载脂蛋白M基因启动子克隆及功能初步研究

目的克隆apoM基因的上游启动子序列,构建启动子不同截短片段的荧光素酶报告基因,并观察其不同截短片段的启动子活性,为进一步研究apoM基因的表达调控机制奠定基础。方法在对apoM基因生物信息分析的基础上,采用5’RACE确定了apoM基因的转录起始点,构建了6种不同长度apoM基因启动子序列的荧光素酶报告基因表达质粒pGL3-Basic(A-F),将它们瞬时转染HepG2细胞,并检测其荧光素酶活性。结果 pGL3-Basic-C的荧光素酶活性最高。结论 -401～-621bp可能是apoM的核心启动子区。     

-514bp及-250bp位点基因多态性对肝脂酶转录活性的影响

目的:探讨同时含肝脂酶(HL)启动子-514 bp和-250 bp多态位点的野生型及变异纯合子型的荧光素酶表达质粒对HL转录活性的影响.方法:PCR法扩增含不同目的基因的DNA片段,将目的基因插入到pUCm-T质粒中,获取含SacⅠ及BglⅡ酶切位点的目的基因,将该基因与含荧光素报告基因的pGL2质粒相连,构建pGL2-HL/-514T+ -250A变异纯合型以及pGL2-HL/-514C+ -250G野生型荧光素酶表达质粒,转染至HepG2细胞内表达,双荧光素酶检测系统检测不同重组质粒荧光素酶报告基因的活性.结果:(1)实验成功构建了同时含HL启动子部位-514/-250位点的野生型和变异纯合型的荧光素酶表达质粒.(2) pGL2-HL/-514T+ -250A变异纯合型的荧光素酶相对表达活性明显低于野生型荧光素酶表达活性(P＜0.01).结论:HL启动子-514及-250位置基因的联合变异可直接影响HL的转录活性.     

ORMDL3基因第一内含子中新启动子区的鉴定

目的构建表达血清类黏蛋白1样蛋白3(ORMDL3)基因第一内含子中新启动子区的质粒,并研究其功能特征。方法以人基因组DNA为模板,PCR扩增ORMDL3基因第一内含子内新转录起始位点上下游776bp启动子区片段,酶切并连接此片段至pGL3-basic载体,构建含有ORMDL3基因第一内含子中新启动子区的基因重组体,并转染人胚肾293细胞。荧光素酶检测报告基因启动子的活性,计算相对活性单位。生物信息学方法分析转录因子结合位点。结果成功构建含有新启动子的重组质粒。与pGL3-basic空载体相比,新启动子活性明显增强,并定位于转录起始位点-363bp至-63bp之间,且该区域存在Sp1、GATA-1等转录因子的结合位点。结论 ORMDL3基因第一内含子中新转录起始位点上游具有启动子活性,在-363bp至-63bp区域存在转录调控元件,且Sp1、GATA-1等转录因子可能参与其转录调控。     

人中脑星形胶质来源的神经营养因子基因启动子区域的克隆及活性检测

目的克隆人中脑星形胶质来源的神经营养因子MANF(mesencephalic astrocyte-derived neurotrophie factor)基因的启动子区域,并鉴定其转录活性。方法利用TESS在线软件分析MANF基因上游序列中潜在的顺时作用元件。以HepG2细胞的总基因组为模板,通过PCR反应扩增了MANF基因5'非翻译区1 415 bp片段,并将此片段插入到不含有启动子的pEGFP-1载体中构建了pEGFP-1-MANF-5F重组质粒。用脂质体介导的方法将pEGFP-1-MANF-5F质粒转染到293T细胞,在倒置显微镜下观察绿色荧光的表达。同时,将上述MANF基因5'非翻译区1 415 bp片段插入到荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic中,以构建质粒pGL3-MANF-5F,并通过共转染内参质粒pRL-TK到N2 A细胞中,24 h后检测双荧光素酶的表达。结果重组质粒pEGFP-1-MANF-5F转染293T细胞后,在细胞中可见绿色荧光蛋白;pGL3-MANF-5F重组质粒在N2 A细胞中检测到双荧光素酶的活性,且在Tunicamycin诱导时表达明显升高;结论已成功克隆了MANF基因的5'端非翻译区,并证实该区域具有启动子活性,且内质网应激可调节MANF的启动子活性,这为进一步研究MANF基因在疾病中的表达调控机制奠定了基础。     

