mdr-1基因转染的骨髓细胞对大剂量MMF治疗的耐受性研究

目的检测转染多药耐药基因-1(multidrug resistance gene-1,mdr-1)的骨髓细胞能否耐受大剂量霉酚酸脂(mycophenolate mofetil,MMF)的杀伤作用,为体内实验提供依据。方法将重组腺病毒Ad-EGFP-mdr-1转染大鼠骨髓细胞。RT-PCR法和Western blot法检测mdr-1 mRNA及蛋白的表达水平;柔红霉素排出试验检测转染mdr-1基因后的骨髓细胞有无功能表达;MTT法检测不同浓度MMF处理后转染mdr-1基因骨髓细胞的存活情况。结果骨髓细胞病毒转染率为30.14%,存活率为89.25%;转染后骨髓细胞mdr-1的mRNA及蛋白质水平都存在功能性表达;导入的mdr-1表达产物P-gp有药物外排泵功能;不同剂量的MMF处理后,转染mdr-1基因的骨髓细胞存活率没有明显差异(P>0.05)。结论转染mdr-1的大鼠骨髓细胞能有效耐受超大剂量MMF治疗。     

纳米微粒介导反义寡脱氧核苷酸逆转乳腺癌细胞多药耐药的实验研究

目的 探讨纳米微粒介导耐药基因mdr-1、mrp反义寡脱氧核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide,ASODN)转染对多药耐药乳腺癌MCF-7/ADR细胞的影响.方法 采用纳米微粒介导mdr-1、mrp-ASODN转染耐药细胞株MCF-7/ADR,RT-PCR、Western blot检测转染48 h后细胞耐药基因mdr-1、mrp的表达;MTT法检测经转染后MCF-7/ADR细胞对阿霉素(ADR)、表柔比星(epimbicin)、5-氟脲嘧啶(5-FU)和紫杉醇(paditaxel)的敏感性.结果 纳米微粒介导mdr-1、mrpASODN转染48 h后,MCF-7/ADR细胞的mdr-1、mrp在mRNA和蛋白质表达水平上均显著降低(P<0.05);细胞对ADR、表柔比星、5-氟脲嘧啶和紫杉醇的耐药指数均显著降低(P<0.05).结论 耐药基因反义寡脱氧核苷酸能在体外抑制耐药基因的表达,从而提高细胞的药物敏感性;纳米微粒具有较好的体外介导反义寡脱氧核苷酸转染效果.     

小干扰RNA诱导人卵巢癌细胞MDR1基因沉默的研究

目的 采用RNA干扰技术逆转人卵巢癌OVCAR8/TR细胞中多药耐药基因,探讨该技术能否有效地抑制多药耐药基因MDR1的表达,降低该基因编码的糖蛋白P-gp的水平.方法 设计合成针对MDR1的小片段RNA(siRNA),将合成的siRNA用脂质体转染具有多药耐药基因MDR1高表达的人卵巢癌泰素耐药细胞株OVCAR8/TR,用荧光定量RT-PCR检测转染后不同时间点MDR1的mRNA的变化,流式细胞仪定量测定转染后不同时间点P-gp表达的情况.结果 MDR1的siRNA转染细胞48 h基因的抑制达最高,转染的第5 d回到正常水平.阴性对照组mRNA的量与未转染组的mRNA的量差异无统计学意义.P-gp在转染后的72 h其抑制最强,至第5 d时恢复接近正常水平,阴性对照组蛋白表达与未转染组的蛋白表达差异无统计学意义.结论 siRNA能够有效地抑制多药耐药基因MDR1的mRNA和P-gp的表达,为逆转卵巢癌的多药耐药带来了新的希望.     

逆转录病毒转染法建立耐药性大鼠CRBH-7919细胞系

目的:建立高效、稳定的大鼠CRBH-7919多药耐药细胞系.方法:利用逆转录病毒转染法将带有mdr1 cDNA全序列的逆转录病毒载体pHaMDR转入到大鼠CRBH-7919细胞中,MTT法检测细胞系在不同化疗药物作用下的存活率;免疫组化检测细胞的P-糖蛋白(P-GP)表达,RT-PCR检测细胞内mdr1 mRNA的表达量,PCR检测mdr1基因转移到细胞内的基因片段.结果:转基因的细胞系对阿霉素、丝裂霉素的耐药性分别提高 9和7.9倍,免疫组化见转基因细胞系P-GP表达增加,RT-PCR示细胞内mdr1 mRNA的表达量增加,PCR表明转基因细胞内扩增出mdr1片段.结论:利用逆转录病毒转染法成功建立了大鼠CRBH-7919多药耐药细胞系,该细胞系具有耐药强度高、耐药性稳定等特点.     

