野生型斑马鱼胚胎中hoxd3基因mRNA的表达谱

目的:为探讨hoxd3基因在斑马鱼发育过程中与血管形成可能的作用机制,用hoxd3基因的反义mRNA探针进行斑马鱼全胚胎原位杂交,观测hoxd3基因在野生型斑马鱼胚胎发育过程中的表达情况。方法:提取斑马鱼胚胎总RNA,经RT-PCR扩增斑马鱼hoxd3基因片段,将得到的hoxd3基因片段和pCS2+质粒经EcoR I、Xba I双酶切后插入pCS2+质粒中,挑选阳性克隆,通过双酶切、菌落PCR以及测序鉴定;将pCS2+-hoxd3重组子经EcoR I酶切线性化,经T3RNA体外转录体系合成地高辛标记hoxd3基因的反义mRNA探针。用hoxd3基因的反义mRNA探针进行斑马鱼全胚胎原位杂交。结果:构建和鉴定了pCS2+-hoxd3重组质粒,经斑马鱼全胚胎原位杂交检测hoxd3基因的表达,发现在Tuebingen野生型斑马鱼24 hpf-72 hpf胚胎的中脑后脑交界处以及后脑中可以观察到hoxd3基因的表达。结论:hoxd3基因在Tuebingen野生型斑马鱼胚胎发育早期的神经系统高表达,未发现在血管生成区域的表达。     

Pax5基因在野生型斑马鱼全胚胎发育早期的表达

[摘要]：目的 构建斑马鱼pCS2+-pax5重组质粒,经体外转录合成斑马鱼pax5基因的反义mRNA探针。方法 提取斑马鱼胚胎总RNA后经RT-PCR克隆斑马鱼pax5基因片段,将得到的pax5基因片段和pCS2+质粒经EcoRⅠ、XbaⅠ双酶切后插入pCS2+质粒中,通过对重组质粒进行双酶切、菌落PCR以及插入片段序列测定鉴定后,经T3 RNA体外转录体系合成地高辛标记的pax5基因的反义mRNA探针。结果 采用RT-PCR和pCS2+载体等相关技术获得了斑马鱼pax5基因克隆,经酶切、菌落PCR以及测序鉴定证明得到了pCS2+-pax5重组质粒以及pax5基因的反义mRNA探针,经过斑马鱼全胚胎原位杂交技术检测了斑马鱼pax5基因在野生型斑马鱼发育过程中的表达情况。结论 成功构建了pCS2+-pax5重组质粒、制备了pax5基因的反义mRNA探针以及完成了野生型斑马鱼不同时相的全胚胎原位杂交。     

pCS~(2+)-FLASH重组质粒的构建及斑马鱼FLASH基因反义mRNA探针的制备

目的构建斑马鱼pCS2+-FLASH重组质粒,制备斑马鱼FLASH反义mRNA探针。方法提取斑马鱼胚胎总RNA后经RT-PCR克隆斑马鱼FLASH基因片段,将得到的FLASH片段和pCS2+质粒用BamHⅠ及HindⅢ双酶切后插入pCS2+质粒,通过对重组质粒进行双酶切及插入片段序列测序鉴定后,经T3RNA体外转录体系合成DIG-FLASH基因反义mRNA探针。结果RT-PCR法扩增出长度为533bp的特异性产物,构建的pCS2+-FLASH重组质粒经酶切鉴定和测序结果与预期相符;用FLASH反义mRNA探针进行斑马鱼全胚胎原位杂交,观察到FLASH在野生型斑马鱼神经系统中存在表达。结论成功构建了pCS2+-FLASH重组质粒及FLASH基因反义mRNA探针。     

HOXC4基因在斑马鱼早期胚胎发育过程中的表达

目的 探讨HOXC4基因在斑马鱼早期胚胎发育过程中的作用机制,从而为进一步研究其在造血发育中的功能奠定基础.方法 提取斑马鱼总RNA,利用RT-PCR克隆得到HOXC4基因片段,将克隆得到的基因片段和载体pCS2+用限制性内切酶BamHⅠ和Xho Ⅰ双酶切后,把基因片段插入pCS2+中,重组质粒经双酶切及测序鉴定后,采用T3 RNA聚合酶体外转录体系制备地高辛标记的HOXC4基因反义mRNA探针,然后行全胚胎原位杂交.结果 构建HOXC4-pCS2+重组质粒,获得地高辛标记的反义mRNA探针并且完成其在野生型斑马鱼中的全胚胎原位杂交,显示HOXC4基因在Tuebingen野生型斑马鱼神经系统高表达.结论 得到HOXC4基因在斑马鱼早期胚胎发育过程中的基本表达情况,为进一步研究该基因在造血发育过程中的功能奠定了基础.     

