PEP-1-VP3融合蛋白的分离纯化与初步鉴定

目的构建融合蛋白PEP-1-VP3的原核表达质粒,并进行诱导表达和蛋白纯化。方法通过PCR方法自PGEX-6P-1/TAT-VP3质粒中扩增VP3基因,运用靶向克隆酶,将VP3基因插入到线性载体p ET15b-PEP-1中,构建重组表达质粒p ET15b-PEP-1-VP3,经测序证实构建成功后转化E.coli Rosetta,表达PEP-1-VP3融合蛋白,经Ni-NTA树脂亲和层析,进行SDS-PAGE及Western Blot分析鉴定。结果成功构建PEP-1-VP3融合蛋白原核表达载体,表达并纯化了17.6k D的PEP-1-VP3融合蛋白。结论所构建的PEP-1-VP3融合蛋白为体内抗肿瘤研究提供了理论基础。     

小鼠p27~(kip1)真核表达载体的构建及其对单个核细胞周期的影响

目的构建小鼠p27kip1真核表达载体,探讨其对单个核细胞生长情况和细胞周期的影响,为进一步研究p27kip1在疾病防治中的作用奠定基础。方法将小鼠p27kip1基因克隆至pcDNA3.0真核表达载体上,并经脂质体介导转染至小鼠单个核细胞中,应用MTT法和流式细胞仪分析转染细胞生长情况和细胞周期。结果经酶切分析和测序鉴定,成功构建了小鼠pcDNA3.0/p27kip1重组质粒;经pcDNA3.0/p27kip1转染的单个核细胞中p27蛋白表达增多,其生长增殖不仅受到明显抑制,而且处于G1/G0期的细胞明显增加,处于S期的细胞明显减少。结论构建的pcDNA3.0/p27kip1真核表达载体能够在单个核细胞中表达,且高表达的pcD-NA3.0/p27kip1可以通过抑制细胞周期的方式抑制单个核细胞的生长。     

人神经前体细胞分化过程中p27~(Kip1)的作用及其调节机制研究

目的研究视黄酸(RA)诱导人神经前体细胞(hNPCs)分化的过程中,细胞周期调节蛋白p27Kip1的变化及其调节机制,以掌握hNPCs的增殖分化特性。方法取原代hNPCs体外培养,在细胞进入对数生长期时给予RA诱导,在诱导d3、5、7收集细胞,用流式细胞分析术观察细胞周期的变化、用Westernblot法观察p27Kip1及其相关的细胞周期调节蛋白p21Cip1、cdk2的变化,以及参与p27Kip1泛素-蛋白酶降解途径的重要因子skp2的变化。结果RA诱导d3,hNPCs细胞G0/G1期的比例由诱导前的65.20%上升至80.72%;而S期的比例由诱导前的28.39%下降到8.62%;p27Kip1蛋白表达在RA诱导d3增加,并在d5达到高峰;p21Cip1和cdk2的表达在RA诱导前后变化不明显,但反映cdk2活性的p-cdk2蛋白的表达在RA诱导后明显下降;skp2的表达在RA诱导后明显下降。结论在RA诱导hNPCs分化的过程中,p27Kip1蛋白泛素降解途径受阻,致使其含量增加,并通过抑制cdk2的活性而发挥了促进hNPCs分化的作用。     

pTAT-XIAP融合蛋白的原核表达及纯化

目的将X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)插入质粒pTAT-HA,构建pTAT-XIAP原核表达载体,以获得高产量、高纯度的pTAT-XIAP融合蛋白。方法将pTAT-XIAP融合蛋白表达载体转入大肠杆菌BL21plysS,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导融合蛋白表达,产物经镍离子亲和层析柱(Ni-NTA)亲和层析纯化,并用Western blot方法鉴定。结果 pTAT-XIAP融合蛋白在大肠杆菌中获得表达,纯化后蛋白呈单一条带,表达产物经Western blot分析证实目的蛋白表达。结论构建重组融合表达载体,在大肠杆菌中成功表达并纯化pTAT-XIAP融合蛋白。     

人TIMP-2基因的克隆及其原核表达

目的 构建人TIMP-2重组表达载体,并在大肠杆菌BL21 (DE3)中表达.方法 提取人肝癌细胞(Hep G2)总RNA后,经RT-PCR扩增获得目的片段,插入克隆载体pMD18-T;酶切鉴定和测序后将TIMP-2导入原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组质粒pGEX-TIMP-2.将重组质粒转化至大肠杆菌菌株BL21 (DE3)中,IPTG诱导融合蛋白表达后用SDS-PAGE电泳检测并用western blot验证(蛋白质印迹法).结果 成功构建原核重组表达载体pGEX-TIMP-2,并在原核宿主BL21中大量表达融合蛋白GST-TIMP-2.结论 克隆人TIMP-2基因并在原核生物中大量表达.     

