干细胞表面标志物CD90及端粒酶逆转录酶在原发性肝癌中的表达及临床意义

目的 检测CD90及端粒酶逆转录酶(hTERT)在原发性肝癌中的表达,研究其蛋白产物在原发性肝癌发生、发展过程中的表达特点及相互关系.方法 应用免疫组化S-P法检测36例原发性肝癌中CD90、hTERT的表达,并以同期20例正常肝组织作对照.结果 肝癌组织中CD90、hTERT基因蛋白产物阳性表达率(分别为63.9％和47.2％)显著高于良性对照组(CD90、hTERT均阴性);CD90、hTERT蛋白在UICC临床分期Ⅲ～Ⅳ期肝癌患者(分别为79.1％和62.5％)明显高于Ⅰ～Ⅱ期患者(分别为33.3％和16.6％);CD90、hTERT两者呈正相关;CD90、hTERT阳性患者生存率(术后中位生存时间分别为85 d和76 d)明显低于CD90、hTERT阴性患者(术后中位生存时间分别为505 d和463 d),log秩检验显示生存率差异均有统计学意义.结论 CD90可能与肝癌的发生、发展相关,有望成为判断患者预后的指标之一.     

肝癌SMMC-7721细胞中侧群细胞干细胞标记的表达

目的 分选肝癌细胞株SMMC-7721中的侧群(SP)细胞,并分析其干细胞标记的表达.方法 采用流式细胞荧光激活分选(FACS)技术将SMMC-7721细胞分为SP细胞和非侧群(NSP)细胞两个亚群,以实时荧光定量聚合酶链反应(real-time PCR)技术和流式细胞术对两个亚群细胞干细胞标记mRNA和蛋白表达进行分析.结果 SMMC-7721细胞株中分选出的SP细胞比例为(9.2±0.2)%.SP细胞ABCG2、CD133、Oct4、Sox2和NANOG等干细胞标记mRNA的表达水平分别是NSP细胞的7.132倍、4.985倍、8.642倍、5.095倍和5.164倍,差异均有统计学意义(P＜0.01);ABCG2、CD133、Oct4、Sox2和NANOG蛋白在肝癌SP细胞中的含量分别为(92.65±3.92)%、(12.75±1.62)%、(17.35±2.31)%、(9.57±1.71)%和(28.39±5.28)%,在NSP细胞中的含量分别为(0.26±0.06)%、(2.51±0.17)%、(1.74±0.38)%、(1.52±0.41)%和(3.37±1.02)%,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 肝癌SMMC-7721细胞中的SP细胞可能富集了肝癌干细胞,联合应用多种干细胞标记筛选肝癌SP细胞可能会获得纯化的肝癌干细胞.

Abstract：

Objective To study the expression of stem cell markers in side population cells sorted from SMMC-7721 cell line. Methods Fluorescence-activated cell sorting (FACS) was used to sort side population (SP) cells and non-SP (NSP) cells from SMMC-7721 cell line. Real-time polymerase chain reaction (PCR) and flow cytometry (FCM) were used to evaluate the expression of several stem cell markers such as ABCG2, CD133, Oct4, Sox2 and NANOG in SP cells and NSP cells. Results FACS analysis indicated that (9.2 ±0. 2)% of the SMMC-7721 cells were SP cells. Real-time PCR analysis suggested that ABCG2, CD133, Oct4, Sox2 and NANOG were expressed in the SP cells at higher levels than the NSP cells by about 7. 132, 4. 985, 8. 642, 5.095 and 5. 164 folds, respectively ( P ＜0. 01 ). FCM analysis revealed that the expression of ABCG2, CD133, Oct4, Sox2 and NANOG proteins in SP cells was (92. 65 ±3.92)%, (12.75 ±1.62)%, (17.35 ±2.31)%, (9.57 ± 1.71)% and (28.39 ±5.28)% respectively,while in NSP cells that was (0. 26 ±0. 06)%, (2. 51 ±0. 17)%, ( 1.74 ±0. 38)%, ( 1.52 ±0. 41 )% and ( 3.37 ± 1.02) % respectively ( P ＜ 0. 01 ). Conclusion The SP cells sorted from SMMC-7721 cell line may enrich tumor stem cells. Purified liver cancer stem cells may be obtained by screening SP cells using a variety of stem cell markers.     

