牙乳头细胞基本特征及其研究进展

牙乳头细胞来源于外胚间充质,具有多向分化潜能,是体内唯一分化为成牙本质细胞的前体细胞。该细胞在牙发育和牙体牙髓损伤修复过程中起重要作用。牙乳头细胞相关的组织工程化研究是近年来的热点。下面就牙乳头细胞的形态及其功能特征、三维细胞培养、组织工程化牙研究进展等方面的研究作一综述。     

骨形成蛋白-2对人牙乳头细胞内Smad1蛋白表达量的影响

目的：观察人牙乳头细胞内Smad1蛋白的表达及骨形成蛋白－2（bone morphogenetic protein-2,BMP2)对人牙乳头细胞内Smad1蛋白表达量影响，方法：原代培养的人牙乳头细胞用BMP2处理6h,12h,24h,48h后，提取总蛋白质，采用Western Bolt法，从翻译水平观察Smad1基因的表达变化。结果：从翻译水平观察到Smad1基因在人牙乳头细胞内的表达，但在BMP2作用48h内，Smad1蛋白表达量无显著变化，结论：人牙乳头细胞内存在Smad1信号转导途径，牙乳头细胞内Smad1蛋白表达量不受MBP2影响。     

Mineralized nodule formation by cultures of human dental pulp-derived fibroblasts

Pulp fibroblasts were isolated from human deciduous and supernumerary teeth and cultured in vitro. With continued culture in normal tissue-culture medium, six pulp fibroblast strains formed cell nodules after 10–15 days. By electron microscopy the nodules had matrix vesicles, and needle-shaped crystals associated with a dense network of collagen fibrils. The crystalline material exhibited a pattern consistent with hydroxyapatite when nodules were examined by X-ray diffractometry. Furthermore, the cells showed high levels of alkaline phosphatase activity, which could be increased more than seven-fold by the addition of 1,25(OH)₂D₃ (5 × 10⁻⁹−5 × 10⁻⁸M). In addition to the production of type I collagen, these cells also synthesized fibronectin and osteonectin. The formation of mineralized tissue nodules by pulp cells in vitro provides a useful system for study of the pathological calcification of pulp tissues.     

cbfa1在人牙乳头细胞中的免疫组织化学研究

目的：构建pcDNA3-cbfal重组质粒，瞬时转染人牙乳头细胞，观察cbfal在转染前后的表达。方法：用EcoRV和XbaⅠ双酶切pcDNA3空载体和pGEM-5z-f-cbfal质粒，电泳回收后进行连接，连接产物转化DH5α，进行酶切鉴定和PCR分析。采用脂质体法瞬时转染人牙乳头细胞，制备细胞爬片。免疫组织化学染色。结果：共挑出7个阳性转化子，酶切和PCR分析结果均显示重组质粒构建成功。正常人牙乳头细胞中cbfal表达阴性，瞬时转染24h后，cbfal表达阳性。结论：成功构建了pcDNA3-cbfal真核表达载体。人牙乳头细胞无cbfal的表达，当转染正义的cbfal重组质粒后出现cbfal的表达。为进一步研究cbfal在牙乳头细胞中的作用奠定了基础。     

BMP2对人牙乳头细胞c-fos和c-jun诱导作用的研究

目的:探讨生长因子BMP2对体外培养的人牙乳头细胞c-fos和c-jun表达的诱导作用.方法:采用免疫组织化学和图像分析的方法,观察特定浓度的BMP2在不同时问点对体外培养的人牙乳头细胞c-fos和c-jun表达的影响.结果:不加刺激时人牙乳头细胞c-fos、c-jun在胞浆阴性表达,胞核不表达或弱阳性表达.200 ng/mL BMP2刺激30 min后,c-fos和c-jun在胞浆胞核均出现表达,但较稀疏;刺激lh胞核胞浆内表达明显增强,浆内表达较核内弱;2 h c-fos和c-jan在细胞核内表达最强,12 h胞核着色明显变浅,24 h基本已无阳性着色.结论:生长因子BMP2可诱导体外培养的人牙乳头细胞c-fos和c-jun表达,整个过程约持续24 h;c-fos和c-jun的表达存在核转位现象,提示c-fos和c-jun参与了BMP2的信号转导过程.     

