数字PCR与荧光PCR方法鉴别餐厨废弃植物油的比较

目的通过与荧光PCR技术相比较,初步判断数字PCR技术在鉴别餐厨废弃植物油领域的应用前景。方法采用微滴式数字PCR和荧光PCR技术扩增动物源性同源异形盒家族HOXC6基因鉴别餐厨废弃植物油,比较2种检测方法的灵敏度、精密度及准确率。结果数字PCR相对于荧光PCR方法,其检测灵敏度高1个~2个数量级,但其重复测定的相对标准偏差明显高于荧光PCR法。数字PCR和荧光PCR法对2类餐厨废弃植物油的检测准确率分别为62.5%和56.3%。结论数字PCR检测灵敏度和准确率略高于荧光PCR法,而数字PCR检测的稳定性和精密度略低于荧光PCR法。此外,荧光PCR相对于数字PCR仪价格较低,使数字PCR相比荧光PCR技术在餐厨废弃植物油鉴别领域的应用优势并不显著。     

子代T4的PCR和real time PCR测定

目的：为建立通过测定转换样品T4而检验样品大肠杆菌的新方法,探讨快速测定转换样品中T4的PCR技术.方法：以T4DNA纯化样品水稀释液和转换样品沸水浴处理产物分别为模板样液,经过两对引物PCR及real time PCR的试用和比较,优选定量检测转换样品中T4的适宜方法和条件.结果：源自T4 ligase的一对引物具有较高的灵敏度和特异性;针对纯化T4DNA配制的模板样液,优化的PCR和real time PCR至少可分别精确检出39.25和3.925 pg/ml的T4DNA;针对沸水浴处理转换样品制备的模板样液,PCR和real time PCR可清楚区别不同浓度的转换样品,PCR的检出极限为500 PFU/ml T4的转换样品,real time PCR的检测极限为35 PFU/ml T4的转换样品.结论：采用PCR和real time PCR可快速定量测定转换样品中的T4含量,real time PCR比PCR的灵敏度高约一个数量级.     

单增李斯特菌不同PCR快速检测方法比较

目的比较3种PCR快速检测方法在检测单核细胞增生李斯特菌时的特异性和灵敏度方面的差异。方法针对单核细胞增生李斯特菌的毒力基因iap和prfA基因,分别设计引物,进行单个PCR、多重PCR、套式PCR等3种方法检测。结果3种PCR方法均具有较强的特异性;套式PCR的灵敏度为10²cfu/ml,高于单个PCR(10³cfu/ml)和多重PCR(10⁴cfu/ml)。结论多重PCR在特异性检测方面具有优势,而在灵敏度方面,套式PCR要明显优于单个及多重PCR方法。     

疟疾的实时荧光PCR快速检测方法

目的:建立疟疾的实时荧光PCR检测方法并用于疟疾的快速检测。方法:设计了疟原虫通用型实时荧光PCR检测的引物和探针,建立了疟疾的实时荧光PCR检测方法。对40份疟疾镜检阳性样本和20份镜检阴性样本进行实时荧光PCR检测,并和巢式PCR方法检测结果进行了比较。结果:疟疾实时荧光PCR检测速度快,20分钟即可完成。40份镜检阳性样本的荧光PCR检测均为阳性,2份样本的巢式PCR结果为阴性;20份镜检阴性样本中有3份样本为实时荧光PCR阳性,其余17份样本为实时荧光PCR阴性,与疟疾巢式PCR检测结果相同。结论:该实时荧光PCR方法检测速度快,特异性强,准确性高,阳性率高,不易漏检,适用于疟疾的快速检验,这对防止该病在国境口岸的传入提供了技术依据。     

基于WHO-NEQAS疟疾样本不同诊断方法的效果评价

目的 针对WHO-NEQAS提供的20份已知疟原虫血样在不同实验室应用不同PCR诊断方法的检测准确率数据进行统计分析和比较,并运用巢氏PCR对上述样本进行检测准确率的效果评价。方法 采用配对T检验的统计学方法比较不同实验室对已知性质和数量的疟原虫样本,在巢氏PCR、多重PCR和荧光定量PCR 3种方法检测准确率之间的差异性;运用巢氏PCR对20份样本进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳。结果 在不考虑疟原虫种类时,巢氏PCR和多重PCR相对于荧光定量PCR的检测准确率较高且均存在显著差异(P=0.003 3,P=0.045 6);在原虫密度小于10³虫/ml血时,巢氏PCR和多重PCR相较于荧光定量PCR在检测准确率上均存在显著差异(P=0.001 4,P=0.012 5);在原虫密度为10⁴～10⁵虫/ml血以及大于10⁶虫/ml血时,3种方法之间并无显著差异(P>0.05)。结论 巢氏PCR用于鉴别部分疟原虫种诊断,特别是在原虫密度较低时,仍具有较高的检测准确率和灵敏度,结果更为可靠。     

