bcr/abl融合基因和慢性粒细胞白血病

bcr/abl融合基因酪氨酸激酶活性异常在慢性粒细胞白血病发病分子机制中起重要作用,其表达物bcr/abl融合蛋白是慢性粒细胞白血病分型的重要依据,检测此基因对慢性粒细胞白血病的诊断、治疗和病情观察具有重要临床意义.     

bcr/abl融合基因检测在慢性粒细胞白血病诊断及残留病灶监测中的应用

目的探讨bcr/abl融合基因检测在诊断慢性粒细胞性白血病(CML)和监测CML残留病灶中的意义。方法采用巢式逆转录PCR(RT-PCR)检测337例CML患者bcr/abl融合基因的表达,并对所有患者进行残留病灶的动态监测,共检测632人次。其中移植(包括外周血干细胞移植、骨髓移植和脐血移植)患者26例;服用格列卫的患者22例;其它治疗方案患者289例。结果在337例CML初诊患者中bcr/abl基因表达阳性者325例,阳性率为96.4%;其中b3a2型转录本占58.5%(190/325),b2a2型转录本占41.2%(134/325),b3a3型转录本占0.3%(1/325)。未发现b2a3型转录本。移植患者bcr/abl融合基因转阴率为88.5%(23/26),时间在30~201 d之间,中位数为55 d;服用格列卫患者融合基因总转阴率59.1%(13/22),转阴时间在用药后90~365d之间,中位数为210 d;其它治疗组患者转阴12例,转阴率为4.1%(12/289)。结论bcr/abl融合基因的检测及动态观察,对CML的临床诊断、疗效及预后判断具有重要意义。     

Real Time PCR监测慢性粒细胞白血病bcr/abl融合基因的临床意义

目的通过Real Time PCR实时监测慢性粒细胞白血病bcr/abl融合基因的表达,探讨其在诊断及预后评价价值。方法采用荧光定量Real Time PCR反应技术检测39例慢性粒细胞白血病及其它血液系统疾病20例的bcr/abl融合基因表达水平。结果骨髓原始、外周血原始与bcr/abl融合基因拷贝数有显著相关性,初诊慢性粒细胞的bcr/abl融合基因表达水平普遍明显增高,经羟基脲±干扰素治疗后表达明显下降,复发或加速期患者可提前2-4个月左右早期发现,格列卫或移植治疗后,多数bcr/abl融合基因可转阴性。结论 bcr/abl融合基因检测对诊断慢性粒细胞白血病有重要价值,同样是慢性粒细胞白血病治疗和预后观察的决定性指标。     

RNA干扰对慢性粒细胞白血病bcr/abl融合基因表达的抑制作用

目的研究RNA干扰(RNAi)效应对慢性粒细胞白血病(CML)bcr／abl融合基因表达的抑制作用。方法体外化学合成针对bcr／abl融合基因的小干扰RNA(siRNA)，并用电穿孔方法将siRNA转染K562细胞株，以未转染的细胞及非特异性的siRNA转染细胞作对照；同时转染带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的载体作为阳性对照，流式细胞术检测其绿色荧光以确定转染效率；实时定量RT—PCR及Western blot法检测siRNA的抑制效应。MTT法检测细胞增殖抑制率。膜联蛋白V(Annexin V)及碘化丙锭双染法测细胞凋亡率。结果电穿孔的转染效率可达70％；化学合成的siRNA可以抑制bcr／abl融合基因在mRNA和蛋白水平的表达；特异性siRNA可以抑制细胞增殖，转染24h细胞增殖抑制率达47％，48h达56％；特异性siRNA转染细胞24h组凋亡率为15．05％．48h组为19．47％，与对照组(1．00％)比较明显提高。结论在细胞水平上，化学合成的siRNA可以抑制bcr／abl融合基因的表达，为利用RNA干扰作为基因治疗的研究奠定基础。     

RT-PCR检测慢性粒细胞性白血病不同病期bcr-abl基因及临床意义

ｂｃｒ ａｂｌ基因是ｔ( 9;2 2 )染色体易位产物 ,见于 90 %以上慢性粒细胞性白血病 (ＣＭＬ)及 1 0 %～ 2 5 %的成人急性淋巴细胞性白血病 (以下称急淋 )。ｂｃｒ ａｂｌ基因重排是ＣＭＬ最重要的分子生物学特征。检测该基因对ＣＭＬ的诊断、鉴别诊断及预后判断具有重要意义。我们应用逆转录 聚合酶链反应 (ＲＴ ＰＣＲ)检测ＣＭＬ患者骨髓及 (或 )外周血ｂｃｒ ａｂｌ基因 ,为临床诊断、鉴别诊断、预后判断提供依据。1　材料与方法1 .1　病例　ＣＭＬ患者 2 6例 ,男 1 6例 ,女 1 0例 ,按文献 [1 ]标准诊断。其中慢性期 2 0例 ,急变期 6例…     