CD2AP启动子的克隆和活性分析

目的 构建表达CD2AP基因转录起始位点上游启动子的表达质粒,转染人类胚胎肾(HEK)-293T细胞,评价其启动子活性.方法 以人全血细胞总DNA为模板,PCR扩增CD2AP转录起始位点上游2082 bp的启动子区片段.亚克隆此片段至无启动子活性的pGL-3基本载体荧光素酶报告基因上游的多克降位点,构建含CD2AP启动子的重组报告质粒.转染HEK-293T细胞,行荧光素酶活性检测,计算相对活性单位(RLU).生物信息学分析转录因子结合位点.结果 酶切,测序鉴定证实成功构建含有CD2AP基因转录起始位点上游2082 bp的启动区的表达质粒.CD2AP的启动子与正常的pGL-3基本质粒比较,其RLU增加了74.8倍.其上游启动子区序列中含多个转录因子结合序列如AP1、Sp1、CREB和GATA-1等.结论 CD2AP转录起始位点上游序列在HEK-293T细胞中具有较强的启动活性.     

小鼠LRP5基因负调控区分析

为研究小鼠LRP5基因-1 229 bp~-1 034 bp之间存在的负调控区,在此区域内构建了3种荧光素酶报告基因表达载体,即pGL3-1229(-1 229 bp~-914 bp),pGL3-1130(-1 130 bp~-914 bp)及pGL3-1051(-1 051 bp~-914 bp)。以PRL-TK为内参照质粒,瞬时转染COS-7,48 h后收集细胞测定荧光素酶相对表达活性。结果表明pGL3-1229质粒的相对荧光素酶活性是pGL3-1130的26%,有显著性差异。在-1 229 bp~-1 130 bp之间存在负调控元件,软件分析COUP可能是小鼠LRP5基因的负调控元件,有待进一步突变分析证实。     

基于双荧光素酶报告基因系统的人源SREBP1基因启动子的活性研究

目的 构建固醇调节元件结合蛋白 1（SREBP1）启动子双荧光素酶报告基因表达载体,为研究针对 SREBP1靶点的天然活性抑制剂筛选奠定基础。方法 利用生物信息学软件,对SREBP1基因5′端上游5 000 bp序 列进行启动子预测与分析。应用 Gibson Assembly 方法构建启动子双荧光素酶载体,并将构建成功的 pGL3- SREBP1-pro重组质粒和内参质粒pRL-SV40共转染肝癌HepG2细胞并给予天然抑制剂大黄素,检测SREBP1转录活 性的抑制效果。结果 SREBP1基因5′端上游2 000 bp区域内有启动子特征序列,存在转录因子结合位点;重组质粒 经酶切及测序鉴定证实为阳性克隆,瞬时转染肝癌HepG2细胞后经双荧光素酶报告基因系统检测,所克隆的片段序 列具有启动子活性,该活性可被大黄素所抑制。结论 成功构建了pGL3-SREBP1-pro双荧光素酶报告基因表达载 体,并证实其活性,可为进一步用于针对SREBP1靶点的天然活性抑制剂筛选奠定     

