对2型糖尿病胰岛素抵抗大鼠葡萄糖转运蛋白-4基因表达的影响

目的观察黄精水提液对2型糖尿病(T2DM)胰岛素抵抗大鼠肌肉组织葡萄糖转运蛋白-4(GLUT-4)基因表达的影响。方法采用小剂量链脲佐菌素加高脂高热量饲料喂养方法建立2型糖尿病胰岛素抵抗模型,将造模大鼠随机分为模型对照组和黄精高、中、低剂量治疗组(分别灌胃10.0、5.0、2.5 g·kg-1·d-1),另选10只为正常对照组。灌胃8周后,空腹取材,反转录-聚合酶链反应法检测肌肉组织GLUT-4基因mRNA水平。结果与正常对照组相比,模型对照组及黄精高、中、低剂量治疗组大鼠GLUT-4基因mRNA表达减少,空腹血糖(FPG)显著升高,差异均有统计学意义(P<0.01)。与模型对照组比较,黄精高、中、低剂量治疗组FPG均降低,其中以中、高剂量治疗组降低显著,差异有统计学意义(P<0.01);黄精高、中、低剂量治疗组GLUT-4基因mRNA表达均增高,其中以中、高剂量治疗组增高显著,差异有统计学意义(P<0.01)。结论黄精水提液具有增强T2DM胰岛素抵抗大鼠GLUT-4基因表达,从而降低血糖的作用。     

醛固酮对H9C2细胞胶原表达的影响

目的 探讨醛固酮对H9C2细胞胶原表达的影响.方法 以培养的H9C2细胞为模型,观察100nM醛固酮刺激H9C2细胞后0、1、3、6、12、24及48 h后盐皮质激素受体、转化生长因子β、结缔组织生长因子、Ⅰ型和Ⅲ型胶原的表达情况.结果 免疫印记检测可见醛固酮刺激H9C2细胞3h开始,盐皮质激素受体表达增高,6 h达高峰.Real-time PCR检测结果显示,醛固酮刺激后,转化生长因子β和结缔组织生长因子的表达在6h开始增高,12h达高峰.Ⅰ型和Ⅲ型胶原的表达在6 h开始增高,24h达高峰.与空白对照组相比差异有显著性(P＜0.05).结论 醛固酮刺激H9C2细胞后,通过与盐皮质激素受体结合后促进转化生长因子β和结缔组织生长因子的表达进而促进胶原表达.     

动态血糖监测研究2型糖尿病强化治疗中的血糖漂移

目的通过动态血糖监测系统(CGMS)研究2型糖尿病(T2DM)强化治疗过程中低血糖发生的特征。方法①将研究对象分为胰岛素治疗组、磺脲类治疗组和诺和龙治疗组;②用CGMS对66例T2DM患者于血糖稳定后进行72h血糖监测,其间监测指端血糖谱并输入CGMS以校正,根据血糖测定图谱观察各组低血糖发生的特征。并对每一患者抽血检测升糖相关激素,比较低血糖发生时与非低血糖时升糖相关激素的异同。结果①各组低血糖多于11∶00~12∶00、21∶00~5∶00发生,最多见于2∶00。②餐后3h血糖较餐后2h较好的预测低血糖的发生。③发生低血糖时,升糖相关激素变化不明显。④磺脲类治疗组较胰岛素治疗组、诺和龙治疗组低血糖发生率明显升高。结论CGMS能及时准确地发现低血糖,了解低血糖的影响因素及低血糖后的反应,以指导临床治疗,制定针对性的治疗方案。     

Inhibitory effects of high glucose/insulin environment on osteoclast formation and resorption in vitro

Patients with type 2 diabetes mellitus (T2DM) exhibit hyperglycemia and hyperinsulinemia and increased risk of fracture at early stage, but they were found to have normal or even enhanced bone mineral density (BMD). This study was aimed to examine the molecular mechanisms governing changes in bone structure and integrity under both hyperglycemic and hyperinsulinemic conditions. Monocytes were isolated from the bone marrow of the C57BL/6 mice, induced to differentiate into osteoclasts by receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand (RANKL) and macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) and exposed to high glucose (33.6 mmol/L), high insulin (1 μmol/L), or a combination of high glucose/high insulin (33.6 mmol/L glucose and 1 μmol/L insulin). Cells cultured in α-MEM alone served as control. After four days of incubation, the cells were harvested and stained for tartrate resistant acid phosphatase (TRAP). Osteoclast-related genes including RANK, cathepsin K and TRAP were determined by using real-time PCR. The resorptive activity of osteoclasts was measured by using a pit formation assay. Osteoclasts that were derived from monocytes were of multinucleated nature and positive for TRAP, a characteristic marker of osteoclasts. Cell counting showed that the number of osteoclasts was much less in high glucose and high glucose/high insulin groups than in normal glucose and high insulin groups. The expression levels of RANK and cathepsin K were significantly decreased in high glucose, high insulin and high glucose/high insulin groups as compared with normal glucose group, and the TRAP activity was substantially inhibited in high glucose environment. The pit formation assay revealed that the resorptive activity of osteoclasts was obviously decreased in high glucose group and high glucose/high insulin group as compared with normal group. It was concluded that osteoclastogenesis is suppressed under hyperglycemic and hyperinsulinemic conditions, suggesting a disruption of the bone metabolism in diabetic patients.