血管内皮生长因子受体2小干扰RNA抑制内皮祖细胞血管新生

目的 探讨血管内皮生长因子受体2(vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR-2)在内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)血管新生中的作用.方法 通过VEGFR-2小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)转染EPCs,检测其转染效率与抑制效率,观察EPCs体外血管生成以及迁移能力,并分析其基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9,MMP-9)、丝氨酸/苏氨酸激酶(serine threonine,Akt)、胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)的蛋门表达.结果 VEGFR-2 siRNA能有效并特异地抑制EPCs VEGFR-2的表达;VEGFR-2 siRNA能抑制EPCs的体外血管生成与迁移能力;VEGFR-2 siRNA能抑制EPCs MMP-9的表达与活性,以及Akt与ERK的磷酸化水平.结论 VEGFR-2 siRNA可能通过下调MMP-9、Akt与ERK的表达来抑制EPCs血管新生.     

靶向胆囊癌血管内皮生长因子基因短发夹样RNA表达质粒的构建与筛选

背景：已有研究通过RNA干扰技术,抑制结肠癌、前列腺癌和视网膜母细胞瘤细胞的血管内皮细胞生长因子基因的表达。尚未见关于RNA干扰血管内皮生长因子抑制胆囊癌肿瘤的相关研究。 目的：创新性构建编码胆囊癌血管内皮生长因子基因的短发夹样RNA 质粒表达载体,筛选出沉默血管内皮生长因子基因效果最明显的短发夹样RNA表达质粒。 设计、时间及地点：基因工程观察实验,于2008/2009在中南大学湘雅医院卫生部肝胆肠外科研究中心实验室完成。 材料：人胆囊癌细胞株GBC-SD购于同济大学肿瘤研究所。 方法：设计4对针对血管内皮生长因子基因不同位点的短发夹样RNA片段, 构建携带此短发夹样RNA片段的表达质粒(短发夹样RNA1~4)并行酶切鉴定分析。然后通过脂质体将重组质粒转染到胆囊癌细胞株GBC-SD中,48 h后测定转染率。 主要观察指标：重组质粒酶切鉴定结果。转染效率。采用及荧光PCR检测血管内皮生长因子mRNA表达。 结果：成功构建了靶向血管内皮生长因子基因的短发夹样RNA 质粒表达载体, 其中抑制效果最为明显的短发夹样RNA 质粒表达载体为pDC316-EGFP-U6-shRNA2 质粒。重组质粒经酶切鉴定证实构建成功。质粒在GBC-SD细胞中的转染率约为58.6%。短发夹样RNA抑制血管内皮生长因子基因的mRNA表达,短发夹样RNA2抑制率最高,可达86%。 结论：成功构建并筛选出的靶向血管内皮生长因子的短发夹样RNA表达质粒,其对胆囊癌GBC-SD细胞内的血管内皮生长因子表达具有明显抑制作用。短发夹样RNA2表达质粒抑制作用最明显。     

血管内皮生长因子抗体抑制胶质瘤生长的实验研究

一、材料与方法Ｃ6胶质瘤细胞系购自中国科学院细胞生物学研究所 ,ＳＤ大鼠购自山东医科大学实验动物中心 ,血管内皮生长因子 (ＶＥＧＦ )抗体系美国ＰＨＡＲＭＩＮＧＥＧ公司生产 ,ＦⅧＲＡｇ单克隆抗体系ＤＡＫＯ公司产品。将处于对数生长期的Ｃ6胶质瘤细胞接种于ＳＤ大鼠左下腹皮下 ,每个接种部位注射 0 2ｍｌ,含活细胞数为 1× 1 0 6 个。荷瘤鼠随机分为 4组 ,每组 7只 ,分别为对照组 (ＰＢＳ组 )和 3个实验组 (2 μｇＡｂ、 1 0 μｇＡｂ及50 μｇＡｂ组 )。 3个实验组尾静脉注射ＶＥＧＦ抗体 ,每只每次分别 2 μｇ、 1 0 μｇ及 50 …     