干扰素调节因子3第二内含子中新启动子在人胚肾AD-293细胞中的功能特征

目的构建包含人干扰素调节因子3(IRF-3)基因第二内含子中新启动子的质粒,研究其功能特征。方法以人类基因组DNA为模板,PCR定向克隆和酶切亚克隆构建IRF-3基因第二内含子内新转录起始位点上游的新启动子基因重组体,并瞬时转染人胚肾AD-293细胞。荧光素酶检测报告基因启动子的活性,计算相对活性单位(RLU)。结果成功构建含有新启动子区的质粒,与pGL3-Basic组相比,新启动子活性明显增强,并定位于新转录起始位点前-317～-110bp,且该区域内存在环腺苷酸应答元件结合蛋白(CREB)和GATA等转录因子结合位点。结论 IRF-3第二内含子内新转录起始位点上游具启动子活性;在-317～-110bp区域存在必需调控元件,并且CREB和GATA等转录因子可能参与其转录调控。     

Identification of the new promoter in the fisrt intron of ORMDL3 gene

目的 构建表达血清类黏蛋白1样蛋白3(ORMDL3)基因第一内含子中新启动子区的质粒,并研究其功能特征.方法 以人基因组DNA为模板,PCR扩增ORMDL3基因第一内含子内新转录起始位点上下游776 bp启动子区片段,酶切并连接此片段至pGL3-basic载体,构建含有ORMDL3基因第一内含子中新启动子区的基因重组体,并转染人胚肾293细胞.荧光素酶检测报告基因启动子的活性,计算相对活性单位.生物信息学方法分析转录因子结合位点.结果 成功构建含有新启动子的重组质粒.与pGL3-basic空载体相比,新启动子活性明显增强,并定位于转录起始位点-363 bp至-63 bp之间,且该区域存在Sp1、GATA-1等转录因子的结合位点.结论 ORMDL3基因第一内含子中新转录起始位点上游具有启动子活性,在-363 bp至-63 bp区域存在转录调控元件,且Sp1、GATA-1等转录因子可能参与其转录调控.     

雌激素对载脂蛋白AⅠ基因启动子不同区域转录活性的影响

目的:探讨雌激素对载脂蛋白(Apo)AⅠ基因启动子不同区域转录调节活性的影响。方法:利用含荧光素酶报告基因的表达载体pGL2构建携带ApoAⅠ基因启动子不同区域片段的重组质粒和同时携带ApoCⅢ/AⅣ基因片段的重组质粒。阳离子脂质体法将重组质粒与pRL-null内参质粒共转染HepG2细胞,加入10μmol/L雌激素刺激24h检测细胞荧光素酶报告基因的荧光强度,以反映ApoAⅠ的转录水平。结果:pGL2/-256AⅠ,pGL2/-2500AⅠ,pGL2/-256AⅠCⅢAⅣ及pGL2/-2500AⅠCⅢAⅣ转染后雌激素组荧光素酶相对活性明显高于对照组(P<0.05);而pGL2/-41AⅠ及pGL2/-41AⅠCⅢAⅣ质粒转染后雌激素组与对照组荧光素酶活性差异无统计学意义(P>0.05)。结论:ApoAⅠ启动子-256~-41区域可能包含与雌激素作用相关的反应元件,受雌激素刺激后转录活性增强。     

小鼠干扰素调节因子3启动子质粒的构建及其启动子活性分析

目的构建包含小鼠干扰素调节因子3(mIRF-3)基因启动子的质粒,并评价其启动子活性。方法以小鼠全血细胞总DNA为模板,PCR扩增mIRF-3目的片段,亚克隆此片段至pGL3-basic荧光素酶报告基因的多克隆位点,构建含mIRF-3启动子的重组报告质粒pmIRF-3。将pmIRF-3、pGL3-basic和pGL3-control质粒分别转染小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3后,行荧光素酶活性检测,计算相对活性单位(RLU)。生物信息学分析转录因子结合位点。结果成功构建了重组报告质粒pmIRF-3。与pGL3-basic组相比,pmIRF-3、pGL3-control组RLU明显增加(0.443±0.113vs.18.907±3.335、25.704±5.850)(P<0.01)。mIRF-3启动子区域内存在AML-1a、E2F、MZF1、CdxA、OCT-x等多个转录因子结合位点。结论 mIRF-3转录起始位点附近1479bp序列在NIH3T3细胞中具有较强的启动子活性。     