联合应用FISH和巢式RT-PCR技术检测慢性髓系白血病bcr/abl融合基因

目的 检测慢性髓系白血病(CML)bcr／abl融合基因，协助临床诊断。方法 联合应用荧光原位杂交(FISH)、Northem杂交和巢式RT—PCR技术。结果 在16例被检测的CML患中，有3例两种方法的结果不一致，经Northem杂交验证发现，RT—PCR较FISH更敏感，但存在假阳性；另外，FISH较容易检测到bcr／abl融合的少见类型，而巢式RT—PCR需要同时设计多对特殊引物，否则极易漏诊。结论 联合应用FISH和巢式RT—PCR技术检测CML bcr／abl融合基因可以优势互补，使结果更加准确、可靠，更适合于临床诊断、疗效判定以及对微量残留病的监测。     

自身淬灭荧光定量PCR检测慢性粒细胞白血病bcr/abl mRNA

目的利用自身淬灭探针技术建立一种能检测慢性粒细胞白血病（CML）bcr／abl融合基因mRNA的实时荧光定量PCR方法，为CML的诊断、疗效观察以及微量残留白血病（MRD）的监测提供有效手段。方法用逆转录PCR方法（RT—PCR）扩增K562细胞的bcr／abl融合基因，A-T克隆法构建定量标准模板；设计自身淬灭荧光引物（探针），建立自身淬灭荧光定量逆转录PCR方法（FQ—RT—PCR），并对该方法的线性检测范围、灵敏度、重复性、稳定性进行检测；然后检测临床白血病患者骨髓标本bcr／abl mRNA。结果建立的FQ—RT—PCR方法可检测10copies／μl的bcr／abl重组质粒，并能从10^5个正常细胞中检出1个白血病细胞，该方法的批内、批间变异系数（CV）分别为2．1％、6．1％，线性检测范围为10^2-10^9copies／μl。25例CML患者bcr／abl融合基因mRNA表达量中位数为4．50×10^4[（0．45—89．00）×10^4]copies／μg RNA，其中11例慢性期初诊患者bcr／abl mRNA表达量中位数为5．45×10^4[（2．95—19．30）×10^4]copies／μg RNA，6例急变期患者bcr／abl mRNA表达量中位数为13．00×10^4[（4．10～89．00）×10^4]copies／μg RNA，8例慢性期治疗后复查患者bcr／abl mRNA表达量中位数为2．35×10^4[（0．45—5．12）×10^4]copies／μg RNA，CML急变期患者bcr／abl融合基因表达水平与慢性期患者之间差异有统计学意义（q=3．41，P〈0．05）。PCR产物经电泳分析，其中21例CML患者为b3a2型，4例CML患者为b2a2型；3例急性淋巴细胞白血病（ALL）患者中，1例有bcr／abl mRNA表达，为b2a2型。结论所建立的基于自身淬灭探针技术的实时荧光定量PCR检测方法灵敏、特异、重复性好，结果用拷贝数表示，准确可靠，利于标准统一。可广泛用于CML的诊断、疗效观察以及MRD的监测。     

直接原位逆转录-聚合酶链反应检测慢性粒细胞白血病bcr/abl mRNA

逆转录 聚合酶链反应 (ＲＴ ＰＣＲ)检测慢性粒细胞白血病(慢粒 )ｂｃｒ ａｂｌｍＲＮＡ已应用于临床诊断和微小残留病的检测 ,但该方法不能反映ｂｃｒ ａｂｌｍＲＮＡ和细胞结构之间的关系 ,且ＲＮＡ提取操作要求较高 ,应用受到一定的限制。我们拟建立直接原位ＲＴ ＰＣＲ检测慢粒ｂｃｒ ａｂｌｍＲＮＡ的方法。材料和方法1　细胞　抽取经临床确诊的慢粒患者外周静脉血 ,Ｆｉｃｏｌｌ分离出外周血单个核细胞。2　细胞涂片及固定　取 2× 10 6 /ｍｌ单个核细胞悬液 5 0 μｌ,离心涂片于包被 0 .2ｇ Ｌ多聚赖氨酸的载片上 ,用体积分数为4%的…     

慢性髓系白血病Ph染色体分析与bcr/abl mRNA检测

目的 为进一步明确慢性髓系白血病（ＣＭＬ）患者中Ｐｈ染色体阳性细胞与ｂｃｒ／ａｂｌ融合基因表达之间的关系和比较细胞遗传学分的与聚合酶链反应（ＰＣＲ）方法在ＣＭＬ应用中的优缺点,方法 用热变性姬姆萨Ｒ显带（ＲＨＧ）技术和逆转录筑巢式聚合酶链反应（ＲＴ－ｎｅｓｔ－ＰＣＲ）对３３例ＣＭＬ患者的骨髓或外周血进行了分析,对其中１１例异基因骨髓移植（Ａｌｌｏ－ＢＭＴ）或α干扰素（ＩＦＮ－α）＋小剂量羟基脲（Ｈ     