MHCC97中肝癌干细胞的分离及其特性

目的 分离肝癌细胞系MHCC97中肝癌干细胞并观察其干细胞特性.方法 利用流式分选法从MHCC97中分离出边缘群(SP)和主群(MP).分别采用软琼脂克隆形成和裸鼠成瘤实验观察SP和MP细胞体内、外成瘤能力;羟基喜树碱(HCPT)体外诱导,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)分析其分化潜能.结果 SP细胞克隆形成率为57%,MP细胞仅为13%;1×103SP细胞可成瘤(2/8),MP细胞则需1×105才能成瘤(2/8).诱导3 d后,约15%SP细胞出现双核;诱导后SP细胞甲胎蛋白和r-谷氨酰转肽酶的表达降低,白蛋白表达增强,葡萄糖磷酸酶仅诱导后表达.结论 MHCC97中SP亚群富集具有干细胞特性的癌细胞,即肝癌干细胞.     

肝癌干细胞标志物研究的进展

肝癌是常见的恶性肿瘤,其目前的治疗手段是以手术为主的综合治疗,但是术后易复发、转移,预后较差。肿瘤干细胞学说认为只有杀灭肝癌干细胞才能从根本上治愈肝癌,因此分离和鉴定肝癌干细胞成为研究的热点。笔者就目前的肝癌干细胞表面标志物研究进展进行综述。     

下调CD133表达对肝癌细胞恶性生物学行为的影响

目的:探讨下调CDl33基因的表达对肝癌细胞生物学行为的影响。方法:将合成的CDl33小干扰核糖核酸分子(si RNA)转染至肝癌SMMC7721细胞并检测转染效率;分别以无转染与转染随机si RNA序列的SMMC7721细胞为空白对照和阴性对照,观察CDl33 si RNA转染后CDl33基因沉默效果,以及SMMC7721细胞主要生物学行为的变化。结果:转染24 h后,转染效率可达到(80.8±9.1)%;与空白对照组比较,CDl33 si RNA转染后的SMMC7721细胞CD133 m RNA及蛋白表达量分别降至空白对照组的10%与35%、细胞增殖活性明显降低、细胞凋亡率明显增加(41.3%vs.25.3%)并出现明显的S期阻滞,集落形成能力明显降低(均P0.05)。阴性对照组与空白对照组各指标无统计学差异(均P0.05)。结论:CDl33在肝癌细胞中可能起了癌基因作用,下调其表达能抑制肝癌的恶性生物学行为。     

肝细胞癌干细胞研究进展

原发性肝细胞癌是我国最常见的恶性肿瘤之一。近年来,肝细胞癌的治疗水平虽有一定的提高,但总体疗效仍不明显。肝细胞癌发生的细胞学机制不十分清楚,近期对于肝细胞癌干细胞的研究成果有望对此进行合理解释。目前认为肝细胞癌可能不仅是一种基因病,而且是一种干细胞病。本文就肝细胞癌干细胞的来源、表面标记特征、研究现状及其尚需解决的难题进行综述,以期对肝细胞癌的发生机制提供理论依据。     

CD133在肝细胞癌、胰腺癌研究中的进展

肿瘤干细胞是肿瘤发生、发展、转移、复发、对抗放、化疗的根源，近年来研究表明一些实体肿瘤干细胞高度表达CD133表面抗原。针对CD133与肝细胞癌、胰腺癌干细胞的关系的研究，理解CD133＋肿瘤干细胞的分子生物学机制对于研究应用有效的、有选择性的诱导凋亡的抗肿瘤药物的靶向性治疗提供了新的发展方向。     