丙泊酚抑制机械牵张诱导的肺泡上皮细胞HMGB1启动子转录激活

目的探讨丙泊酚对机械牵张诱导肺泡上皮细胞(A549)高迁移率族蛋白B1(high mobility group box1 pro-tein,HMGB1)启动子转录激活的影响。方法以基因重组技术将HMGB1启动子克隆入荧光素酶报告基因表达载体pGL3-Basic,得到重组质粒pGL3-HMGB1P。采用脂质体介导的细胞转染技术将pGL3-HMGB1P和空载体pGL3-Basic分别转染A549细胞,以机械牵张和机械牵张+丙泊酚分别处理转染后的A549细胞,检测并比较荧光素酶活性,分别用Western blot和RT-PCR检测细胞HMGB1蛋白和mRNA的表达。结果酶切和测序结果证实重组载体pGL3-HMGB1P构建正确,荧光素酶活性检测显示重组载体pGL3-HMGB1P在A549细胞中有效表达。与未牵张组比较,牵张组HMGB1启动子的转录活性和HMGB1表达均明显增加(P<0.05);与牵张组比较,牵张+丙泊酚组HMGB1启动子的转录活性和HMGB1表达均明显降低(P<0.05)。结论丙泊酚在转录水平通过抑制机械牵张诱导HMGB1启动子的转录激活而影响HMGB1的表达,可能是丙泊酚防治机械牵张引起炎症反应的机制之一。     

小儿乙型流感病毒肺炎免疫特点分析

目的：探讨乙型流感病毒肺炎患儿免疫功能的变化特点。方法：采用回顾性分析方法,选取2011年12月至2012年2月在苏州大学附属儿童医院住院治疗的乙型流感病毒肺炎患儿70例,包括单纯乙型流感病毒肺炎27例（单纯感染组）和乙型流感病毒混合细菌感染肺炎43例（混合感染组）,以同期儿童保健门诊体检的健康儿童23例作为对照（对照组）,应用流式细胞仪检测外周血中T、B淋巴细胞和NK细胞亚群比例。结果：与对照组相比,单纯感染组和混合感染组CD3^＋、CD3^＋CD8^＋降低而CD3^-CD19^＋、CD19^＋CD23^＋增高（P均〈0.01）,混合感染组CD3^-CD16^＋CD56^＋降低（P〈0.05）,而单纯感染组和对照组CD3^-CD16^＋CD56^＋比较差异无统计学意义（P〉0.05）。三组间CD3^＋CD4^＋、CD4^＋/CD8^＋、CD4^＋CD25^＋比较差异均无统计学意义（P均〉0.05）。单纯感染组和混合感染组上述指标比较差异均无统计学意义（P均〉0.05）。结论：乙型流感病毒肺炎患儿免疫反应较轻,其NK细胞比例降低与混合细菌感染有关,临床工作中要注意鉴别,以便于积极防治。     

胺碘酮对Kv1.3通道电流的阻断和体外激活T淋巴细胞表型的影响研究

目的:研究胺碘酮对体外表达的Kv1.3通道的作用及对体外激活的CD3+CD4+和CD3+CD8+T淋巴细胞的作用,以阐明胺碘酮免疫调节的可能机制之一。方法:使用双电极电压钳技术记录表达于非洲爪蟾卵母细胞的Kv1.3钾通道电流,并观察胺碘酮对电流的影响。取分离的人外周血淋巴细胞分为正常未激活组、离子霉素和佛波酯激活组、激活后胺碘酮处理组,双抗体标记后流式细胞仪测定CD3+CD4+和CD3+CD8+相应比例。结果:胺碘酮可浓度依赖性阻断Kv1.3通道,阻断的半数有效浓度为3.43μmmol·L-1,阻断作用具有电压非依赖性;与正常未激活组比较,激活组CD3+CD4+/CD3+CD8+值无显著性差异(P>0.05)。与激活组比较,激活后胺碘酮处理组CD3+CD4+/CD3+CD8+值显著降低(P<0.01)。结论:胺碘酮阻断失活状态的Kv1.3通道,可能是其发挥调节免疫功能的机制之一。     