两例Ph染色体阳性慢性粒细胞白血病患者具有少见型bcr/abl融合基因

目的　研究 2例Ph染色体阳性慢性粒细胞白血病慢性期 (CML CP)患者异常的bcr/abl融合基因结构。方法　分别采用常规的M 及 μ 型bcr/abl融合转录子特异性引物进行逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR) ,对RT PCR扩增产物测序进行序列同源性分析 ,以确定扩增产物的成分及bcr/abl融合转录子类型 ,其中 1例根据测序结果设计引物并通过PCR研究其DNA水平bcr与abl基因融合方式。结果　 2例患者临床表现均符合典型CML CP特征 ,RT PCR扩增后均未见典型的M 及 μ 型扩增带 ,而分别出现一条异常的条带 ,产物大小分别介于M 及 μ bcr/abl之间及小于M bcr/abl。经序列分析证明RT PCR产物均含有bcr及abl基因序列 ,例 1的bcr基因断裂发生在第 18外显子 (e18)内部 ,abl基因融合位点为常见的外显子 2 (a2 )处 ,它们之间插入了 4 0bp的部分abl基因内含子 1b序列 ,为一种新型的符合阅读框架结构的bcr/abl融合转录子e18 int a2。经PCR证明该融合发生在DNA水平。例 2的融合转录子中缺失典型M bcr/abl(b2a2 )融合基因中abl基因外显子 2 (a2 ) ,为e13a3(b2a3)型。结论　少见型bcr/abl融合基因可见于典型Ph染色体阳性CML患者并产生异常的RT PCR扩增带。     

bcr／abl特异性siRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的：构建bcr／abl的特异性siRNA真核细胞表达载体,并初步探索对K562细胞bcr／abl mRNA和P210蛋白的影响。方法：根据GenBank数据库提供的bcr／abl基因核苷酸序列,按照Tusch 1设计原则,选择设计双链小干扰RNA（siRNA）,再转化为能表达其小发卡结构RNA（shRNA）的DNA序列,并与pTER质粒定向连接,构建受控于人RNA聚合酶Ⅱ启动子H1的真核表达载体pTER117,经限制性内切酶酶切和DNA测序进行鉴定;在脂质体的介导下转染K562细胞,用RT—PCR分析bcr／abl mRNA的表达,细胞化学染色检测P210蛋白的表达。结果：构建bcr／abl融合基因siRNA真核表达载体pTER117经限制性内切酶酶切和DNA测序证实与设计完全一致,转染K562细胞24h后,pTER117使bcr／abl mRNA的相对水平下降50％,使P210蛋白下降47％。结论：bcr／abl融合基因siRNA真核细胞表达载体构建成功,并有效干扰K562细胞bcr／abl的表达。     

慢性髓系白血病不同bcr/abl融合基因转录子与临床关系的研究

目的研究慢性髓系白血病(CML)bcr/abl融合基因转录子类型与临床的关系.方法采用RT-PCR技术检测537例临床怀疑CML的患者新鲜骨髓标本三种bcr/abl(M、m及μ型)融合基因的表达.结果 479例CML患者 M-bcr/abl阳性,其中慢性期(CP)370例,加速/急变期(AP/BC)109例,CP期和AP/BC期患者表达b2a2型融合基因转录子的百分率分别为32.4%(370例中120例)及36.7%(109例中40例)(P>0.05),急淋变及急髓变患者b2a2型百分率分别为52.6%(19例中10例)及33.3%(90例中30例) (P>0.05);b3a2型患者初诊时外周血血小板数明显高于b2a2型患者[(485.9±333.8)×109/L] vs [(380.5±321.9)ⅹ109/L](P<0.05);66.0%CP及64.4%AP/BC患者同时表达M-bcr/abl及m-bcr/abl;1例单纯m-bcr/abl(+)患者表现为急性髓系白血病(AML);2例μ-bcr/abl(+)患者均具有典型CML表现.结论典型CML患者几乎均为M-bcr/abl融合基因阳性,大部分患者同时伴有m-bcr/abl表达,个别CML患者可以为μ型;除了急性淋巴细胞白血病(ALL)外,单纯m-bcr/abl(+)也可见于AML或CML急粒变的患者; b3a2型患者初诊时更易有血小板数增高表现.     