采用罗丹明123对肝癌细胞系MHCC97(Rholow)干细胞亚群的分离及鉴定

目的 建立分离肝癌细胞系MHCC97细胞中对罗丹明123染料具有不同排斥能力细胞亚群的方法,并探讨其在肝癌干细胞和异质性研究中的意义.方法 利用流式细胞分选术(FCM)并结合不同浓度的罗丹明123(Rho123)染料,分析和分选肝癌细胞系MHCC97细胞中具有不同染料排斥能力的肝癌细胞亚群,再通过细胞生长的测定、软琼脂克隆形成以及免疫组织化学检测和裸鼠成瘤实验等方法,以比较不同肝癌细胞亚群的差异.结果 根据不同染料排斥能力可以将肝癌细胞系MHCC97细胞分为Rholow和Rhohigh2个亚群,2个亚群在增殖能力、克隆形成率以及甲胎蛋白(AFP)和角蛋白-19(CK-19)表达以及裸鼠成瘤实验上差异有统计学意义,Rholow亚群具有干细胞特性.结论 罗丹明123结合FCM可以富集具有干细胞特性的Rholow亚群,同时为进一步揭示肝癌异质性机制奠定基础.     

骨髓间充质干细胞对人肝癌细胞系MHCC97-H增殖能力的影响

目的 观察骨髓间充质干细胞(MSC)对肝癌细胞增殖能力的影响.方法 人肝癌细胞系MHCC97-H培养液中分别加入0、25%和50%MSC的条件培养基(MSC-CM),采用CyQUANT细胞增殖实验检测吸光度A值变化.在MHCC97-H细胞培养液中添加50%MSC-CM,荧光实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测肿瘤增殖细胞核抗原(PCNA)、Ki-67抗原的变化.16只裸鼠皮下接种MHCC97-H细胞后,实验组经静脉注射MSC,1×106个/次,每周3次,对照组静脉注射PBS;比较肿瘤体积.结果 培养液中加入MSC-CM后A值依次为211.65±54.72、236.24±57.15和283.59±62.16(P<0.05).PCNA和Ki-67的表达水平分别升高1.8和7.0倍.实验组肿瘤体积(1745±455)mm3m大于对照组(972±568)mm3(P<0.05),肿瘤体积平均增加速度(56.0±26.1)mm3/d高于对照组(32.4±14.5)mm3/d(P<0.05).结论 骨髓间充质干细胞可促进肝癌细胞系MHCC97-H的增殖.     

造血干细胞移植抑制肝癌术后复发转移的实验研究

目的 证实异基因造血干细胞移植(allo hematopoietic stem cell transplantion,allo-HST)对严重联合免疫缺陷(severe combined immunodeficiency,SCID)小鼠肝癌根治性切除术后的复发转移有一定抑制作用.方法 采集足月健康胎儿新鲜脐血,以6%羟乙基淀粉(hydroxyethyl starch,HES)+NH4Cl破红细胞法分离人脐带血有核细胞(nucleated cells,NC).SCID小鼠22只随机分为A组:程序移植组(n=8);B组:单次移植组(n=8);C组:生理盐水对照组(n=6).两干细胞移植组内每只小鼠经尾静脉注入人脐带血NC共5×107个,三组小鼠移植前都给予低剂量的环磷酰胺预处理,并连续使用甲泼泥龙1周.6周后观测小鼠存活情况,流式细胞仪检测两干细胞移植组人源细胞嵌合情况.同时将HCCLM6肿瘤组织块原位接种于SCID小鼠肝脏,10 d后对荷瘤肝叶行根治性切除,4周后处死小鼠,观察肝内复发和肝外转移的情况.结果 通过化疗预处理及使用免疫抑制剂能够成功建立了人-鼠造血下细胞移植模型,程序移植组及单次移植组外周血CD3+细胞嵌合率分别为(1.66±0.47)%(0.68±0.56)%,差别有统计学意义(P<0.01).移植瘤切除后A、B、C各组肝内复发率均为100%,但复发瘤体积大小差异显著,分别为(367.18±31.86)mm3、(648.26±155.22)mm3、(811.38±127.36)mm3,两两比较差别均有统计学意义(P<0.01).A、B两组的抑瘤率分别为54.7%和20.1%.各组间肺转移率分别为14.3%(1/7)、66.7%(4/6)、100%(5/5),差别有统计学意义(P<0.01).淋巴结转移率分别为14.3%1(1/7)、33.4%(2/6)、40%(2/5),差别无统计学意义(P=0.58).结论 在小鼠实验中,造血干细胞移植对肝癌根治性切除术后的复发和转移显示出一定的抑制作用,并且随着人源细胞嵌合率的增加,抗肿瘤效应也相应得到提高.     