腺苷酸活化的蛋白激酶在食管鳞癌中的表达及其临床意义

【摘要】 目的探讨HOXC4基因在斑马鱼早期胚胎发育过程中的作用机制,从而为进一步研究其在造血发育中的功能奠定基础。方法提取斑马鱼总RNA,利用RT-PCR克隆得到HOXC4基因片段,将克隆得到的基因片段和载体pCS2+用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后,把基因片段插入pCS2+中,重组质粒经双酶切及测序鉴定后,采用T3RNA聚合酶体外转录体系制备地高辛标记的HOXC4基因反义mRNA探针,然后行全胚胎原位杂交。结果构建HOXC4-pCS2+重组质粒,获得地高辛标记的反义mRNA探针并且完成其在野生型斑马鱼中的全胚胎原位杂交,显示HOXC4基因在Tuebingen野生型斑马鱼神经系统高表达。结论得到HOXC4基因在斑马鱼早期胚胎发育过程中的基本表达情况,为进一步研究该基因在造血发育过程中的功能奠定了基础。     

rpl15在斑马鱼胚胎中的表达形式探究

目的探究rpl15基因在野生型斑马鱼胚胎中的表达形式。方法利用NCBI和Ensemble数据库进行rpl15基因的共线性分析和Rpl15蛋白质序列相似性分析,使用MEGA X软件绘制进化树;构建pCS2~+-rpl15重组质粒,再利用T3聚合酶制备地高辛标记的rpl15反义RNA探针,用全胚胎原位杂交检测rpl15基因的mRNA水平的表达;通过Western blot检测24、48和72 hpf斑马鱼胚胎中Rpl15蛋白的表达。结果在进化过程中,rpl15基因相对保守。构建了pCS2~+-rpl15重组质粒,原位杂交结果显示在24 hpf,rpl15基因在斑马鱼的几乎所有细胞中广泛表达;到48 hpf,rpl15在中枢神经系统的表达最强并且在胰腺的表达也开始显现; 72 hpf仍然可见rpl15在后脑中的表达以及胰腺、肝和肠道中的表达。Western blot结果显示24、48和72 hpf斑马鱼胚胎中Rpl15蛋白的相对表达量随时间增加而增多。结论系统观察了斑马鱼发育过程中rpl15的表达部位及表达水平的变化,为斑马鱼rpl15缺失模型的建立提供了实验基础。     

Rap1基因在斑马鱼胚胎早期发育过程中的时空表达谱研究

目的：选择斑马鱼作为实验动物模型,研究Rap1基因在胚胎早期发育过程中的时空表达规律。方法从斑马鱼胚胎cDNA中克隆Rap1基因片段,将Rap1基因片段和pCS2＋质粒进行体外连接重组,重组质粒经双酶切、菌落聚合酶链反应（PCR）及测序鉴定正确后,经T3RNA体外转录体系合成DIG标记的Rap1基因反义mRNA探针,采用整胚原位杂交方法检测Rap1在斑马鱼胚胎早期发育过程的表达情况。结果在斑马鱼胚胎0．75 hpf的细胞分裂连接处、3．70 hpf和6．00 hpf的动物极、12．00～72．00 hpf的脊索神经部位均可见Rap1基因的阳性杂交信号。结论 Rap1基因在斑马鱼脊索神经系统的早期发育过程中可能起到重要的调控作用。     

地高辛标记斑马鱼cd99l2基因RNA探针的制备

目的 制备用于斑马鱼胚胎早期cd99l2基因时空表达检测的地高辛标记RNA探针.方法 设计引物,构建cd99l2/pGM-T重组质粒,用SacII和SalI分别进行酶切得到线性化DNA片段,以Sp6 RNA聚合酶和T7RNA聚合酶转录合成地反义和正义地高辛标记的RNA探针,用整体原位杂交法检测斑马鱼胚胎早期cd99l2基因的表达.结果 成功构建了cd99l2/pGM-T重组质粒,体外转录获得反义和正义RNA探针,反义探针杂交检测证实cd99l2基因在斑马鱼胚胎早期发育过程中中枢神经系统呈现高表达,正义探针未检测到表达信号.结论 本研究制备的反义cd99l2 RNA探针,兼顾了特异性和敏感性,能有效检测斑马鱼胚胎早期cd99l2基因的定位表达,而正义探针可以作为阴性对照,为进一步探究cd99l2基因在斑马鱼发育过程中的作用机制奠定了基础.     

ptges3a基因在斑马鱼早期胚胎发育过程中的表达

目的克隆斑马鱼前列腺素E合酶3a(prostaglandin E synthase 3a,ptges3a)基因,研究其在斑马鱼胚胎早期发育中的表达情况。方法提取斑马鱼胚胎的总RNA,制备DIG标记的ptges3a RNA反义探针,整胚原位杂交研究ptges3a在斑马鱼胚胎早期发育过程的表达。结果 ptges3a在shield期前普遍性表达,10体节期在后脑神经龙骨处有特异性表达,18体节期在后脑有特异性表达,在26 hpf时期头部表达较多,并且在肾小管有特异性表达,36 hpf ptges3a在头部较高表达。结论 ptges3a可能参与了脑部发育和肾小管形成。     