体外培养的人牙乳头间充质细胞的矿化特征

目的;观察体外２的人牙乳头间充质细胞矿化特征,深入研究成牙本质细胞的分化和牙本质形成。方法：第４代人牙也头间充质细胞连续培养３５ｄ后,进行组织学染色,透射电镜和扫描电镜观察。结果：人牙乳头间质细胞可出现复层生长和形成矿化结节,ｖｏｎ Ｋｏｓｓａ杂色提示细胞结节中有明显的钙盐沉积;细胞可出现与成牙本质细胞相似的超微结构特征并出现典型的矿化影像。     

稳定转染EDA基因的人牙乳头间充质细胞的建立

目的建立稳定转染EDA基因的人牙乳头间充质细胞。方法构建EDA真核载体pIRES2-EGFP-EDA,用脂质体将其转染人牙乳头间充质细胞,加G418选择培养液筛选稳定转染EDA的人牙乳头间充质细胞,并采用免疫荧光法鉴定。结果成功构建了EDA真核载体pIRES2-EGFP-EDA质粒,并筛选出稳定转染EDA的人牙乳头间充质细胞。结论EDA基因可以在人牙乳头间充质细胞中得到稳定的表达。     

人牙本质涎蛋白对体外培养的人牙乳头间充质细胞增殖和碱性磷酸酶活性的影响

目的 :观察人牙本质涎蛋白对体外培养的人牙乳头间充质细胞增殖和碱性磷酸酶活性的影响。方法 :分对照组和实验组 ,对照组是转染不含目的基因的空白质粒 pcDNA3的培养上清 ,实验组是转染pcDNA3 -hDSP重组质粒的培养上清。取第 5代人牙乳头间充质细胞 ,接种于 96孔板 ,对照组 6孔 ,实验组 10孔 ,用MTT法检测hDSP对体外培养的人牙乳头间充质细胞增殖的影响 ,用碱性磷酸酶检测试剂盒检测hDSP对体外培养的人牙乳头间充质细胞碱性磷酸酶活性的影响。结果 :hDSP能明显抑制体外培养的人牙乳头间充质细胞增殖 (P <0 .0 1) ,但能促进细胞内和培养上清中碱性磷酸酶的分泌 (P <0 .0 1)。结论 :hDSP能促进人牙乳头间充质细胞的分化和矿化     

氟对体外培养人牙乳头细胞分泌I型胶原的影响

目的　了解氟对体外培养人牙乳头细胞分泌I型胶原的影响。方法　对人牙乳头细胞体外培养 ,分别给予 0 .0 g/L、0 .2× 10 -6g/L、1.0× 10 6g/L、5 .0× 10 6g/L、2 5 .0× 10 -6g/L氟处理 ,采用Westernblot方法分析氟对细胞培养外I型胶原的影响。结果　体外培养的人牙乳头细胞合成Ⅰ型胶原可以分泌Ⅰ型胶原。 0 .0g/L、0 .2× 10 -6g/L、1.0× 10 6g/L、5 .0× 10 6g/L氟对细胞外Ⅰ型胶原量无显著差异 (P >0 .0 5 ) ;2 5 .0× 10 -6g/L氟处理组细胞外I型胶原量较其它组高 (P <0 .0 5 )。结论　过量氟可能抑制细胞外I型胶原降解     

甲状旁腺激素对人牙乳头细胞牙本质基质蛋白1表达的影响

目的：观察甲状旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)对体外培养的人牙乳头细胞(human dental papilla cells，HDPC)牙本质基质蛋白1(dental matrix protein，DMP1)合成分泌的影响。方法：原代方法培养出人牙乳头细胞，用不同浓度的甲状旁腺激素刺激培养的第5代人牙乳头细胞，免疫组化观察结果，并采用图像分析的方法，进行半定量分析。结果：PTH可刺激人牙乳头细胞DMP1的表达，诱导的DMP1主要表达于细胞胞浆内，呈一定的浓度依赖性，0．3μg／mL为刺激最佳浓度。结论：PTH能够刺激人牙乳头细胞产生DMP1，对牙乳头细胞向成牙本质细胞分化有一定促进作用，可能是成牙本质细胞分化的重要介质之一。     