干细胞表面标志物CD133在胃癌中的研究进展

胃癌的发病率和病死率在我国各种恶性肿瘤中均居于首位,其早期诊断率低,患者预后差.CD133分子在胃癌组织的表达量显著高于癌旁正常组织,并与肿瘤大小、淋巴结转移及预后有关.同时,CD133阳性表达可能还与胃癌新生血管形成、浸润深度、分化程度及TNM分期具有相关性.本文旨在通过对CD133分子在胃癌组织中的特异性表达及其与胃癌发生发展和临床病理特征关系的进一步认识,以期为胃癌的早期诊断和靶向治疗带来新的研究方向.     

化疗对CD133+结肠癌细胞的作用效果

目的 观察化疗前后结肠癌细胞株HT29、SW620中CD133+结肠癌细胞的数量变化,探讨化疗对CD133+结肠癌细胞的作用效果.方法 取对数生长的结肠癌细胞株HT29、SW620,采用80 mg/L 5-氟尿嘧啶(5-Fu)和25 mg/L奥沙利铂(Oxaliplatin)分别作用8 h,并设对照组,利用CD133抗体进行标记后再用流式细胞仪进行检测,观察化疗前后CD133+细胞的比例.结果 流式细胞仪检测结肠癌细胞株HT29,80 mg/L 5-Fu处理8 h组中CD133+肿瘤细胞为45.00%,与未处理组(32.80%)比较结果差异有统计学意义(P＜0.01);25 mg/L奥沙利铂处理8 h组中CD133+肿瘤细胞为55.30%,与未处理组和80 mg/L 5-Fu处理8 h组比较结果差异有统计学意义(P＜0.01).流式细胞仪检测结肠癌细胞株SW620,80 mg/L 5-Fu处理8 h组中CD133+肿瘤细胞为47.10%,与未处理组(33.90%)比较结果差异有统计学意义(P＜0.01);25 mg/L奥沙利铂处理8 h组中CD133+肿瘤细胞为56.50%,与未处理组和80 mg/L 5-Fu处理8 h组比较结果差异有统计学意义(P＜0.01).结论 CD133+结肠癌细胞能明显抵抗化疗.

Abstract：

Objective To observe the changes of quantity of CD133 + cells in HT29 and SW620 cell lines before and after chemotherapy, and detect the effect of chemotherapy on CD133 + cells. Methods HT29 and SW620 cells in logarithmic growth phase were separately treated with 80 mg/L 5-fluorouracil(5-Fu) and 25 mg/L oxaliplatin for 8 h, and analyzed by flow cytometry after being marked by CD133 antibody. The proportion of CD133 + cells before and after chemotherapy was measured. Results For HT29 cells, the proportion of CD133 + cancer cells in the group treated with 80 mg/L 5-Fu for 8 h was 45.00% with the difference being remarkable ( P ＜ 0. 01 ) compared to the non-treatment group ( 32. 80% ). The proportion of CD133 + cancer cells in the group treated with 25 mg/L oxaliplatin for 8 h was 55.30% with the difference being remarkable ( P ＜ 0. 01 ) compared with both the non-treatment group and the group treated with 80 mg/L 5-Fu for 8 h. For SW620 cells, the proportion of CD133 + cancer cells in the group treated with 80 mg/L 5-Fu for 8 h was 47. 10% with the difference being remarkable ( P ＜0. 01 ) compared with the non-treatment group (33.90%). The proportion of CD133 + cancer cells in the group treated with 25 mg/L oxaliplatin for 8 h was 56. 50% with the difference being remarkable ( P ＜ 0. 01 ) compared with both the non-treatment group and the group treated with 80 mg/L 5-Fu for 8 h. Conclusion CD133 positive colon cancer cells have anti-chemotherapy activity obviously.     