依那普利拉对新生鼠心室成纤维细胞增殖的影响

目的观察血管紧张素Ⅰ转换酶抑制剂(angiotensinⅠ converting enzyme inhibitor,ACEI)依那普利拉(enalaprilat,Ena)对血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)诱导的心肌成纤维细胞(CFb)增殖及其对细胞周期蛋白的影响,探讨Ena抗CFb增殖的机制。方法以培养的新生Wistar大鼠乳鼠CFb为实验模型,实验分为对照组、AngⅡ组、用药3个剂量组,采用胰酶消化、差速贴壁法培养CFb,四氮唑盐(MTT)比色法检测CFb增殖;羟脯氨酸法测定胶原量;流式细胞仪、免疫细胞荧光染色法、免疫印迹法测定细胞周期和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p27kip1(cyclin dependent kinase inhib-itor,CKI)表达。结果Ena能够抑制AngⅡ诱导的CFb增殖(P<0·01,P<0·05),降低羟脯氨酸含量(P<0·01,P<0·05),提高细胞周期抑制蛋白p27kip1表达(P<0·01,P<0·05)。结论Ena能够通过提高p27kip1含量抑制AngⅡ诱导的CFb增殖。     

牛磺酸对心肌成纤维细胞细胞周期的影响及其机制的研究

目的研究牛磺酸(taurine,Tau)对血管紧张素Ⅱ(an-giotensinⅡ,AngⅡ)诱导的新生大鼠心肌成纤维细胞(cardiacfibroblast,CFb)增殖的抑制作用,并初步探讨其作用机制。方法用AngⅡ诱导新生大鼠CFb增殖,建立心肌纤维化模型,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞增殖;羟脯氨酸测定检测胶原含量;流式细胞仪检测细胞周期及细胞周期蛋白依赖性激酶抑制物p27的变化;免疫细胞化学法测定细胞周期调控蛋白D(cyclin D)及p27蛋白的含量。结果Tau(40、80、160mmol.L-1)可明显抑制AngⅡ诱导的CFb增殖与胶原合成,同AngⅡ组比较差异有显著性(P<0.05或P<0.01),且呈现剂量依赖性。流式细胞仪检测表明Tau在80、160mmol.L-1可促进p27的蛋白表达;细胞G0/G1期百分率随Tau浓度增加而增加,S期细胞百分率随Tau浓度增加而减少,与AngⅡ组相比差异有显著性(P<0.05或P<0.01)。免疫细胞化学染色结合图像分析系统的分析结果也表明Tau可增加p27的蛋白表达,与AngⅡ组相比差异具有统计学意义(P<0.01)。结论牛磺酸通过促进p27的表达,使细胞周期阻滞于G0/G1期,而抑制CFb增殖和胶原含量的增加。     

谷胱甘肽-S转移酶-中期因子融合蛋白原核表达及多克隆抗体的制备

目的 构建谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和中期因子(MK)融合蛋白的原核表达质粒,并表达和纯化蛋白,制备多克隆抗体.方法 通过RT-PCR技术从人胃癌组织中扩增入MK编码序列,克隆入表达载体pGEX-1λT中,获得表达质粒pGEX-MK,并在大肠杆菌BL21 (DE3)中经IPTG诱导表达,通过亲和层析纯化表达的GST-MK融合蛋白,并以重组蛋白免疫兔子.结果 成功构建了GST-MK融合蛋白的原核表达载体,经诱导表达纯化得到GST-MK融合蛋白.免疫兔子后取多抗血清以间接ELISA检测效价达1∶64 000,Western blotting分析显示多克隆抗血清对MK蛋白特异结合.结论 MK在大肠杆菌中成功表达及其多克隆抗体的获得,为研究MK生物功能奠定了基础.     

