应用组织工程口腔黏膜重建尿道的初步实验研究

目的 探讨兔口腔黏膜细胞的体外培养方法,并以其为种子细胞与异体膀胱黏膜下脱细胞基质(bladder acellular matrix graft,BAMG)复合,构建组织工程尿道. 方法 18只10周龄雄性新西兰大耳白兔,体重0.3～0.5 kg.取其中12只兔口腔黏膜组织,分离获得口腔黏膜细胞.将口腔黏膜细胞分别接种于有3T3细胞及无3T3细胞的培养皿进行培养,接种后第2天于倒置相差显微镜下观察细胞形态变化,绘制细胞生长曲线,观察生长增殖情况,并行免疫荧光组织化学染色鉴定.取余6只兔膀胱,经脱细胞处理制备BAMG,随机取1 cm×1 cm组织行HE染色,观察脱细胞效果.将接种于有3T3细胞培养皿培养获得的第2代口腔黏膜细胞种植于BAMG上,培养1周后,行HE染色及扫描电镜观察口腔黏膜细胞与BAMG的复合状况. 结果 倒置相差显微镜下观察,接种于有3T3细胞培养皿的口腔黏膜细胞可传至7～8代,其细胞形态均一,功能良好;无3T3细胞培养皿的口腔黏膜细胞形态多样,传至第2代时,即开始出现老化.细胞生长曲线显示,两种方法培养的口腔黏膜细胞均于第8天开始呈对数增长,第14天达峰值.接种于有3T3细胞培养皿的口腔黏膜细胞,培养至融合时所获得细胞数量明显多于接种于无3T3细胞培养皿的u腔黏膜细胞.两种方法培养的口腔黏膜细胞行免疫荧光染色,均呈绿色荧光.HE染色观察,BAMG经脱细胞处理后未见细胞,脱细胞效果良好.复合培养1周后,HE染色及扫描电镜观察口腔黏膜细胞与BAMG复合良好. 结论 兔口腔黏膜细胞可在体外成功培养、扩增,与同种异体BAMG复合后生长良好,为构建组织工程尿道提供了一种新的选择.     

人包皮脱细胞基质组织工程化尿道的可行性研究

目的:为人包皮脱细胞基质作为尿道组织工程修复材料提供依据。方法:制备人包皮脱细胞基质,对其进行组织学观察、细胞毒性以及体内实验,检验其作为尿道材料的安全性和组织相容性。结果:制备的人包皮脱细胞基质,细胞去除完全,用原代包皮上皮细胞测定其细胞毒性,结果显示细胞相对增值率在75%～99%之间,细胞毒性为1级,符合国家标准,回植体内后,随着时间的延长,人包皮脱细胞基质与尿路上皮细胞结合完好,正常尿道复层结构层次逐步恢复。结论:人包皮脱细胞基质抗原性低,相容性好,可以作为组织工程尿道的支架材料。     

脂肪干细胞复合膀胱脱细胞基质促进膀胱再生的实验研究

目的 探讨脂肪干细胞(adipose-derived stem cell,ADSC)在兔的组织工程膀胱重建中的应用.方法 采用自体脂肪干细胞和膀胱脱细胞基质(bladder acellular matrix graft,BAMG)构建兔组织工程膀胱.应用酶消化法分离培养兔自体的ADSC,并进行流式细胞鉴定.对新鲜的兔膀胱组织进行脱细胞处理制得BAMG.将ADSC扩增后接种于BAMG表面并进行体外培养,获得组织工程膀胱.对24只雄性新西兰兔行40％ ～ 50％膀胱部分切除,分为实验组和对照组,每组12只.实验组采用自体培养的ADSC构建的组织工程膀胱对缺损膀胱进行修复,对照组采用单纯的BAMG进行修复.术后24周进行膀胱造影并取材观察组织修复再生情况. 结果 镜下观察ADSC贴壁后绝大多数为纺锤形,细胞之间以细丝拉网.流式细胞仪检测结果CD90、CD4、CD105、CD166、CD34表达均为阳性,CD106、CD45表达为阴性.ADSC种植于BAMG表面生长良好.修补24周后,对照组和实验组膀胱容量分别为术前的(69.33 ±5.05)％和(94.68±3.31)％.组织染色分析对照组显示上皮层正常,黏膜下纤维组织增生而肌层较薄;实验组则显示了与自体膀胱相似的正常的3层组织结构. 结论 采用ADSC和BAMG构建组织工程膀胱是理想的膀胱替代修补材料.     