斑马鱼mcm3合子基因敲除实验模型的构建与鉴定

目的 构建斑马鱼mcm3合子基因突变体,研究mcm3合子基因在斑马鱼胚胎早期发育中的作用.方法 利用系统发育树分析不同物种间mcm3基因的保守性;利用国家生物技术信息中心(NCBI)网站及Jalview软件序列比对,分析斑马鱼MCM3蛋白与人类MCM3蛋白之间的氨基酸同源性;用CRISPR/Cas9技术构建可稳定遗传的斑马鱼mcm3合子基因缺失突变体;提取胚胎的基因组DNA后进行基因测序,检测斑马鱼mcm3合子基因突变类型;利用原位杂交检测mcm3突变体中mcm3 mRNA的表达水平.结果 斑马鱼合子基因mcm3与人类mcm3基因同源,且高度保守;可稳定遗传的mcm3合子基因突变体成功构建;在mcm3突变体斑马鱼中,胚胎从第3天开始出现头和眼睛,其外部表型较野生型斑马鱼小,且mcm3纯合子胚胎在第8天后相继死亡;运用整胚原位杂交发现,mcm3在野生型斑马鱼的头部、眼睛、中后脑边缘、鳃、胸腺及内胚层组织中高表达,但在mcm3突变体斑马鱼中,mcm3 mRNA的表达水平明显降低.结论 斑马鱼mcm3基因缺失突变体成功构建,并且mcm3基因在斑马鱼的早期胚胎发育中起重要作用.     

斑马鱼cdh5基因的克隆与鉴定

目的：克隆并鉴定斑马鱼cdh5基因,为研究cdh5在血管生成和造血发育中的作用奠定基础。方法：收集斑马鱼胚胎,提取斑马鱼全胚胎的总RNA,经体外逆转录制备成cDNA,通过RT—PCR方法克隆斑马鱼cdh5基因,克隆出的目的片段通过酶切和测序进行鉴定。结果：成功提取符合实验要求的斑马鱼总RNA,并克隆出cdh5全长,测序后比对正确。结论：成功克隆cdh5全长序列。     

COX基因在斑马鱼胚胎早期发育过程中的表达

目的克隆斑马鱼COX-1、COX-2a基因,研究其在斑马鱼胚胎早期发育中的表达情况。方法提取24 h斑马鱼胚胎的总RNA,制备DIG标记的COX-1、COX-2a RNA反义探针,整胚原位杂交研究COX-1、COX-2a在斑马鱼胚胎早期发育过程中的表达。结果 COX-1在囊胚期和原肠胚期为弥散性表达,18 h集中表达在后部躯干,到24 h,COX-1在输尿管和远端脊索处有表达,24～36 h,头部表达量高,48 hCOX-1的表达弱。COX-2a在原肠胚期前不表达,在10.8 h开始表达,位于前端神经外胚层,在26 h,COX-2a在前脑、小脑和后脑有特异性表达。结论明确了COX-1、COX-2a基因在斑马鱼胚胎发育过程中的表达模式,为研究该基因功能提供了一定的理论基础。     

斑马鱼rnf141基因结构与表达分析

目的:探讨斑马鱼rnf141基因在物种间进化以及在斑马鱼胚胎发育和成体中表达分布特点.方法:采用生物信息学方法分析斑马鱼rnf141基因结构特征;运用胚胎整体原位杂交和多组织RT-PCR技术分别检测斑马鱼胚胎发育不同阶段和成体各组织rnf141基因表达情况.结果:斑马鱼RNF141蛋白与人类和小鼠同源蛋白(ZNF230、Znf230)分别具有79.8%、78.5%的同源性,其中C3HC4型锌指结构域及其保守的半胱氨酸和组氨酸残基组成与人类(或小鼠)的同源性分别为84.8%、100%;而且,斑马鱼RNF141蛋白与人类ZNF230蛋白在C3HC4型锌指区域具有完全相同的二级结构.杂交结果显示,rnf141基因在斑马鱼胚胎中广泛表达,尤以端脑、小脑和后脑表达丰度为高.RT-PCR结果表明,rnf141基因在受检的成体组织中均有表达,但在睾丸组织中表达丰度较高.结论:斑马鱼rnf141基因为脊椎动物保守基因,并可能在胚胎发育和精子发生过程中起着重要作用.     