RNA干扰逆转白血病细胞耐药性的研究

目的 用RNA干扰技术下调白血病耐药细胞系K562/A02多药耐药基因mdr1的表达以逆转白血病对化学药物的耐药性.方法 针对mdr1基因已知mRNA序列不同位点,选择两条靶序列,构建靶向mdr1 shRNA真核表达载体,脂质体介导转染白血病耐药细胞株K562/A02.实时荧光定量RT-PCR检测mRNA表达,Western blot检测细胞膜P-gp表达,柔红霉素泵出试验检测P-gp外排泵功能,MTT法检测细胞对阿霉素的敏感性.结果 构建了二条针对mdr1基因的shRNA真核表达载体,分别下调mdr1 mRNA的表达89.74%和87.18%,降低细胞膜P-gp表达,使膜外泵功能明显下降,柔红霉素在细胞内贮留明显增多,60min 时柔红泵出率为13.16%、22.02%,对照组为40.44%、45.31%,对阿霉素药物敏感性的相对逆转率为84.36%和76.69%.结论 RNA干扰技术可有效逆转mdr1所致耐药.     

人多药耐药基因1(mdr1)的克隆及重组腺病毒制备

目的:构建表达多药耐药基因1(MDR1)的重组腺病毒表达系统.方法:用基因工程技术将多药耐药基因1的cDNA亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,然后在细菌内与pAdEasy同源重组,经脂质体转染293细胞包装、扩增腺病毒颗粒.将重组腺病毒Ad5-mdr1感染小鼠单个核细胞,通过荧光显微镜及流式细胞仪进行检测.结果:酶切鉴定及PCR结果证明多药耐药基因重组腺病毒载体构建成功,构建的人多药耐药基因1(mdr1)重组腺病毒载体的效价达到8.3×1011 pfu/ml.对小鼠单个核细胞的感染效率可达10%～15%,转染小鼠单个核细胞细胞48h后,可检测到mdr1基因的表达.结论:成功构建了表达多药耐药基因1的重组腺病毒载体,为后续对mdr1的相关研究创造了条件.     

三羟异黄酮对人乳腺癌耐药细胞mdr-1、HER2/neu表达的影响

目的研究三羟异黄酮(Genistein,GEN)对体外培养人乳腺癌MCF-7/ADM耐药细胞中mdr-1、HER2/neu基因及蛋白表达的影响,探讨其逆转多药耐药机制。方法采用MTT法检测GEN作用MCF-7/ADM细胞后的细胞增殖抑制率(IR)和半数抑制浓度(IC50);RT-PCR法检测MCF-7/ADM细胞经不同浓度阿霉素(ADM)、GEN及GEN联合ADM处理后,其mdr-1、HER2/neu mRNA表达的变化;Western blot检测其对c-erbB2蛋白及P-糖蛋白(P-gp)的影响。结果 GEN对MCF-7/ADM细胞生长抑制作用明显,其抑制效应呈时间-剂量依赖性,特别是GEN浓度增加到60μg/mL时,对细胞抑制作用急剧升高(P<0.01)。MCF-7/ADM细胞中有mdr-1、HER2/neu过量表达,经GEN单独及联合ADM作用后,HER2/neu mRNA表达明显下调,c-erbB2蛋白出现一致性的表达下调,但对mdr-1mRNA及P-gp无影响。结论人乳腺癌MCF-7/ADM细胞耐药性与耐药基因及原癌基因的高表达相关,GEN能下调MCF-7/ADM细胞HER-2/neu基因及蛋白表达,可能是其逆转MCF-7/ADM细胞多药耐药性的机制之一,但对由P-gp介导的多药耐药无效。     