脱细胞基质载体和表皮细胞结合构建尿道的实验研究

目的探索组织工程修复技术在尿道构建中的应用前景。方法采用同种异体家兔膀胱,经显微外科分离和脱细胞液处理,制成无细胞的生物支架,12只雄兔随机分为成实验和对照2组,剥离实验对象尿道黏膜2cm;实验组切取小块兔包皮组织,消化收集分离出的表皮细胞,经过增殖、传代培养,植入生物支架中,培养2周,并加入Brdu标记物,将其卷成管状,植入实验组人工尿道缺损区域;对照组单纯采用无细胞植入的生物支架修复尿道;术前和术后1、2、6个月每组各处死2只家兔/批,分别行尿道造影、大体外形、修复段尿道黏膜的HE染色、免疫组化和荧光标记。结果术后动物伤口愈合正常,排尿通畅,无尿瘘发生。修复尿道大体形态和尿道造影显示带细胞修复的尿道形态完整,清晰宽敞,无狭窄发生;术后1个月,HE和免疫组化显示,修复段尿道黏膜层次单一,缺乏复层和乳头结构。术后2个月基本恢复正常尿道结构,复层上皮结构形成,角蛋白染色阳性。术后6个月黏膜复层上皮结构更为丰富,角蛋白染色阳性;Brdu标记在术后1个月清晰显示植入上皮细胞层存在,术后2个月植入的原始上皮细胞显影稀少。术后6个月尿道黏膜结构中未见显影;而单纯生物支架修复组的实验对象则出现排尿变细,任何观察时段,均出...     

采用肌卫星细胞及异种无细胞基质构建组织工程膀胱的研究

目的探讨应用组织工程膀胱进行膀胱替代修复的可行性。方法采用自体肌卫星细胞（MDSC）和猪膀胱无细胞基质（PBAM）构建兔组织工程膀胱。应用Percoll非连续密度梯度离心法分离纯化培养兔MDSCs，采用去污剂洗涤法对新鲜猪膀胱进行脱细胞处理获得PBAM。MDSCs接种于PBAM表面并进行短暂体外培养，获得组织工程膀胱。雄性新西兰兔行膀胱大部分切除术，分别采用PBAM及构建的组织工程膀胱进行替代修补，每组6只，1、4、8、12周后进行膀胱造影并取材观察修复组织再生情况。结果非连续密度梯度离心法所得细胞纯度〉90％。酶消化法能有效去除膀胱中细胞成分，光镜及电镜观察无细胞成分残留，细胞毒性测定为1级，细胞相容性好。1周后所构建组织工程膀胱修补吻合区生长良好，12周后修补区组织结构基本接近正常膀胱。容积达到正常膀胱的80％，2组比较差异有统计学意义（P〈0．05）。结论采用MDSC及PBAM构建的组织工程膀胱是理想的膀胱替代修补材料。     

膀胱平滑肌细胞与膀胱脱细胞基质的生物相容性研究

目的:研究膀胱平滑肌细胞与膀胱脱细胞基质(BAM)的生物相容性。方法:分离培养兔膀胱平滑肌细胞,采用α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)抗体进行鉴定。将以1×10 5个/mL的单细胞悬液均匀接种于制备BAM支架上,通过与单独培养的膀胱平滑肌细胞作对照,绘制两组细胞生长曲线图,对比观察两条生长曲线的差异性。 ...     

冻干无细胞膀胱黏膜下基质修复兔尿道缺损

目的　探讨冻干无细胞膀胱黏膜下基质修复尿道缺损的效果。方法　应用反复冻融-酶法及冷冻干燥技术制备冻干无细胞人体膀胱黏膜下基质。 18只新西兰白兔建立尿道中段部分缺损模型 ,尿道缺损面积约 1 0cm× 0 5cm。其中 14只兔作为实验组 ,以冻干无细胞膀胱黏膜下基质修补尿道缺损 ,术后 1、2、3、4、8、12、2 4周分别取 2只行逆行性尿道造影 ,观察尿道情况 ,并采取尿道组织进行大体、组织学及超微结构观察 ;4只兔作为对照组 ,未采用任何材料修补尿道缺损 ,直接缝合尿道海绵体包膜、皮下组织及阴茎皮肤 ,术后 2、4周分别取 2只行逆行性尿道造影 ,采取尿道组织进行大体观察。结果　实验组 14只兔均未发现明显的尿道狭窄。冻干无细胞膀胱黏膜下基质组织相容性良好 ,移植后无细胞膀胱黏膜下基质内有细胞长入 ,新生血管形成 ,术后 2周无细胞膀胱黏膜下基质移植区完全上皮化。随着移植时间的延长 ,移植区胶原纤维排列由紊乱趋于规则。结论　冻干无细胞膀胱黏膜下基质能够诱导尿道黏膜细胞迁徙、生长和上皮化 ,初步认为可以作为尿道缺损修复材料。     