半乳糖凝集素1在CD133+肺腺癌细胞中的表达和功能

目的 观察肺腺癌CD133+细胞中半乳糖凝集素1(Galectin-1)的表达和功能.方法 磁珠分选出9例患者肺腺癌中CD133+细胞并以流式细胞术检测分选效率,荧光实时定量聚合酶链反应(fqRT-PCR)、Western blot和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测CD133+细胞中或上清液中Galectin-1的表达,Galectin-1小干扰RNA(siRNA)转染CD133+细胞后检测其对肿瘤细胞生长以及克隆形成能力的影响.予裸鼠皮下注射Galectin-1 siRNA转染后的CD133+细胞并观察肿瘤的生长.结果 流式细胞术结果表明磁珠分选出的细胞中CD133+细胞率为92.6%.fqRT-PCR和Western blot检测结果显示Galectin-1在CD133+细胞中的表达量分别是CD133-细胞中的1.748倍和1.135倍.体外显示发现下调CD133+细胞中Galectin-1表达后肿瘤细胞的增殖率为(36.75±1.35)%,对照组为(92.31±0.78)%,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 Galectin-1在肺腺癌干细胞中高表达,并能促进肺腺癌干细胞的生长增殖.

Abstract：

Objective To investigate the expression and function of Galectin-1 in CD133+ pulmonary adenocarcinoma cells. Methods CD133 + cells were separated by magnetic activated cell sorting (MACS) from excised pulmonary adenocarcinoma speciments of 9 patiens. The proportion of CD133 + cells was measured by flow cytometry (FCM). The expression of Galectin-1 in CD133 + or CD133 - cells was quantitated by fluorescent quantitation real-time polymerase chain reaction (fqRT-PCR), Western blotting and enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) respectively. CD133 + cells were transfected with small interfering RNA (siRNA) of Galectin-1 to study the effect of Galectin-1 inhibition on cancer cells growth and clonality. Tumorigenesis in nude mice was also performed in vivo. Results 92.6% cells separated by MACS were positive for CD133, which was proved by FCM. The expression of Galectin-1 in CD133 + cells was 1. 748 folds and 1. 135 folds higher than that in CD133 - celts detected by fqRT-PCR and Western blot respectively. Downregulation of Galectin-1 ex vivo also resulted in (36. 75 ±: 1.35 ) % decrease of proliferation rate of cancer cells. Conclusion Galectin-1 which can be efficiently inhibited by Galectin-1 siRNA was significantly highly expressed in CD133 + cells and associated with the proliferation and clonality of CD133 + cells.     

CD 133 and CXCR4 colon cancer cells as a marker for lymph node metastasis

Introduction

Colorectal cancer (CRC) stem cells or tumor-initiating cells (Co-TIC) are implicated in both cancer recurrence and extranodal metastasis. CD133 and CXCR4 are specific cell surface markers that are indicators of Co-TIC. The presence of lymph node (LN) metastases is one of the strongest negative prognostic factors for CRC patients. We examined the relationship between the Co-TIC markers CD133 and CXCR4 and LN involvement in CRC.

Methods

CRC cells were isolated via enzymatic digestion. CD133⁺, CXCR4⁺, and double-positive CRC cells were detected by fluorescence-activated cell sorting analysis. The percentages of CD133⁺, CXCR4⁺, and double-positive cells were identified and correlated to the number and percentage of positive LN on staging.

Results

Twenty-seven samples underwent fluorescence-activated cell sorting analysis. The mean percentage of CD133⁺ cells was 3.94% (range 0.15%–19.06%). The mean percentage of CXCR4⁺ cells was 6.15% (range 0%–27.11%). The mean percentage of CD133⁺CXCR4⁺ cells was 0.45% (range 0%–2.08%). Thirteen patients had LN metastasis: 8 N1 disease and 5 N2 disease. The correlation coefficients between the percentage of Co-TIC marker–positive cells and percentage of positive LN were r = 0.58 (P = 0.0016) for CD133⁺ cells, r = 0.36 (P = 0.5868) for CXCR4⁺ cells, and r = 0.56 (P = 0.0022) for double-positive cells.

Discussion

Our results show CD133⁺ and CD133⁺CXCR4⁺ cancer cells correlate with the presence of LN metastasis in CRC. Further studies will examine whether these markers can give consistent prognostic information and may help to develop novel diagnostic and therapeutic options.     