MIA影响非洲爪蟾胚胎中胚层的形成

目的:探讨黑色素瘤抑制蛋白(melanoma inhibitory activity,MIA)在非洲爪蟾早期胚胎发育中的作用?方法:根据热带爪蟾MIA序列在非洲爪蟾EST数据库中找到MIA序列,利用RT-PCR扩增全长序列并克隆至pCS2+,用于测序?利用RT-PCR检测胚胎发育各阶段MIA mRNA的表达?通过显微注射特异的反义寡核苷酸morpholino(MO)敲降MIA;利用整胚原位杂交检测胚层标志性基因的表达?结果:克隆出非洲爪蟾MIA全长序列?在胚胎发育过程中MIA从受精卵开始持续表达?敲降MIA导致胚胎胚孔闭合延缓,中胚层标志基因xbra表达明显受抑,而内胚层标志性基因sox17α表达无明显改变?结论:MIA表达于非洲爪蟾胚胎发育各阶段,敲降MIA抑制中胚层的形成?     

zili在斑马鱼早期胚胎发育胚层分化中作用的初步研究

目的 探讨斑马鱼胚胎发育早期,piwil2基因(zili)对外胚层、中胚层、内胚层分化的影响.方法 设计并合成zili-MO和zili-cMO两条吗啡啉修饰的反义核苷酸,构建zili基因的表达载体并体外合成mRNA.制备外、中、内胚层标志基因(gsc、eve1、sox17)的反义RNA探针.对单细胞期胚胎分别进行显微注射zili-MO、zili-cMO或zili mRNA,采用整胚原位杂交技术检测标志基因的表达变化.结果 整胚原位杂交检测结果表明,在注射了zili-MO后zili表达下调,外胚层及中胚层标志基因gsc的表达减弱.外胚层标志基因eve1的表达增强,表达sox17基因的内胚层细胞数量减少.在注射了zili mRNA后zili表达上调,外胚层及中胚层标志基因gsc的表达增强,外胚层标志基因evel的表达减弱,表达sox17基因的内胚层细胞数量减少.结论 zili在胚胎发育早期对外胚层、中胚层、内胚层的分化均起到了一定的作用,而且对于维持正常胚胎发育也具有重要作用.     

一种新的斑马鱼cloche突变体亚型的基因鉴定

目的斑马鱼cloche172突变体的基因鉴定。方法采用化学诱变剂N-乙基-N-亚硝基脲(N-ethyl-N-nitrosourea,ENU)诱变雄性野生型AB斑马鱼,实施大规模正向遗传学方法筛选髓系细胞标记物lysozymeC(lyC)表达缺失突变体,并对其中一个名为cloche172突变体进行大体形态学观察,基因定位克隆和遗传学互补实验。结果大规模正向遗传学筛选出4个lyc表达缺失突变体,其中一个cloche172突变体受精后3d(day post fertilization,dpf)时期大体形态改变与已知但基因不明的cloche突变体相似。遗传学互补实验观察到有1/4胚胎出现类似cloche突变体的表型。同时,cloche172突变体基因定位在13号染色体近端粒的区域,与cloche突变体基因定位区域一致。而o-dianisdine实验证实cloche172突变体有较多红细胞聚集,cloche突变体仅有少量在尾部存在。结论cloche172基因与cloche基因定位一致,cloche172突变体是一个新的点突变位点的cloche突变体。     

HPV6b野生型E7基因与优化密码E7基因mRNA表达的分析

目的:构建人乳头瘤病毒6b型(HPV6b)E7基因重组真核表达质粒,比较优化密码E7基因(hu-E7)与野生型E7基因(wtE7)在mRNA水平的表达差异,初步探讨优化密码增强E7基因表达的机制。方法:EcoRI和KpnI双酶切pUC-wtE7质粒,游离wtE7片段,定向克隆入pcDNA3的EcoRI和KpnI位点,构建含wtE7的重组真核表达质粒pcDNA3-wtE7;与含hu-E7的pcDNA3-huE7质粒同时体外脂质体转染人羊膜细胞(wish细胞),提取细胞总RNA,采用RT-PCR方法,以β-actin做内参照半定量分析比较hu-E7与wtE7在wish细胞内的mRNA表达水平。结果:用EcoRI和KpnI双酶切重组表达质粒pcDNA3-wtE7可释放5.4kb和314bp两片段,说明质粒构建正确。RT-PCR结果显示,HPV6b-huE7与HPV6b-wtE7转染组在预计分子量190bp处均有明显特异性条带,对照组则无。凝胶成像分析仪半定量结果分析,二者无明显差异,无统计学意义P>0.05。结论:成功构建pcDNA3-wtE7真核表达质粒,并在wish细胞中获得特异性E7mRNA表达。HPV6b-hu-E7与HPV6b-wtE7基因在wish细胞内特异性E7mRNA的表达水平没有明显差异。