PCR快速检测奇异变形杆菌的研究

目的 建立一种检测奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)快速且特异的PCR方法. 方法 针对编码奇异变形杆菌脲酶调节子(ureR)的基因序列设计2条PCR引物,扩增片段长度为225 bp;通过对2株奇异变形杆菌和14株非奇异变形杆菌进行PCR检测、利用该PCR方法和传统分离培养法同时对60份食物中毒送检标本进行检测来评价其特异性;将奇异变形杆菌菌液做一系列10倍稀释后进行PCR检测来对其进行敏感性分析. 结果 2株奇异变形杆菌出现PCR扩增反应,扩增产物经测序鉴定正确,14株非奇异变形杆菌没有出现PCR扩增反应,且PCR检测奇异变形杆菌的结果与传统培养方法一致,PCR方法相比传统培养方法更快速,在4 h内即可完成扩增反应;PCR方法敏感性为30 cfu/ml.结论 建立了一种快速,准确检测奇异变形杆菌的PCR方法,适合奇异变形杆菌日常监测和快速诊断的需要.     

浙江省钩端螺旋体PCR检测方法建立与应用

目的：为更好的进行钩端螺旋体病监测,为预防措施提供依据.方法：建立PCR检测方法,进行灵敏度、特异性研究.探索钩端螺旋体PCR扩增DNA条件.对浙江省2006年分离菌11株进行PCR鉴定,对龙游、常山捕获的一百只鼠和一百只蛙肝、脾、肾标本在提取其DNA后进行PCR检测.结果：所建立PCR检测方法具备较高灵敏度和较好特异性.对2006年分离的钩体菌株进行的PCR鉴定结果与血清学鉴定结果相符.鼠和蛙肝、脾、肾标本进行PCR检测,PCR检测阳性率10%,钩体菌株培养分离率仅为1%.x2=15.58,P＜0.05有显著差异.测序及培养均能证实PCR检测结果具有特异性.结论：钩体PCR检测方法的建立能更加准确的反映野生动物自然带毒率.钩体PCR检测方法可推广应用.     

人类免疫缺陷病毒聚合酶链反应诊断技术进展

目的 人类免疫缺陷病毒(HIV)是引起获得性免疫缺陷综合征(AIDS)和相关疾病的RNA病毒.实验室诊断以检测HIV感染者体液中病毒抗原和抗体的方法为主,操作方便,易于普及应用.近年来出现的聚合酶链反应(PCR)技术,以检测HIV基因为目标,具有较高的敏感性和特异性,并能做到早期诊断及定量分析,在HIV感染检测中的地位和重要性也日益受到重视.作者介绍了常规PCR、套式PCR、多重PCR、逆转录PCR、免疫PCR的基本原理及应用于检测HIV感染者的现况.着重介绍了具有载量分析的实时PCR技术在国内外的研究现状,并对实时PCR技术未来的发展做出了展望.     

多重PCR和单重PCR在流感病毒快速检测中的比较与应用

[目的]建立快速检测H1、H3亚型和乙型流感病毒的多重PCR技术,并与单熏PCR技术进行比较与应用. [方法]根据H1、H3亚型和乙型流感病毒设计引物,进行多重PCR扩增及电泳检测,在快速检测中与单重PCR进行比较与应用. [结果]该多重PCR技术能在4 h内同时检测3种型别的流感病毒,时间短于单重PCR技术,特异性和灵敏度相似.[结论]本研究建立多重PCR技术可以准确检测流感病毒,不仅灵敏度高、特异性好,而且可以得到快速的检测结果.     

PCR技术在快速检测沙门氏菌中的应用分析

目的分析PCR技术在快速检测沙门氏菌中的应用,发掘PCR技术的价值和作用。方法采用Taqman探针实时荧光定量PCR技术,针对沙门氏菌吸附和侵袭上皮细胞表面蛋白invA基因设计引物和Taqman探针,快速检测沙门氏菌。结果检测沙门氏菌时,PCR技术与传统的检测技术相比,不仅快速,而且准确,具有较高的实用的价值。结论采用PCR技术,有利于实现快速检测沙门氏菌。     

数字PCR和荧光定量PCR诊断急性期布鲁菌病的灵敏度比较初步研究

目的　建立用于布鲁菌检测的数字PCR技术,初步用小样本开展研究,比较数字PCR和荧光定量PCR的灵敏度差异,验证数字PCR作为急性期布鲁菌病诊断技术的可行性。方法　选取符合我国急性期布鲁菌病诊断标准的20例患者的血清标本,分别用数字PCR和荧光定量PCR技术进行检测,初步比较2者在急性期布鲁菌病诊断中的灵敏度差异,并分析差异原因。结果　20例急性期布鲁菌病患者血清样本中,数字PCR检测阳性20例,荧光定量PCR检测阳性0例。结论　初步证实在急性期布鲁菌病患者血清标本检测中,数字PCR检测灵敏度高于荧光定量PCR,有良好的临床应用前景,但也存在一定局限性,尚须进一步扩大样本完成实验诊断技术临床研究,并进行多实验室验证。     