靶向表皮生长因子受体的小分子RNA干扰抑制人脑胶质瘤Notch1表达的实验研究

目的探讨RNA干扰表皮生长因子受体后Notch1在人脑胶质瘤中的表达变化。方法应用免疫组织化学方法检测不同级别脑胶质瘤组织标本中Notch1的表达水平,并进行相关分析。选择人表皮生长因子受体的两个RNA干扰靶序列构建靶向表皮生长因子受体的RNA干扰表达质粒,进行脂质体介导的TJ905人脑恶性胶质瘤细胞系表达;应用荧光定量逆转录-聚合酶链反应仪观察RNA干扰表皮生长因子受体后TJ905人脑恶性胶质瘤细胞系Notch1的表达变化。结果免疫组织化学检测显示,在不同级别胶质瘤组织标本中Notch1的阳性表达率分别为Ⅳ级93.33%(14/15);Ⅲ级92.31%(12/13);Ⅱ级68.42%(13/19)。Ⅱ级阳性表达程度较Ⅲ、Ⅳ级弱,组间差异有高度统计学意义(H=6.944,P<0.01),提示高级别胶质瘤Notch1阳性表达率高于低级别。RNA干扰表皮生长因子受体后,Notch1在TJ905胶质母细胞瘤细胞系中的表达下降(F=578.728,P<0.01):TJ905组与TJ905 空载组相比,差异无统计学意义(P>0.05);TJ905 空载组与TJ905 516组相比,差异有统计学意义(q=6.359,P<0.05);TJ905 516组与TJ905 2400组比较,差异有统计学意义(q=4.501,P<0.05);TJ905组与TJ905 2400组相比差异亦有统计学意义(q=10.015,P<0.05)。责任基因相对表达量,TJ905组和TJ905 空载组均为2.48×10-5,TJ905 516组为6.64×10-6,TJ905 2400组为2.08×10-7。结论表皮生长因子受体与Notch1关系密切,对二者关系的进一步研究可为胶质瘤的基因治疗提供新的思路。     

转染血管内皮生长因子基因的人成骨细胞增殖及其生物学功能

背景：传统的自体或异体骨移植治疗骨缺损都存在难以克服的缺点,基因治疗可能是一种新途径。 目的：观察转染外源性血管内皮生长因子基因的人成骨细胞体外生物学特性。 设计、时间及地点：对比观察，细胞学实验，实验于2005-05/2006-05在辽宁医学院科学实验中心完成。 材料：人髂骨骨块取自需髂骨植骨的颈椎病患者的植骨块修洁剩余部分的骨质，患者知情同意。质粒pCDI/VEGF121为北京大学人类疾病治疗中心马大龙教授惠赠；感受态大肠杆菌DH5a为辽宁医学院刘丹平教授惠赠。 方法：体外分离和培养人成骨细胞。实验分为血管内皮生长因子基因转染组与对照组。利用阳离子脂质体将pCDI-VEGF121真核表达质粒导入体外培养的人成骨细胞。 主要观察指标：传代后1，3，5，7 d观察血管内皮生长因子在人成骨细胞内的表达，及其对人成骨细胞增殖活力和细胞分泌骨钙素和碱性磷酸酶能力的影响。 结果：pCDI-VEGF121真核表达质粒转染人成骨细胞后第3，7天，以反转录聚合酶链反应方法检测到其中有血管内皮生长因子mRNA表达。转染组的细胞数在第1，3，5，7天均高于对照组(P < 0.05或P < 0.01)。培养3 d时转染组成骨细胞的碱性磷酸酶阳性率大于对照组(P < 0.01)；转染组的骨钙素含量高于对照组(P < 0.05或< 0.01)。 结论：血管内皮生长因子基因转染可以促进体外培养人成骨细胞的增殖能力和相应的生物学功能。     