间期双色双融合荧光原位杂交监测慢性髓系白血病异基因造血干细胞移植后bcr/abl融合基因

本研究探讨bcr/abl双色双融合荧光原位杂交（DD-FISH）的敏感性及临床应用价值.对19例慢性髓细胞白血病（CML）异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）后微小残留病灶（MRD）用DD-FISH进行监测,同时与常规细胞遗传学（CC）、逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）结果相比较.样本取自骨髓,少数来源于骨髓片或外周血.结果表明：14例CML患者在Allo-HSCT后CC显示持续正常供者核型,RT-PCR转为阴性,移植2月后均为完全供者嵌合（DC）,DD-FISH检测结果持续为阴性,平均随访11.25月,MRD无增加.1例CC及RT-PCR阴性,而性染色体FISH为混合嵌合,DD-FISH阳性,监测无MRD增加,临床未治疗,疾病稳定.3例骨髓复发患者的DD-FISH及性染色体FISH均提示MRD明显增加,RT-PCR转为阳性,却只有1例CC异常,供者淋巴细胞输注（DLI）及甲磺酸伊马替尼治疗后均为DC,DD-FISH阴性,RT-PCR阴性.1例骨活检证实髓外复发患者骨髓或外周血样本的DD-FISH、CC及PCR均阴性,供受者完全嵌合.结论：间期双色双融合FISH可应用于CML异基因造血干细胞移植后MRD的监测,其操作简易快速,灵敏度高,且骨髓或外周血均可采用.动态监测能及时发现扩大的白血病细胞克隆.     

双色双融合荧光原位杂交方法检测bcr/abl融合基因

本研究总结分析1295份双色双融合荧光原位杂交方法(DC-DF-FISH)检测的bcr/abl融合基因结果并与常规细胞遗传学结果对比,进一步证实双色双融合荧光原位杂交方法检测bcr/abl融合基因的敏感性及临床应用价值.应用bcr/abl双色双融合DNA探针对骨髓间期细胞行荧光原位杂交,回顾分析FISH和核型检测结果.结果表明:在所检测的539例患者的1 295份骨髓标本中FISH阳性结果456份,涉及患者310例,核型正常的18例,核型分析失败的5例.310例FISH阳性病例中典型的DC-DF-FISH信号(2Y1G1R)234例,占75.5%(234/310).非典型信号患者76例,其中变异信号66例,占FISH阳性病例的21.3%(66/310).典型变异信号(1Y2G2R)16例,abl/和/或bcr缺失50例.213例多次DC-DF-FISH结果中,治疗后总转阴率为60%(128/213),治疗过程中阴性阳性多次反复的达12例.结论:双色双融合FISH技术可以检测隐匿核型、变异核型、基因序列缺失、微小残留病(MRD),是一个敏感、精确的白血病的诊断和治疗监测工具,有必要同细胞遗传学检查一样作为常规项目,尤其对于治疗后的病例,它在监测微小残留病及监测复发方面更优于常规细胞遗传学.     

实时定量RT-PCR监测慢性粒细胞白血病患者伊马替尼治疗过程中bcr/abl mRNA水平

目的观察甲磺酸伊马替尼(简称伊马替尼)治疗Ph+慢性粒细胞白血病(CML)患者骨髓bcr/ablmRNA水平的变化。方法采用实时定量(Realtimequantitative)RTPCR(RQPCR)技术连续监测34例α干扰素治疗无效Ph+CML患者在伊马替尼治疗前后不同时间120份骨髓标本bcr/ablmRNA水平。治疗前骨髓Ph+细胞百分率均≥95%。结果RQPCR的敏感度为10pgRNA,标准品日间差及日内差均<5%。10例伊马替尼治疗前标本中位bcr/ablmRNA水平为5.79%,各例之间差异甚大(0.24%～60.90%)。72份Ph+细胞百分率为0%～94%的治疗后标本bcr/ablmRNA水平与Ph+细胞百分率显著相关(r=0.82,P<0.001)。7例治疗12个月内达到完全遗传学缓解(CCyR)的患者bcr/ablmRNA水平随治疗时间延长而迅速降低,可供分析的6例患者治疗3个月时较治疗前下降65.9%～98.8%。达到CCyR后,bcr/ablmRNA水平随治疗时间延长继续下降,直至为0。4例治疗12个月后获得显著遗传学缓解患者(Ph+细胞百分率均<35%)bcr/ablmRNA水平缓慢下降,可供分析的3例患者治疗3个月时的bcr/ablmRNA水平分别比治疗前下降2.5%、18.5%及61.6%。5例持续遗传学无效,并且维持在慢性期的患者bcr/ablmRNA水平1例缓慢下降,2例缓慢上升,2例基本不变。4例治疗中发生急变的患者bcr/ablmRNA水平均逐步升高。结论对于伊马替尼