激素和生长因子对人牙乳头细胞增殖的影响

目的：探讨激素和生长因子对体外培养人牙乳头细胞增殖的影响。方法：用ＭＴＴ法观察不同浓度的１，２５－二羟基维生素Ｄ３、胰岛素和表皮生长因子对离体培养的人牙乳头细胞生长的影响。结果：在１０－９～１０－７ｍｏｌ／Ｌ浓度范围时，１，２５－二羟基维生素Ｄ３对细胞增殖具有抑制作用，浓度越高，作用时间越长，抑制作用越强。胰岛素和生长因子对细胞增殖有一定促进作用，与浓度成正相关，分别在加药后第３天、４天作用最强。结论：在一定浓度和作用时间内，激素和生长因子对人牙乳头细胞的生长有调节作用     

大鼠牙乳头细胞旁分泌效应对巨噬细胞分泌炎症因子的调控作用

目的:研究大鼠牙乳头细胞(rat dental papilla cells,RDPCs)对LPS活化的巨噬细胞分泌免疫因子的影响.方法:分离SD大鼠牙胚,酶消化法原代培养牙乳头细胞并进行矿化诱导和成脂诱导,茜素红染色观察矿化结节形成.油红O染色观察脂滴形成.CCK8法检测大鼠牙乳头细胞条件培养基(rat dental papilla cells' conditioned medium,RDPC-CM)对巨噬细胞增殖能力的影响,采用酶联免疫吸附实验(ELISA)测定RDPC-CM对巨噬细胞分泌炎症因子IL-1β、TNF-α和IL-6的影响,Griess reagent法检测RDPC-CM对巨噬细胞分泌炎症因子NO的影响.采用SPSS 13.0软件包对数据进行统计学分析.结果:原代培养24 h后,大鼠牙乳头细胞从组织块中爬出,传代后可得到纯化大鼠牙乳头细胞;茜素红染色见矿化诱导组中出现散在的红色矿化结节;油红O染色后可见经成脂诱导的牙乳头细胞中脂滴形成;CCK8结果表明,RDPC-CM对巨噬细胞增殖能力无影响;ELISA结果显示,大鼠牙乳头细胞条件培养基可对LPS活化巨噬细胞分泌细胞因子产生作用,表现为条件培养基作用于巨噬细胞24h可减少细胞分泌TNF-α,而对IL-1β和IL-6分泌无影响;Griess reagent法结果显示,RDPC-CM对LPS活化的巨噬细胞分泌NO无影响.结论:大鼠牙乳头细胞条件培养基作用于LPS活化的巨噬细胞,可使巨噬细胞分泌TNF-α下降,提示牙乳头细胞具有一定的免疫调控作用.     

人牙髓细胞体外培养的方法学研究

作者观察了组织块法和酶消化法以及DMEM和RPMI1640二种常用培养液在人牙髓细胞体外培养中的效果。结果表明，组织块法培养出的牙髓细胞为单一的成纤维细胞样细胞，用DMEM时，其传代成功率明显高于用RPMI1604；胰蛋白酶消化法、胰蛋白酶和胶原酶联用可培养出成纤维细胞样细胞，少量的校形细胞和内皮样细胞，但细胞数量较少，生长缓慢，达不到传代要求。DMEM在培养板和组织培养瓶中均较适合牙髓细胞的生长，而RPMI1640效果不理想。提示组织块法和DMEM适合于人牙髓细胞的体外培养。     