脑肿瘤血管内皮生长因子的研究进展

血管生成在生理及病理状态下均有重要意义,许多多肽生长因子或非肽因子参与血管形成;近年发现血管内皮生长因子(VEGF)与人脑肿瘤的发生、发展及治疗等关系密切。本文将对VEGF结构、生物学特性及其与脑肿瘤关系作一综述。1 VEGF及VEGF受体结构 1983年,Senger等从腹水和瘤细胞培养介质中纯化得到了一种具有促进体液和蛋白质从血管外渗的因子,称之为血管渗透因子(VPF);1989年Ferrara和Gospodarowicz等。又从正常垂体滤泡星     

血管内皮生长因子与脑肿瘤

血管内皮因子(VEGF/VPF)/能够促进血管内皮细胞增殖和增加血管通透性,对肿瘤血管形成有强烈诱发作用。VEGF存在于多种动物和人的培养瘤细胞株、肿瘤组织和某些正常组织中,VEGFmRNA及其受体。mRNA在人类脑肿瘤中表达明显升高,与脑肿瘤的生长和转移有关,对VEGF深入研究对于脑肿瘤的诊治将会产生积极影响。     

人可溶性血管内皮生长因子受体1基因克隆及真核表达载体的构建

背景：血管内皮生长因子在肿瘤新生血管的形成中发挥着关键的作用,可溶性血管内皮生长因子受体1能竞争性地抑制血管内皮生长因子诱导新生血管形成的生物学功能。 目的：克隆人可溶性血管内皮生长因子受体基因1,尝试构建可溶性血管内皮生长因子受体1基因的真核表达载体。 设计、时间及地点：基因表达载体构建实验,于2006-10/2007-11在中山大学附属第一医院外科实验室完成。 材料：人脐静脉内皮细胞、pMD-18T载体及pcDNA3载体。 方法：提取人脐静脉内皮细胞总RNA,使用反转录-聚合酶链反应的方法扩增获得到可溶性血管内皮生长因子受体1基因cDNA,并将其克隆至pMD-18T载体中,经酶切及测序证实。然后应用聚合酶链反应的方法从pMD-18T可溶性血管内皮生长因子受体1重组载体中克隆可溶性血管内皮生长因子受体1基因,再将其定向亚克隆至真核表达载体pcDNA3中,构建真核表达重组体pcDNA3-可溶性血管内皮生长因子受体1,提取质粒进行双酶切、聚合酶链反应及测序鉴定。 主要观察指标：可溶性血管内皮生长因子受体1基因反转录-聚合酶链反应情况及pcDNA3-可溶性血管内皮生长因子受体1真核重组体的构建与鉴定结果。 结果：构建的真核表达重组体pcDNA3-可溶性血管内皮生长因子受体1经过双酶切及聚合酶链反应鉴定,证实其中含有目的可溶性血管内皮生长因子受体1基因;测序结果经比对分析,证实与预期设计的编码区cDNA一致。 结论：应用反转录-聚合酶链反应方法成功从人脐静脉内皮细胞中克隆出可溶性血管内皮生长因子受体1基因,成功构建出了可溶性血管内皮生长因子受体1基因真核表达载体。     

血管内皮生长因子反义RNA对体外培养的人脑垂体瘤细胞增殖和凋亡的影响

目的：研究血管内皮生长因子（VEGF）反义RNA对体外培养人脑垂体瘤细胞增殖和凋亡的影响。方法：将VEGF反义cDNA(反义组）、正义VECF cDNA质粒（正义组）转染垂体瘤细胞;应用免疫组化法和TUNEL法分别检测肿瘤细胞增殖指数及细胞凋亡。结果：反义组细胞增殖指数及细胞凋亡数量与正义组、未转染组相似,差异无显著性（P＜0．05）。结论：VEGF反义RNA对体外培养人脑垂体瘤细胞增殖和凋亡无明显影响,为垂体瘤基因治疗基础研究提供依据。     