青蒿琥酯对人结肠癌SW620细胞增殖、细胞周期及细胞周期素依赖性激酶抑制蛋白的影响

目的观察青蒿琥酯对人结肠癌细胞系SW620细胞增殖、细胞周期及细胞周期素依赖性激酶抑制蛋白(p16、p21、p27)表达的变化,探讨ART可能的作用机制。方法:不同浓度青蒿琥酯作用SW620细胞后,MTT法检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞周期,Westernblot分别检测细胞周期素依赖性激酶抑制蛋白(p16、p21、p27)蛋白变化。结果:在一定浓度范围之内,青蒿琥酯能抑制SW620细胞增殖,细胞周期发生G1—S期阻滞,并上调p21、p27的蛋白、mRNA水平,但对p16的蛋白、mRNA水平没有影响。结论:青蒿琥酯可抑制人结肠癌细胞增殖,其机制与上调p21、p27蛋白有关。     

抗癫痫肽/GST融合表达载体的构建及蛋白表达

目的构建抗癫痫肽(anti-epilepsy peptide,AEP)/GST融合表达载体,原核表达GST-AEP融合蛋白。方法从克隆载体质粒pGEM-T/AEP中双酶切,得到AEP片段;通过中间载体puc18,转换酶位点;最后将AEP基因克隆入表达载体pGEX-4T-1质粒中,构建融合表达载体pGEX-4T-1/AEP;转化感受态大肠杆菌DH5α,经异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,获得GST-AEP融合蛋白;SDS-PAGE分析表达产物,确定蛋白质高表达条件;超声裂解法鉴定蛋白质可容性;凝胶薄层扫描确定蛋白质相对表达量。结果经酶切鉴定、测序证明,AEP基因已正确插入到pGEX-4T-1中,经IPTG诱导后,表达出相对分子质量约为36 000的融合蛋白,该融合蛋白以包涵体形式存在,约占总蛋白质的70%左右。结论pGEX-4T-1/AEP载体构建成功,融合蛋白在大肠杆菌中获得高效表达。     

sCR1在原核中表达、纯化、复性及活性鉴定

目的采用原核表达载体pET28a在E.coli BL21(DE3)中获得高表达、高活性的重组人sCR1融合蛋白。方法从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,将其克隆入原核表达载体pET28a中,构建含人sCR1的重组质粒(pET28a-sCR1),经测序鉴定正确,转化入E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导,表达产物经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,通过Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后进行复性及生物学活性鉴定。结果获得原核表达载体pET28a-sCR1,经PCR鉴定及测序鉴定,得到重组E.coli BL21(DE3)克隆菌株,经IPTG诱导含有pET28a-sCR1的E.coli BL21(DE3)克隆菌,表达出重组人sCR1融合蛋白。此蛋白在SDS-PAGE上表现为Mr大于29000的蛋白区带,在Western blot分析中可被sCR1的CD35单克隆单抗体(mAb)识别。经Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化、复性后得到高纯度的sCR1融合蛋白表达及较高的生物学活性。结论人sCR1融合蛋白在E.coli BL21(DE3)表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原性及其生物学活性。     

重组TGF β1在大肠杆菌中的表达、纯化

目的通过pET 43.1原核表达载体,表达重组人转化生长因子β1(human transform growth fac-tor,rhTGFβ1)。方法将人工整合了肠激酶作用位点的TGFβ1,插入到含有NusA蛋白的融合表达载体pET 43.1中。重组质粒转化大肠杆菌(E.coli)BL21(+)并用IPTG诱导表达。通过镍柱纯化重组蛋白,用Western blot杂交检测重组蛋白的免疫原性,用肠激酶酶切得到TGFβ1单体。结果 SDS-PAGE结果显示,相对分子质量约为70 000的融合蛋白大部分在上清中表达,目的融合蛋白量约占菌体总蛋白量的80%。取超声上清,通过His亲和色谱系统纯化目的融合蛋白,纯度质量分数为95%。肠激酶切割得到TGFβ1单体,经Western blot检测重组蛋白的免疫原性。结论人转化生长因子β1在大肠杆菌中实现了高效表达,获得了具有免疫原性的重组TGFβ1。     

HPV6bL1-TpN15嵌合基因原核表达系统的构建

目的 分别从梅毒螺旋体(Treponema pallidum,Tp)临床菌株和尖锐湿疣(cA)组织中扩增人乳头瘤病毒(HPV)6b型L1和TpN15基因,构建HPV6b L1-TpN15嵌合基因及其原核表达系统.方法 采用PCR分别从CA组织及Tp临床菌株中扩增HPV6b L1和TpN15基因片段,构建HPV6b L1-TpN15嵌合基因,将其克隆入原核表达载体pET32a(+)构建重组质粒pET32a(+)/HPV6b L1-TpN15,经测序鉴定后转化大肠杆菌BL21 (DE3),经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导后表达的融合蛋白用十二烷基磺酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、蛋白质印迹法分析鉴定.结果 HPV6b L1-TpN15融合蛋白在原核表达系统中得到了较高表达.结论 原核表达的HPV6bL1-TpN15融合蛋白具较强的抗原性.     