PCR检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7

目的研究快速、特异、灵敏的检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7的多重PCR方法,并比较单一PCR和多重PCR对检测灵敏度的影响.方法选择O157∶H7的O抗原、H鞭毛抗原及SLT1和SLT2毒素基因特异的4对引物,分别或共同进行PCR扩增,检测40株O157∶H7和非O157∶H7菌株,将细菌按10+1～10+6稀释后比较PCR的检测灵敏度.结果所有O157∶H7菌株均在497 bp和625 bp处出现O157抗原基因和H7抗原基因产物,其产毒株在484 bp和(或)210 bp处出现SLT2和(或)SLT1基因产物,非O157∶H7菌株PCR结果均为阴性;单一PCR检测灵敏度为150 CFU/PCR反应,多重PCR为＞1 500 CFU/PCR反应.结论在经过增菌后,多重PCR比传统细菌检测方法更特异、快速、灵敏和简便,为产毒和非产毒O157∶H7的诊断提供了新的手段.     

两种反转录聚合酶链反应检测甲型肝炎病毒

目的 建立一种灵敏、特异的RT－PCR 方法检测环境中的HAV。方法 对两种RT－PCR，即常规两步法RT－PCR和一步法RT－PCR检测HAV的效果进行了观察，并采用半套式PCR对扩增产物的特民划性进行验证。结果两种RT－PCR与半套式PCR检测HAV均得到预期条带，所设计的引物对其它的肠道病毒扩增呈阴性；在同等反应条件下，一步RT －PCR的反应效率远高于常规RT－PCR，二者的检测灵敏度也有显著性差异，一步RT－PCR的检测灵敏 度为10TCID50／ml，两步法RT－PCR检测灵敏度为10^3TCID50/ml.结论 一步RT -PCR较常规RT-PCR易于操作,重复性好,不易污染,具有更高的反应效率和灵敏度.     

核酸检测技术在细菌性食源疾病检测中的应用探讨

[目的]初步探讨常规PCR、荧光PCR、PCR产物测序及脉冲场凝胶电泳(PFGE)等核酸检测技术在常见细菌性食源疾病病原菌检测中的应用。[方法]用常规PCR、荧光PCR直接检测经选择性增菌培养的沙门菌和志贺菌,测定PCR扩增产物序列以确定病原菌种类,用限制性内切酶XbaI和SpeI对分离菌株进行PFGE分析。[结果]常规PCR、荧光PCR方法在两份腹泻病人样本中均检出沙门菌,结果与培养法一致。二者未在皮蛋中检出沙门菌,而培养法在市售皮蛋中检出沙门菌。检测时间分别为PCR16h、荧光PCR14h、PCR产物直接测序19h,较培养法缩短4d。来源不同的3株分离菌XbaI和SpeI酶切图谱完全一致(相似度为100%)。[结论]应用常规PCR、荧光PCR可准确、及时检出腹泻病人样本中的沙门菌和志贺菌,有望用于食物中毒的快速检测。但在检测食品和环境样本时需适当延长增菌培养时间。在从农田到餐桌的食品供应链中,PFGE可对疾病暴发进行早期识别并协助对病原菌及其传播途径的溯源,有助于食物中毒的预防。     

比较常规PCR与多重PCR在食物中毒致病菌检测中的应用

目的通过对常规聚合酶链反应(PCR)与多重PCR在检测6种食物中毒致病菌中的比较研究,建立一个快速、准确、灵敏、有效的针对该6种致病菌进行PCR检测的平台。方法利用6种导致患者腹泻的食物中毒致病菌的特异性序列为靶序列,设计了6对特异性引物进行PCR反应,优化并建立了PCR检测体系。结果通过实验确定常规PCR适宜的退火温度为58℃,而多重PCR适宜的退火温度为62℃;常规PCR的基因组DNA检测灵敏度可达到2×10-7ng/μl,而多重PCR的基因组DNA检测灵敏度只有2×10-6ng/μl;常规PCR比多重PCR更容易从食物中毒样品中检测出致病菌。结论 6种导致患者腹泻的食物中毒微生物完全可以在同批次中完成检测,PCR检测方法操作简单、速度快、灵敏度高、稳定性和重复性好,具有较广阔的应用前景和较大的经济与社会效益。     

实时荧光定量PCR技术在食品检验中的应用

实时荧光定量PCR(real-time quantitativepolymerase chain reaction,RQ-PCR)又称荧光定量PCR,1994年由日本科学家Higuchi提出。当时因为想实时地看到PCR反应的整个过程,就在普通PCR仪的基础上配备了一个激发和检测的装置,在PCR反应的退火或延伸阶段检测掺入到双链核酸中EB的含     