VEGF165反义RNA抑制C6胶质瘤大鼠体内生长的实验研究

目的针对VEGF及其受体的抗血管生成治疗，已成为恶性胶质瘤治疗研究的新方向，为临床应用VEGF165反义RNA治疗胶质瘤提供实验室证据。方法本研究在建立大鼠C6胶质瘤模型基础上，利用脂质体法将pcDNA3-AVEGF165质粒导入C6胶质瘤细胞，以G418筛选阳性克隆。将阳性克隆及对照C6细胞定向移植人大鼠右脑尾状核，比较大鼠生存时间、肿瘤生长速率的变化，评判VEGF165反义RNA对脑胶质瘤生长的抑制作用。结果①成功将pcDNA3-AVEGF165质粒导入C6胶质瘤细胞，并筛选出阳性克隆株；②对照组和实验组C6细胞周期特征无明显变化；③VEGF165反义RNA对荷瘤大鼠有延长生存时间，延缓肿瘤生长速度的作用。结论VEGF165反义RNA对大鼠C6胶质瘤生长有明显抑制作用。     

Lentiviral-mediated vascular endothelial growth factor 165 gene transfer into neural stem cells promotes proliferation

We constructed a lentiviral vector carrying vascular endothelial growth factor 165, which was used to transfect neural stem cells. The transfection rate was approximately 50%, as determined by flow cytometry. Vascular endothelial growth factor protein was detected in neural stem cells and pro-moted proliferation.     

特异性小干扰RNA沉默Polo样激酶1基因表达对恶性胶质瘤细胞增殖的影响

目的 探讨Polo样激酶1(PLK1)基因对胶质瘤细胞增殖的影响和可能机制. 方法 根据PLK1基因特点,设计并用化学方法合成了5个小干扰核糖核酸分子(siRNA)(P1、P2、P3、P4和P5).以这5个siRNA转染人胶质瘤TJ905细胞后.分别采用荧光实时定量RT-PCR和Western blot检测PLK1 mRNA和蛋白表达水平.分别采用MTT法和Western blot方法检测癌细胞增殖和增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白水平,用TRA-.ELISA方法检测胶质瘤细胞端粒酶活性. 结果 所设计的5个siRNA均能明显抑制胶质瘤TJ905细胞PLK1 mRNA水平,以P4效果最好.以P4转染处理胶质瘤细胞后与脂质体对照组比较,PLK1基因mRNA水平和蛋白水平明显下调,差异有统计学意义(P均=0.000).MTT结果显示.与脂质体对照组比较P4 siRNA转染组癌细胞生长明显受到抑制,且呈浓度依赖性(r=0.868,P=0.000).Western blot结果显示,与脂质体对照组比较P4 siRNA转染组PCNA蛋白水平明显下降,差异有统计学意义(F=181.36,P=0.000).TRAP-ELISA结果显示,与脂质体对照组比较P4 siRNA转染组胶质瘤细胞端粒酶活性明显受到抑制,且呈浓度和时间依赖性(P=0.000). 结论 PLK1基因对胶质瘤细胞增殖具有重要的调控作用;以PLK1 siRNA转染处理胶质瘤细胞,可明显抑制胶质瘤细胞的恶性增殖,其机制可能与抑制端粒酶活性有关.     