重组人白细胞介素24蛋白对胰腺癌细胞生长的影响

目的构建人白细胞介素24(IL-24)基因的表达载体并在大肠杆菌中诱导表达,观察纯化后的IL-24融合蛋白导致人胰腺癌细胞(Panc-1)生长抑制的作用。方法用限制性内切酶从质粒pET30b-IL-24中酶切获取人IL-24cDNA片段。并将该片段与pET42a原核表达载体基因重组,在大肠杆菌中实现重组基因的表达,提取并纯化rhIL-24蛋白。用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)和Westernblot对表达产物进行鉴定。以不同浓度的重组蛋白IL-24与胰腺癌细胞Panc-1、正常肝胚细胞CCC-HEL-1共培养48h,同时设立相应浓度梯度的HIS-GST融合蛋白组对照组。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测各组细胞的生长抑制情况。结果酶切结果证实,成功构建了pET42a-IL24原核表达载体,并在大肠杆菌中获得稳定的表达。rhIL-24蛋白以浓度依赖性的关系抑制Panc-1细胞的生长,抑制率明显高于HIS-GST蛋白。结论rhIL-24蛋白对胰腺癌细胞Panc-1生长有抑制作用。     

线虫抗凝血蛋白AcaNAP7基因克隆、表达及抗凝活性鉴定

目的在大肠杆菌中表达犬钩虫线虫抗凝血蛋白NAP7(AcaNAP7)成熟蛋白,并鉴定表达产物的抗凝活性。方法根据AcaNAP7的核苷酸序列设计引物,从克隆质粒pUCm-T/AcaNAP7中扩增编码AcaNAP7成熟蛋白的基因;扩增产物经双酶切定向克隆到原核表达载体PET-32a中;构建的重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达;表达产物经镍琼脂糖凝胶FF纯化后,用凝血酶原时间(PT)和活化的部分凝血活酶时间(aPTT)检测体外抗凝血活性。结果克隆了编码AcaNAP7成熟蛋白的基因并构建了重组表达质粒pET-32a/AcaNAP7;在大肠杆菌BL21(DE3)中高效地表达了融合有硫氧还蛋白(Trx)的目的蛋白,产物主要以可溶形式存在;镍琼脂糖凝胶亲和纯化获得了纯度高达92%的目的蛋白;纯化产物能明显延长PT及aPTT,其延长PT比延长aPTT更有效。结论在大肠杆菌中成功表达了AcaNAP7融合蛋白,表达产物具有抗凝活性。该实验为进一步研究AcaNAP7的功能及应用奠定了基础。     

HPV18E6基因的原核克隆及表达

目的:构建pET32a(+)HPV18E6原核表达质粒并优化其表达条件,探讨喉癌组织中HPV18E6蛋白的表达及意义.方法:应用基因重组技术,构建pET32a(+)与HPV18E6的原核表达重组质粒,采用PCR方法扩增HPV18E6基因,经BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切后插入相同酶切pET32a(+)载体,转化JM109感受态细胞并进行阳性克隆筛选,用限制性内切酶酶切和核酸序列检测方法鉴定重组质粒DNA,将其转入宿主菌E.coli BL21(DE3),用IPTG对重组质粒进行诱导表达,SDS-PAGE及Western blot方法鉴定表达蛋白的分子质量及特异性.结果:成功构建了原核表达质粒Pet32/HPV18E6, 限制性内切酶酶切和核酸序列检测证实重组质粒中插入的是目的基因,其DNA大小、方向、插入位点和阅读框架均正确;HPV18E6蛋白得到高效原核表达,表达HPV18E6的工程菌BL21(DE3)的最佳诱导温度是37 ℃,诱导剂IPTG的浓度为1 mmol/L. 结论:HPV18E6融合蛋白的表达为进一步深入研究HPV18E6蛋白的生物学特性及其致细胞转化的作用机制奠定了基础.     