MDR1基因修饰的自体骨髓移植后体内表达及时限的研究

目的 研究多药耐药基因1(multidrug resistanle gene 1, MDR1)转染的骨髓单个核细胞自体移植后,外源性MDR1基因在骨髓中的功能性表达及时限.方法 体外浓缩病毒上清转染法将MDR1基因导入兔骨髓单个核细胞;经大剂量环磷酰胺化疗预处理后,将转染的骨髓单个核细胞行自体骨髓移植;采用PCR法、免疫组织化学法和柔红霉素(daunorubicin, DNR)排出试验检测MDR1基因在受体骨髓中的整合及功能性表达.结果 自体骨髓移植后1～4个月,PCR法检测到外源性MDR1基因在骨髓细胞基因组中的整合;免疫组化法测得骨髓单个核细胞中P-gp阳性率分别为9.5%、8.5%、6.0%、3.5%;柔红霉素排除试验检测到定植的MDR1基因能功能性的表达.结论 转染MDR1基因的骨髓单个核细胞自体移植后,MDR1基因能定植于骨髓中并功能性的表达4个月.     

多药耐药基因RNAi重组腺病毒构建

目的 构建抑制多药耐药基因(MDR1)表达的RNAi腺病毒载体,探讨基因治疗改善癫痫多重耐药现象的可行性.方法 根据大鼠MDR1基因序列,选择3个19nt的靶序列,设计并合成3对66nt含编码短发夹RNA(shRNA)序列的寡核苷酸,构建pSIREN-shuttle-MDR1重组质粒,测序分析正确后转染通过马桑内酯诱导的已表达多重耐药蛋白的大鼠星形胶质细胞,通过RT-PCR法测定多药耐药蛋白(P-gp)表达量,判断所设计的3条DNA序列对于P-gp表达的抑制作用.选择抑制效率最高的1个重组质粒,将其中的MDR1 shRNA表达结构酶切后插入腺病毒载体pAdeno-X,构建的pAdeno-MDR1经Pac1酶切后与脂质体共转染HEK293细胞进行病毒包装扩增纯化,所得病毒液作酶切电泳及测序分析正确后再转染大鼠星形胶质细胞模型.RT-PCR及免疫组织化学法分别测转染前后星形胶质细胞模型的MDR1及P-gp表达量.结果 重组质粒及pAdeno-MDR1病毒经PCR、酶切、测序分析证实构建正确.病毒滴度为6×109 pfu/mL.重组腺病毒转染星形胶质细胞后MDR1及P-gp表达量减少,干扰效率接近100%.结论 成功构建针对大鼠MDR1基因的RNAi腺病毒载体,并通过体外实验证实其对大鼠MDR1基因的高效抑制作用.为进一步探索难治性癫痫的多药耐药机制和基因治疗奠定了基础.     

MCF-7/Adr细胞mdr-1基因启动子甲基化和组蛋白乙酰化状态与多药耐药的关系

目的：分析MCF-7/Adr及MCF-7细胞mdr-1基因启动子甲基化和组蛋白乙酰化状态,初步探讨乳腺癌多药耐药的表观遗传机制。 方法：用甲基化敏感PCR技术检测两个细胞系mdr-1基因启动子甲基化状态。实时定量PCR技术检测DNA甲基转移酶（DNA methyltransferases,DNMTs) mRNA及组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylases,HDACs) mRNA的表达。光密度值法检测组蛋白H3和H4乙酰化水平。 结果：MCF-7细胞mdr-1基因启动子呈现高甲基化,MCF-7/Adr细胞mdr-1基因启动子呈现低甲基化。与MCF-7细胞比较,MCF-7/Adr细胞DNMT1,DNMT3a及DNMT3b mRNA表达显著下降(P＜0.05)。MCF-7/Adr细胞组蛋白H3和H4乙酰化水平较MCF-7细胞明显升高(P＜0.01)。与MCF-7细胞比较,MCF-7/Adr细胞HDAC1,HDAC2,HDAC7及SIRT1 mRNA的表达显著下降(P＜0.01)。 结论：mdr-1基因启动子低甲基化、组蛋白H3和H4高乙酰化、DNMTs mRNA及HDACs mRNA低表达可能是介导MCF-7/Adr细胞MDR形成的重要表观遗传学因素。