组织工程化膀胱壁复层结构的体外构建

目的 探讨膀胱缺损组织工程修复方法.方法 机械法去除膀胱黏膜层、肌层和浆膜层,仅保留膀胱黏膜下层.经SDS、Trixon-100和三蒸水处理去除细胞结构,制备获得膀胱脱细胞基质移植物(BAMG)作为支架材料.取成年猪膀胱壁,机械法分离膀胱肌层和黏膜层.以酶消化法分别获取膀胱尿路上皮细胞和平滑肌细胞.常规细胞传代和扩增后,将膀胱平滑肌细胞和尿路上皮细胞分别接种在BAMG浆膜面和黏膜面.细胞-材料复合物体外培养4周并行组织学鉴定.结果 HE和Masson染色鉴定发现,BAMG以胶原成分为主,内部未见明显细胞残留.免疫荧光方法鉴定结果显示,膀胱尿路上皮细胞uroplakin Ⅱ阳性,膀胱平滑肌细胞α-平滑肌肌动蛋白阳性.体外培养4周后,BAMG浆膜面和黏膜面分别形成连续的复层结构尿路上皮层和膀胱平滑肌层,免疫组化显示平滑肌层α-平滑肌肌动蛋白表达阳性,尿路上皮层广谱角蛋白表达阳性.结论 以膀胱脱细胞材料作为支架,尿路上皮细胞和膀胱平滑肌细胞作为种子细胞,能够在体外构建形成包含膀胱黏膜层及平滑肌层的复层膀胱壁结构.细胞-材料复合物的体外构建将为体内膀胱缺损的组织工程修复提供实验依据.     

小肠黏膜下脱细胞基质修复前尿道狭窄的疗效分析

目的 探讨小肠黏膜下脱细胞基质(small intestinal submucosa,SIS)修复前尿道狭窄的可行性和有效性.方法 2009年6月至2010年8月采用4层SIS补片修复治疗尿道狭窄患者18例.患者年龄20～69岁,平均38岁;尿道狭窄段3.5～7.0 cm,平均4.6 cm;术前最大尿流率1.5～5.5 ml/s,平均3.8 ml/s.术中按需将SIS(长4.0～7.5 cm,宽 2.0 cm)植入尿道背侧缺损处,5-0可吸收线将SIS间断固定在阴茎海绵体上,SIS两侧与已剪开的狭窄段尿道作连续缝合,两端分别与尿道断端作间断吻合.结果 手术过程顺利,术后恢复好.随访6～18个月,平均10个月,患者未发生感染、排斥反应等并发症.17例排尿通畅,最大尿流率14.0～44.0 ml/s,平均25.4 ml/s.尿道造影显示尿道通畅;术后4、6周尿道镜检查示SIS移植物与周围组织分界清楚;术后14周尿道镜检查SIS已降解,修复段尿道与周围组织间限消失,黏膜光洁完整,管腔无明显狭窄;植入SIS部位活检显示黏膜表层为上皮细胞.1例尿道下裂术后患者术后5个月出现轻度尿道狭窄症状,行尿道扩张治疗.结论 利用SIS修复尿道狭窄具有创伤小、抗感染力强的特点,可作为组织工程尿道修复重建材料修复部分尿道狭窄患者.

Abstract：

Objective To investigate the feasibility of using small intestinal submucosa (SIS) graft for the repair of anterior urethral strictures. Methods From June 2009 to August 2010, 18 men (mean age, 38 yrs) with anterior urethral strictures underwent urethroplasty using a four-layer SIS as an onlay patch graft. SIS was used to augment the urethral caliber at the stricture site. The mean stricture length was 4.6 cm (range 3.5 to 7 cm). The pre-operative mean maximal flow rate was 3.8 ml/s (range 1.5 to 5.5 ml/s). The required SIS grafts (4 to 7.5 cm long and 2 cm wide) were positioned into the urethrotomy defect and were spread-fixed to the corpora cavernosa using 5-0 polyglactin interrupted sutures. Two apices of the graft were sutured to the proximal and distal apices of the urethrotomy with 5-0 polyglactin interrupted stitches. The margins of the opened urethra were sutured to the SIS patch with 5-0 polyglactin running sutures. Results The mean follow-up period was 10 mon. (range 6-18 mon.). No postoperative complication, such as infection or rejection related to the use of heterologous graft material was observed. Seventeen patients voided well postoperatively with the mean peak urine flow of 25.4 ml/s (14-44 ml/s). Cystoscopy revealed that at four weeks and six weeks, the SIS graft was well distinguishable from the normal surrounding tissue; and at 16 weeks, the urothelium was regenerated and the biomaterial was not distinguishable from the normal surrounding tissue. The squamosal epithelium was seen in the histological examination of the grafts. The remaining one patient with failed hypospadias developed a slight urethral narrowing at five months post-operatively and needed sound dilatations. Conclusions SIS matrix appears to be a safe and effective reconstructive material in selected urethral reconstructions.     