细胞穿透肽TAT融合小鼠nNOS1-133重组蛋白的表达纯化及药效学研究

目的:表达、纯化有活性的TAT-nNOS1-133重组蛋白,并初步验证其神经保护作用;为开发新神经保护药物提供理论基础。方法:通过PCR、酶切和酶连的方法构建pET28a-TATnNOS1-133重组质粒,并转化入大肠杆菌中表达。表达产物经洗涤、复性、阴离子交换柱(DEAE-52)、超滤纯化并除盐。通过FITC标记目的蛋白评价其能否进入细胞,并通过检测细胞凋亡评价TAT-nNOS1-133对谷氨酸诱导的兴奋性毒性的保护作用。结果:获得了较高纯度的TAT-nNOS1-133重组蛋白,经SDS-PAGE电泳显示相对分子质量在17 kD附近有单一条带,且与理论分子质量一致。TAT-nNOS1-133可以进入神经细胞,并减少了谷氨酸诱导的PI阳性细胞数增多。结论:成功构建了TAT-nNOS1-133的原核表达系统并建立了其分离纯化方案。TAT-nNOS1-133可以进入细胞并且减轻了脑卒中病理模型谷氨酸诱导的兴奋性毒性。     

霍乱毒素B亚单位与p277融合基因在大肠杆菌中表达及免疫分析

为了增强多肽表位的免疫原性,构建了霍乱毒素B亚单位(Cholera toxin B subunit,CTB)和p277的融合基因CTB-p277,将该融合基因克隆到pET28a( )中,获得原核表达载体pET28a-CTB-p277;并将该质粒转入大肠杆菌菌株BL21(DE3)中;重组菌株经2%的乳糖诱导5 h后的表达产物用12%的SDS-PAGE分析表明可以表达融合蛋白,融合蛋白占全菌蛋白约40%,且主要以包含体的形式存在。包含体经洗涤、裂解,用DEAE纤维素离子交换纯化,可以获得99.1%的重组蛋白。重组蛋白的包含体经复性后,在体外可以自组装成五聚体。重组蛋白免疫KK-Ay小鼠后,ELISA的分析表明可以产生抗p277的抗体。血糖和体重的测定结果显示,给药组小鼠的血糖有明显的降低,体重也有相应的减轻。同时GM1-ELISA的检测表明,CTB-p277在体外可以和神经节苷脂GM1(Monosialoganglioside)特异结合,具有生物活性。     

异源性Th表位修饰的CTLA4-Ig—msBlys构建及融合蛋白表达

目的构建异源性Th表位修饰的CTLA4-Ig-msBlys的原核表达质粒,并在EcoliBL21中诱导融合蛋白表达,初步检测蛋白特性。方法采用PCR法从质粒pCMV-sBlys扩增sBlys片段,将与卵清蛋白（ovalbumin,OVA）Th表位重组后的msBlys连接CTLA4-Ig片段,克隆入pGEX-KG原核表达载体,用LB固体培养基抗生素筛选、酶切并经琼脂糖凝胶电泳鉴定;将质粒pGEX—KG-CTI。A4-Ig—msBlys转入E．coliBL21菌株中,实现插入基因的融合表达,用SDS-PAGE和Western-blot检测表达产物。结果pGEX—KG—GTLA4-Ig—msBlys构建正确且最终转人E．coliBL21,得到融合蛋白的表达;CTLA4-Ig-msBlys融合蛋白在E．coli中获得表达,表达产物的相对分子质量同预期值一致。结论成功构建原核表达质粒pGEX-KG-CTLA4-Ig-msBlys,并在E．coliBL21表达CTLA4-Ig-msBlys融合蛋白,为下一步探讨Blys在自身免疫性疾病患者的治疗作用奠定了基础。     

一种新穿膜肽的构建、表达及其活性检测

通过对穿膜肽TAT-PTD构效关系的分析和结构改造，构建能有效进入血脑屏障且低毒的新穿膜肽。该研究用分子克隆技术构建出表达型载体pET28a—T1-GFP，重组质粒在大肠杆菌Ecoli BL21（DE3）中表达融合蛋白His-T1-GFP，经组氨酸亲和层析纯化后，用荧光显微镜和免疫组化的方法来检测His—T1-GFP在活体动物小白鼠体内的跨膜递送作用。经测序证实成功构建了表达型载体pET28a—T1-GFP，融合蛋白His—T1-GFP在大肠杆菌EcoliB L21（DE3）中表达率为20％。经组氨酸亲和纯化，得到纯度达85％的融合蛋白。SDS-PAGE和Western Blotting显示纯化蛋白为His-T1-GFP，动物实验表明融合蛋白His—T1-GFP能够有效跨过血脑屏障，主要分布在大脑皮层和海马回。该研究成功地构建了-种新的穿膜肽-T1，为其携带有生物活性的大分子物质到达脑部进行蛋白治疗奠定了基础。