空气中嗜肺军团菌的巢式PCR和荧光定量PCR测定方法比较

目的评价巢式PCR和荧光定量PCR方法在嗜肺军团菌气溶胶检测中的应用。方法于2012年8—10月在北京、南京、苏州和深圳四城市选取38家公共场所,使用带有虚拟浓缩器的Bio-sampler生物冲击式采样器采集气溶胶样品,分别应用巢式PCR和荧光定量PCR法检测样品中的嗜肺军团菌。结果共采集气溶胶样品165份。巢式PCR法测定嗜肺军团菌的阳性率为8.5%(14/165),荧光定量PCR法测定嗜肺军团菌的阳性率为26.1%(43/165),后者高于前者,差异有统计学意义(P0.05)。结论采用荧光定量PCR法测定空气中嗜肺军团菌的灵敏度优于巢式PCR法。     

定性、定量两种PCR方法检测HBVDNA的比较

目的　评价定性量两种PCR方法检测HBV-M阳性乙型肝炎患者HBV DNA的灵敏度和特异性。方法　使用市售酶免试剂检测452例乙型肝炎患者HBV-M后,分别采用定性和荧光定量两种聚合酶链式反应方法检测其HBV DNA。结果　HBsAg和抗-HBc阳性组、HBsAg,抗-HBe和抗HBc阳性组、HBsAg和抗-HBe阳性组以及抗-HBs,抗HBe和抗-HBc阳性组定性、定量两种PCR HBV DNA检出率分别为65.00%和92.78%、65.75%和89.04%、26.44%和68.97%以及5.56%和11.11%。检测标准质粒,定量PCR灵敏度为1×103copies/ml,定性PCR为1×105copies/ml。结论　定量PCR在HBV-M阳性乙肝患者和灵敏度方面与定性PCR相比均有显著性差异。提示定量PCR可以替代定性PCR在临床工作中发挥更大作用。     

三种定量方法在温泉水中军团菌连续性监测中的应用

目的 比较传统的平板培养法、荧光定量PCR和荧光染料叠氮溴化乙锭(ethidium monoazide,EMA)结合荧光定量PCR的方法(EMA-荧光定量PCR)对温泉水中军团菌的检测效果.方法 于2011年每月(除5月份)对北京市某温泉度假村的5个温泉池进行采样,每月采集11份水样,全年共采集121份.分别采用传统的平板培养法、荧光定量PCR和EMA-荧光定量PCR方法对水样中军团菌进行定性和定量分析.结果 平板培养法、荧光定量PCR和EMA-荧光定量PCR检测温泉水中军团菌污染率分别为74.4％ (90/121)、100.0％(121/121)和100.0％(121/121)；3种方法对121份温泉水样本中军团菌定量数值分别为0.10 ～ 216.00菌落形成单位(CFU)/ml、1.47～1557.75基因单位(GU)/ml和0.20～301.69 GU/ml.荧光定量PCR、EMA-荧光定量PCR和平板培养方法对121份温泉水每份军团菌含量检测的中位数(第25百分位数～第75百分位数)分别为75.30 (32.51 ～ 192.10) GU/ml、36.46(16.08 ～91.21) GU/ml和5.30 (0.00 ～ 33.70) CFU/ml.对于121份温泉水水样,3种方法对军团菌含量分析的定量数值差异有统计学意义(x2=187.900,P＜0.01),其中荧光定量PCR的定量数值最高,EMA-荧光定量PCR的数值次之,平板培养的数值最低.结论 荧光定量PCR和EMA-荧光定量PCR方法检测温泉水中军团菌的灵敏度优于传统的培养方法,EMA-荧光定量PCR方法适合用于环境水体中军团菌活菌监测.     

结核分枝杆菌inhA基因突变的研究

目的：了解我国结核分枝杆菌耐异烟肼（INH）临床分离株inhA基因突变情况,探讨快速检测结核分枝杆菌耐药基因型的分子药敏检测方法。：方法：用PCR单链构象多态性（PCR－SSCP）和PCR直接测序法（PCR－DS）分析30 结核分枝杆菌临床分离株inhA基因。结果：以结核分枝杆菌H37Rv标准株对照观察所有INH敏感株的PCR－SSCP和PCR－DS图谱,均未发现inhA基因突变,在12株INH耐药株中,有5株无PCR－SSCP和PCR－DS图谱异常,占INH耐药株的41．7％,另有5株和2株分别发生核苷酸错义突变和同义突变,共占INH耐药株的58．3％,结果：多数结核分枝杆菌耐INH与inhA基因突变密切相关,但检测inhA基因突变不宜作为临床分离株耐药性的快速检测指标。