人脐带血内皮祖细胞与血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子共培养及其增殖和迁移能力

背景：目前组织工程心脏瓣膜再内皮化种子细胞主要来源于成熟内皮细胞,内皮祖细胞作为内皮细胞的前体细胞越来越受到人们的关注。 目的：分离和扩增人脐带血内皮祖细胞,观测其体外生物学特性。 方法：密度梯度离心法分离新鲜的脐血中单个核细胞,在含血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的培养液中培养扩增,通过形态学、免疫荧光和流式细胞仪等对贴壁细胞进行鉴定;并与脐静脉内皮细胞进行增殖和迁移能力比较。 结果与结论：随着培养和诱导时间延长,贴壁细胞形态发生明显的改变,从小圆形变成梭形,逐渐分化成典型成熟内皮细胞的鹅卵石样形态,并可形成特征性的克隆;体外诱导7 d后90%以上贴壁细胞呈Dil-ac-LDL和FITC-UEA-I双阳性;贴壁细胞流式细胞仪分析显示：培养7 d的细胞VEGFR-2、CD34和CD133表达分别占(77.4±4.9)%、(52.4±6.6)%和(19.4±2.1)%,培养28 d的细胞VEGFR-2和CD34表达分别占(81.1±7.4)%和(7.6±3.1)%,而未检测到CD133表达;人内皮祖细胞增殖和迁移能力明显高于人脐静脉内皮细胞(P < 0.05),并且细胞数量可扩增达109 L-1。结果显示用密度梯度离心法和贴壁筛选法,可从人脐带血分离、纯化内皮祖细胞;内皮祖细胞可诱导分化为内皮细胞,增殖和迁移能力都很强。     

EphB4为靶的siRNA抑制脑胶质瘤细胞的体外实验研究

目的探讨EphB4在脑胶质瘤细胞中的生物学作用。方法采用免疫组化的方法检测EphB4在脑胶质瘤细胞中的表达。合成EphB4siRNA,应用脂质体转染U251细胞,RT-PCR、Western-blot检测对EphB4的转录及表达的抑制效果,MTT法检测其对细胞增殖的影响,Transwell试验检测细胞侵袭能力,TUNEL法检测细胞凋亡。结果应用siRNA方法明显降低了EphB4的转录(P0.01)及表达(P0.05),明显减慢了细胞的增殖速度(P0.05),加大siRNA浓度后,肿瘤细胞生长抑制进一步增强。S1组(25nmol/L)、S2组(50nmol/L)、S3组(100nmol/L)与U251组、siRNASCR组相比,侵袭能力明显降低(P0.05),凋亡细胞数量有明显增加(P0.05)。结论EphB4在脑胶质瘤细胞的增殖、侵袭、凋亡过程中发挥着重要的生物学调节作用。     

人反义血管内皮生长因子基因载体构建及对肾细胞癌血管内皮生长因子表达的影响☆

目的： 构建反义血管内皮生长因子基因表达载体，观察其对肾癌细胞血管内皮生长因子表达的影响。 方法：实验于2006-07/2007-03在郑州大学第三附属医院实验中心完成。①实验材料：质粒 pcDNA3.1(－)，宿主菌DH5α，肾癌细胞株786-0。②实验过程：克隆人血管内皮生长因子基因，将反义血管内皮生长因子基因定向克隆于质粒pcDNA3.1(－)表达载体，酶切鉴定；转染人肾癌细胞，并分别命名为反义血管内皮生长因子组和空载体组，未转染细胞命名为对照组；G418筛选阳性克隆。③实验评估：反转录-聚合酶链反应方法检测血管内皮生长因子mRNA的表达，免疫组织化学法检测血管内皮生长因子基因的蛋白表达，流式细胞术检测细胞周期，四甲基偶氮唑盐法检测细胞生长情况。 结果：①成功构建反义血管内皮生长因子基因表达载体。②反义血管内皮生长因子组血管内皮生长因子mRNA的表达受到抑制，明显低于空载体组和对照组血管内皮生长因子mRNA的表达(P < 0.01),空载体组血管内皮生长因子mRNA的表达没有受到影响。③反义血管内皮生长因子组的血管内皮生长因子蛋白表达明显降低，明显低于空载体组和对照组(P < 0.01)，空载体组和对照组血管内皮生长因子蛋白的表达差异无显著性。④反义血管内皮生长因子组细胞生长减慢，G1期细胞比例增加，S期细胞比例减少,反义血管内皮生长因子组细胞生长明显减慢。 结论：成功构建血管内皮生长因子的pcDNA3.1(－)反义基因表达载体，人反义血管内皮生长因子基因可明显降低肾癌细胞血管内皮生长因子基因在转录和翻译水平的表达，抑制肾癌细胞生长，为肾癌基因治疗提供一定的实验依据。     