survivin基因启动子在多种肿瘤细胞株中的转录活性研究

目的:研究两个长度不同的survivin基因启动子在多种肿瘤细胞株中的活性。方法:利用脂质体将不同长度的sur-vivin基因启动子调控荧光素酶的报告基因载体瞬时转染HepG2、Lovo、SW480、AGS肿瘤细胞和3T3正常细胞,48 h后经荧光素酶检测,比较两个survivin基因启动子的活性。结果:两个不同长度的survivin基因近端启动子在多种肿瘤细胞株中均显示出较高的活性,其中以pGL3-Surp340的活性最高。结论:实验中使用的两个survivin启动子片段肿瘤细胞中有转录活性,在3T3正常细胞中活性低。其中survivin340启动子的活性明显高于survivin1430启动子,其有可能作为调控元件用于肿瘤的靶向性基因治疗。     

Effect of transforming growth factor-beta on activity of connective tissue growth factor gene promoter in mouse NIH ／ 3T3 fibroblasts

AIM: To investigate the regulatory mechanism of transforming growth factor-betaon activity of connective tissue growth factor promoter in mouse NIH/3T3 fibroblasts. METHODS: The regulation fragment of the 5' flanking region of the human CTGF gene was linked to pGL3-Basic vector, a firefly luciferase reporter construct without promoter. The recombinant plasmid pCTGF-luc was transiently transfected to NIH/3T3 fibroblasts. The activity of CTGF promoter after treatment of TGF-β1…     

小鼠核结合因子a1基因启动子报告载体的构建及鉴定

目的:构建小鼠核结合因子a1(Cbfa1)基因启动子萤光素酶报告载体,并检测其驱动报告基因的转录活性。方法:以小鼠基因组DNA为模板,巢式PCR扩增含有Cbfa1基因启动子(-1000～+200bp)的序列。限制性内切酶MluI和XhoI酶切这段序列后定向克隆到不含启动子的PGL3-Basic报告基因载体上,重组质粒命名为pGL3-Cbfa1。pGL3-Cbfa1瞬时转染成骨细胞系MC3T3-E1,检测其能否在Cbfa1基因启动子的调控下表达报告基因并提高萤光素酶活性。结果:pGL3-Cbfa1经酶切鉴定和序列分析证实与设计完全一致。细胞瞬时转染结果表明Cbfa1启动子具有转录活性,pGL3-Cbfa1的萤光素酶水平约是pGL3-Basic的35倍。结论:小鼠Cbfa1启动子报告基因载体的成功构建,为进一步将其用于抗骨质疏松药物的筛选与评价奠定了实验基础。     

雌激素/雌激素受体α信号通路抑制血管平滑肌细胞SM22α的转录作用

目的确定雌激素/雌激素受体α(ERα)信号通路对大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)分化标志基因SM22α的转录调节作用。方法利用组织块贴壁法分离获得大鼠VSMCs,采用PCR方法扩增获得大鼠SM22α,并插入到pGL3-Basic质粒中构建SM22α启动子荧光素酶报告基因质粒。分别在VSMCs和COS-7细胞中利用Lucif-erase检测雌二醇(E2)、ERα及Myocardin对SM22α启动子转录活性的影响情况。结果 SM22α启动子荧光素酶报告基因质粒构建成功,E2、ERα可以抑制Myocardin对SM22α的转录活性。结论 E2/ERα信号通路可通过抑制Myocardin对SM22α的转录活性,从而促进VSMCs由分化型向增殖型转变。