人牙源性上皮细胞的体外培养研究

目的：建立人牙源性上皮细胞的体外培养方法,为牙齿组织工程研究提供可靠的种子细胞来源。方法：采用组织块法原代培养人牙源性上皮细胞,用更换培养液类型、多次差别消化法和反复贴壁法进行纯化,在倒置显微镜下观察细胞形态及生长状况,用免疫荧光法检测细胞表达角蛋白和成釉蛋白的情况。结果：原代培养的人牙源性上皮细胞生长良好,但有少量成纤维细胞混杂,经纯化后明显好转,上皮细胞呈片状生长,表达角蛋白及成釉蛋白。传至第5代后,细胞逐渐变为长梭形,失去上皮细胞形态。结论：体外培养的人牙源性上皮细胞在较长时间内可保持其特性,有望作为牙齿组织工程研究的种子细胞。     

猪牙乳头细胞的体外培养及生物学特性研究

目的:培养新生猪的牙乳头细胞,探讨其传代细胞的生物学特性。方法:选择刚出生1￣3d的新生猪,取出磨牙胚,分离牙乳头,用酶消化法培养猪牙乳头细胞,并用波形丝蛋白和细胞角蛋白鉴定细胞来源。观察细胞的生长规律,通过免疫组化染色检测Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、牙本质涎蛋白(DSP)等的表达情况。结果:猪牙乳头细胞在体外培养时生长良好,波形丝蛋白染色阳性而细胞角蛋白染色阴性,细胞中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、DSP呈阳性表达。结论:通过酶消化法,可以体外扩增培养猪牙乳头细胞,细胞为间充质来源,其传代细胞在合成胶原及DSP的能力上与体内牙乳头细胞相似,提示猪牙乳头细胞可能具备作为牙髓-牙本质复合体再生研究种子细胞的潜能。     

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目的比较Notch2在人年轻恒牙和成熟恒牙的牙髓以及年轻恒牙牙乳头组织中的raRNA和蛋白表达情况,探讨Notch2与牙髓牙本质复合体发育之间的关系。方法收集2008年7月至2010年8月中国医科大学口腔医学院口腔颌面外科门诊因正畸需要而拔除的健康前磨牙48颗（年轻恒牙和成熟恒牙各24颗）,拔除后立即分离取出牙髓和年轻恒牙的牙乳头组织。分为3组：第1组为年轻恒牙的牙乳头组织;第2组为年轻恒牙的牙髓组织;第3组为成熟恒牙的牙髓组织。分别用RT-PCR和Westernblot技术检测Notch2的mRNA和蛋白表达,以β-actin为内参照,用图像分析软件（MetaMorph）对阳性条带进行灰度值测定。结果在年轻恒牙的牙乳头和牙髓组织以及成熟恒牙的牙髓组织中均可检测到Notch2的表达;Notch2在年轻恒牙牙髓中的mRNA和蛋白表达强于其在牙乳头以及成熟恒牙牙髓中的表达（P〈0．05）。结论Notch2不仅在年轻恒牙的牙乳头和牙髓组织,而且在成熟恒牙的牙髓组织中均有不同程度的表达,提示Notch2在牙髓牙本质复合体发育过程中可能发挥重要作用。     

尼古丁对牙胚、牙乳头间充质细胞BMP分泌影响的体外研究

目的 :探讨尼古丁对体外鼠磨牙牙胚及牙乳头间充质细胞BMP分泌的影响。方法 :分别采用器官和细胞培养的方法体外培养牙胚和牙乳头细胞 ,在培养基和培养液中加入不同浓度的尼古丁 ,将 15d胎龄的胎鼠的下颌第一磨牙牙胚置于对照组和实验组RPMI - 16 4 0半固态培养基表面培养 4d ,人牙乳头细胞置于各组培养液中培养 3d ,之后分别制作常规组织切片和细胞爬片 ,免疫组化染色。结果 :实验组与对照组相比较 ,对照组牙胚和牙乳头细胞BMP阳性染色强于实验组 (P <0 .0 1,P <0 .0 5 )。结论 :尼古丁对体外培养胎鼠牙胚和人牙乳头细胞BMP的分泌存在抑制作用。