Successful silencing of plasminogen activator inhibitor-1 in human vascular endothelial cells using small interfering RNA

Clinical as well as experimental evidence suggests that vascular overexpression of plasminogen activator inhibitor (PAI)-1, the primary physiological inhibitor of both urokinase and tissue-type plasminogen activator, may be involved in the pathophysiology of atherosclerosis and cardiovascular disease. We investigated the feasibility, efficacy and functional effects of PAI-1 gene silencing in human vascular endothelial cells using small interfering RNA. Double-stranded 21 bp-RNA molecules targeted at sequences within the human PAI-1 gene were constructed. Successful siRNA transfection of HUVEC was confirmed using fluorescence microscopy and flow cytometry. One of five candidate siRNA sequences reduced PAI-1 mRNA and protein in a concentration- and time-dependent manner. Suppression of PAI-1 mRNA was detected up to 72 hours after transfection. Moreover, siRNA treatment reduced the activity of PAI-1 released from HUVEC, and prevented the oxLDL- or LPS-induced upregulation of PAI-1 secretion. Importantly, siRNA treatment did not affect the expression of other endothelial-cell markers. Moreover, downregulation of PAI-1 significantly enhanced the ability of endothelial cells to adhere to vitronectin, and this effect could be reversed upon addition of recombinant PAI-1. SiRNA-mediated reduction of PAI-1 expression may be a promising strategy for dissecting the effects of PAI-1 on vascular homeostasis.     

缺氧诱导因子1α小干扰RNA对骨髓间充质干细胞缺氧诱导因子1α、基质细胞衍生因子1α和血管内皮生长因子基因表达的影响*

背景：缺氧可以影响骨髓间充质干细胞分泌细胞因子,其机制可能是通过缺氧诱导因子1α起作用的。 目的：观察缺氧诱导因子1α RNA干扰对骨髓间充质干细胞缺氧诱导因子1α、基质细胞衍生因子1α和血管内皮生长因子基因表达的影响。 方法：贴壁法培养骨髓间充质干细胞,取第3~5代细胞用于实验,倒置显微镜下观察细胞形态,并用流式细胞仪检测其表面标志物CD34、CD44、CD90表达。将骨髓间充质干细胞分四组：常氧对照组(无干预因素)、缺氧组(缺氧24 h)、脂质体对照组(转染空载脂质体后缺氧24 h)、RNA干扰组(转染脂质体介导的RNA干扰序列后缺氧24 h)。RT-PCR法检测骨髓间充质干细胞的缺氧诱导因子1α、基质细胞衍生因子1α和血管内皮生长因子 mRNA表达水平, ELISA检测骨髓间充质干细胞培养上清缺氧诱导因子1α、基质细胞衍生因子1α和血管内皮生长因子蛋白表达水平。 结果与结论：同常氧对照组比较,缺氧组缺氧诱导因子1α、基质细胞衍生因子1 α和血管内皮生长因子基因及蛋白表达增高(P < 0.05);同脂质体对照组比较,RNA干扰组缺氧诱导因子1α、基质细胞衍生因子1α和血管内皮生长因子基因及蛋白表达降低(P < 0.05)。证实了缺氧条件可以使骨髓间充质干细胞血管内皮生长因子和基质细胞衍生因子1α的表达增加,抑制缺氧诱导因子1α的表达可以使血管内皮生长因子和基质细胞衍生因子1α的表达减少,缺氧诱导因子1α很可能是干细胞移植细胞因子分泌的调控因素。