体外培养脑胶质瘤细胞株中CD133表达的研究

目的 探讨与脑胶质瘤干细胞相关的CD133表型.方法 将无血清培养中的胶质瘤干细胞与含血清贴壁培养的胶质瘤细胞中CD133的表达进行对比.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及实时荧光定量PCR检测信使RNA(mRNA)水平的表达,流式细胞术及免疫荧光染色法检测蛋白水平的表达,激光共聚焦扫描成像进行CD133蛋白的亚细胞定位.结果 所有胶质瘤细胞中均存在CD133 mRNA及蛋白的表达.AC133抗体所识别的糖基化CD133-AC133分子仅分布于无血清培养中的胶质瘤干细胞,阳性细胞比例为31.8％ ～99.9％,且定位于此类细胞膜表面.AC133阴性的胶质瘤干细胞及含血清贴壁培养胶质瘤细胞中CD133蛋白的表达位于细胞内,阳性细胞比例约为22.2％～88.6％,其亚细胞定位为内质网和/或高尔基体.结论 细胞表面AC133分子,而非CD133 mRNA及细胞内CD133蛋白标记了一类胶质瘤干细胞亚群,但无血清培养环境下也存在AC133呈阴性表达的胶质瘤干细胞亚群.     

胃癌CD133阳性细胞亚群肿瘤起始细胞样特性的检测

目的 探讨人胃癌细胞CD133＋亚群的分选及其特性的鉴定.方法 对50例胃癌原发灶和癌旁胃黏膜组织标本行免疫组织化学染色及Western blot检测CD133蛋白的表达.采用流式细胞仪检测不同分化胃癌细胞系CD133所占百分比,免疫磁珠法分选CD133＋细胞亚群,悬浮培养并观察其生长特性,并检测CD133阳性细胞裸鼠皮下接种致瘤能力.单细胞克隆观察单个CD133＋细胞生长特性,半定量反转录聚合酶链反应法鉴定相关干细胞标记的表达.结果 CD133蛋白多定位于胃癌原发灶黏膜及黏膜下层的肿瘤细胞膜表面,其相对表达量高于癌旁胃黏膜组织（P＜0.05）.不同分化程度的人胃癌细胞系KATO-Ⅲ、SGC-7901、AGS及MKN-45中CD 133＋亚群所占相对百分比为（28±2）％、（17±2）％、（6±2）％及（4±2）％.人胃癌细胞系KATO-Ⅲ分选后阳性组中CD133＋亚群比例分别为（91±3）％;培养1周后,达到（95±2）％,并不断增殖形成细胞球.而且其增殖能力强于阴性细胞[群体倍增时间分别为（21±3）h和（40±8）h,P＜0.05].CD133阳性组和未分选组细胞裸鼠皮下接种时成瘤率分别为100％和80％;而CD133阴性组不成瘤,CD133阳性组移植瘤平均体积及重量均大于未分选组（P＜0.05,P＜0.05）.单克隆形成实验示单个CD133＋细胞可形成新的细胞克隆.半定量RT-PCR检测示其表达干细胞标记物Oct-4、Nanog、Sox-2、Musashi-1及EGFR.结论 体外可成功分离、纯化和扩增人胃癌细胞CD133＋亚群,其具有自我更新、增殖能力及较强的致瘤能力,并表达部分干细胞相关基因.     

人脑胶质瘤中肿瘤干细胞的分离、鉴定以及生物学性质研究

目的研究不同级别胶质瘤中肿瘤干细胞的构成,分布以及肿瘤干细胞的生长特性。方法取不同级别的脑胶质瘤细胞12例（WHOⅡ-Ⅳ级）,接种于含生长因子的无血清培养基中培养,观察细胞的生长特性;用单克隆生长试验确定肿瘤干细胞比例;检测脑肿瘤干细胞中CD133含量以及多项分化能力的表达情况。结果在Ⅱ-Ⅳ级别的人脑胶质瘤中,均发现有CD133阳性细胞的存在,其中有1.2%～13.9%的细胞具有单细胞增殖形成克隆球的能力。结论人脑胶质瘤组织中确实存在少数的脑肿瘤干细胞,有自我更新、多项分化以及致瘤能力。