脱细胞膀胱粘膜下筋膜修复尿道的实验研究

目的探索组织工程方法在尿道修复中的应用。方法将12只雄兔作为实验对象,切除部分尿道的全周粘膜,长度分1cm以内(Ⅰ组)和2cm以上(Ⅱ组)两组,将制备完成的同种家兔膀胱粘膜下脱细胞筋膜用可吸收线,缝合到尿道缺损处,术后2周、6周分别处死一批实验对象,通过尿道造影,大体观察,修复段组织切片HE染色光镜研究和免疫组化等来研究修复段尿道的解剖和组织学变化。结果Ⅰ组仅1只(1/6)发生尿瘘,其余尿道造影显示尿道基本通畅；而Ⅱ组4只(4/6)发生狭窄(不伴尿瘘),1只(1/6)发生尿瘘；术后2周两组植入筋膜依然存在；术后6周时,尿道植入筋膜已降解,Ⅰ组的修复段尿道已全部被宿主自身粘膜所覆盖,粘膜光洁完整,管腔无明显狭小；Ⅱ组的修复段尿道中间苍白增厚,致密坚硬且管腔狭小。结论单纯脱细胞膀胱粘膜下筋膜能修复短距离兔尿道缺损,而对长距离缺损修复效果不理想。     

Functional improvement in spinal cord injury-induced neurogenic bladder by bladder augmentation using bladder acellular matrix graft in the rat

Spinal cord injury (SCI) rostral to the lumbosacral level causes bladder hyperreflexia and detrusor-sphincter dyssynergia (DSD), which are accompanied by bladder hypertrophy. We hypothesize that bladder augmentation using a bladder acellular matrix graft (BAMG) can improve the function of SCI-mediated neurogenic bladder. In female rats (n = 35), SCI was induced by transection of the spinal cord at the lower thoracic level. Eight weeks following spinalization, bladder augmentation using BAMG was performed after hemicystectomy of the hypertrophic bladder. Cystometrography was performed at 8 weeks after spinalization and again at 8 weeks after augmentation. Several urodynamic parameters were measured and the grafted bladder was histologically evaluated. Thirty one rats were alive 8 weeks after spinalization. Twenty two (71%) rats developed hyperreflexic bladders and nine (29%) rats had underactive bladders before bladder augmentation. Twenty six rats survived until 8 weeks after augmentation. Urodynamic parameters showed improvement in some bladder functions in both hyperreflexic and underactive bladders after augmentation. In addition, bladder compliance was increased in hyperreflexic bladders and decreased in underactive bladders. Bladder augmentation decreased bladder capacity in high-capacity rats and increased it in low-capacity rats. Histological evaluation showed complete regeneration of BAMG in SCI-induced neurogenic bladder at 8 weeks after augmentation. This is the first report suggesting that the voiding function in SCI-induced neurogenic bladder can be improved by augmentation using BAMG. Improved voiding function was accompanied by histological regeneration of BAMG.     

异体脱细胞真皮基质与自体皮片复合移植的临床应用

目的:探讨异体脱细胞真皮基质与自体皮片复合移植修复大面积深度烧伤及瘢痕切除后皮肤缺损创面及其愈合后皮肤的外形和功能。方法:应用异体脱细胞真皮基质与自体刃厚皮片组成复合皮移植,以自体刃厚皮片移植作为对照,采用一步移植法治疗切痂后大面积深度烧伤创面及瘢痕切除后皮肤缺损共56例患者60处创面,观察术后皮片的成活情况、外形及功能恢复情况并随访。结果:60处创面全部愈合,移植皮片生长良好,瘢痕增生不明显,未见明显挛缩,皮肤弹性较好。在6～12个月的观察期内,自体刃厚皮片与异体脱细胞真皮基质复合移植后,功能和形态优于单纯自体刃厚皮片移植;随访2年复合移植未发现明显的排异反应。结论:异体脱细胞真皮基质与自体皮片复合移植修复大面积深度烧伤及瘢痕切除后皮肤缺损创面愈合良好,无瘢痕增生,皮肤外观功能满意,无排异反应。     

尿路上皮细胞和膀胱脱细胞基质的相容性研究

目的 研究尿路上皮细胞(UCs)和膀胱脱细胞基质(BAM)的生物相容性.方法 分离培养兔UCs,以1.0×105/cm2均匀接种于BAM上,观察细胞的粘附、生长及增殖.将复合物种植于兔背部皮下检测其组织相容性.结果 典型的UCs呈多角形的“铺路石样”结构,抗CK AE1/AE3抗体免疫组化阳性证实为上皮细胞;BAM内部未见细胞碎片,可见排列规则而紧密连接成网状的胶原纤维;细胞种植到支架上一周后,行HE染色检测显示膀胱上皮细胞在BAM上贴附生长良好;生长曲线显示,实验组和对照组生长曲线相似.结论 UCs在BAM表面生长良好,相容性较好,是组织工程良好的种子细胞.