软骨上清液与转化生长因子诱导滑膜间充质干细胞向软骨细胞分化的对比研究

目的:对比使用软骨上清液和转化生长因子两种方法诱导滑膜间充质干细胞向软骨细胞分化。方法:分别采用消化法获取SD大鼠滑膜间充质干细胞和软骨细胞。体外扩增。实验组一:通过软骨细胞上清液诱导滑膜间充质干细胞向软骨方向分化。实验组二:通过软骨诱导液(TGF-β1,ITS+ Premix,2-磷酸抗坏血酸等)诱导滑膜间充质干细胞向软骨方向分化。培养21 d后通过形态学、免疫组织化学法检测其生物学特性,RT-PCR检测诱导后产物Ⅱ型胶原RNA含量。结果:2种诱导方法均能诱导滑膜间充质干细胞成软骨细胞方向分化。在形态学可见2组诱导后产物成软骨样结构,呈乳白色,质地韧。免疫组织化学鉴定基质能被Ⅱ型胶原染色,细胞染色呈现棕黄色。RT-PCR结果显示诱导后的微团表达软骨特异性基因Ⅱ型胶原和蛋白聚糖。结论:两组实验组均能诱导滑膜间充质干细胞向软骨方向分化。对比两种实验方法,使用上清液诱导滑膜间充质干细胞向软骨方向分化能力更强。     

转化生长因子β促进面突外胚间充质干细胞向平滑肌细胞分化

目的　探讨转化生长因子β(TGF-β)对面突外胚间充质干细胞向平滑肌细胞分化的影响。方法　 60 pmol/LTGF-β作用于面突外胚间充质干细胞,分别于1 d、2 d后进行抗α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)单克隆抗体免 疫组化图象分析检测,2 d后定量RT-PCR检测α-SMA mRNA的表达。结果　免疫组化显示,TGF-β诱导组表达α- SMA的细胞数约为95%,而未加分化抑制剂的自然分化组表达α-SMA的细胞数约为65%。图象分析显示,1 d、2 d TGF-β诱导组抗α-SMA着色平均灰度值小于未加分化抑制剂的自然分化组。定量RT-PCR显示TGF-β诱导组α-SMA mRNA量大于自然分化组。有分化抑制剂的对照组细胞不表达α-SMA。结论　TGF-β诱导组细胞表达α-SMA强于 自然分化组。TGF-β可以促进外胚间充质干细胞向平滑肌细胞分化。     

涎腺多形性腺瘤中骨形成蛋白的免疫细胞化学定位

多形性腺瘤是最常见的涎腺良性肿瘤,组织学上有多形性特征,即肿瘤性上皮组织与粘液样、软骨样组织混杂在一起。已研究表明间叶细胞和间叶成份并非真正的基质而是由肿瘤性上皮产生。骨形成蛋白(BMP)是骨基质中众多的生长因子之一,是异位骨和软骨形成的决定因子,它可诱导未分化的间充质细胞分化成软骨母细胞和骨母细胞,它有8个亚型,BMP-2～8属于转化生长因子(TGF-β)。最近发现BMP也存在于非骨组织中,BMP-2已由人肿瘤性上皮细胞系产生。本研究的目的是通过免疫细胞化学定位多形性腺瘤中的BMPs和TGF-β,从而分析BMPs在多形性腺瘤软骨成份的组织发生中的作用。     

转化生长因子-β3诱导牙髓干细胞的应用进展

转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)是一个具有多种生物学功能的多肽生长因子家族,TGF-β基因家族具有调控细胞分化、转移和分裂等多种功能,日益受到人们的关注。牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs)是一种间充质来源的口腔成体干细胞,具有自我更新的有丝分裂活动和向几种特殊细胞类型分化的能力,如可分化成软骨细胞、脂肪细胞、成牙本质细胞等特殊细胞。现就转化因子生长β₃(transforming growth factor-β₃,TGF-β₃)诱导牙髓干细胞生成各种不同组织在再生医学中的应用作一综述。     

外源性TGF-β1诱导大鼠骨髓间充质干细胞向肌成纤维细胞分化的实验研究

目的　探讨大鼠骨髓间充质干细胞BMSCs(bone marrow mesenchymal stem cells)的分离、培养、扩增方法及外源性转化生长因子TGF-β1(Transforming growth factor-1)诱导BMSCs向肌成纤维细胞定向分化的可能性,为放射性诱导的颌骨纤维化提供体外理论依据。方法　取大鼠股骨的骨髓,全髓培养法分离培养骨髓间充干细胞;培养至第三代时分别用+/-TGF-β1的2组诱导培养基定向分化诱导;诱导2周后显微镜下观察细胞形态变化,Real-time PCR检测细胞的基因表达情况;细胞爬片行免疫组化鉴定α-SMA及胶原纤维的表达。结果　大鼠股骨骨髓组织中可分离出骨髓间充质干细胞,体外生长形态类似成纤维细胞,呈梭型、纺锤型,定向诱导后TGF-β1组细胞可表现出肌成纤维细胞的特性（α-SMA+）,同时伴有COLⅠ、COLⅢ、α-SMA基因的高表达。结论　从大鼠股骨骨髓组织中可分离出骨髓间充质干细胞,TGF-β1能定向诱导BMSCs向肌成纤维细胞方向分化,为放射诱导的颌骨纤维萎缩机制提供了体外理论依据。     

口腔组织病理学

口腔黏膜上皮细胞及成纤维细胞与PGA的生物相容性研究，槟榔碱诱导体外培养的血管内皮细胞凋亡研究，表皮生长因子对MDPC-23细胞增殖和ALP活性的影响，bFGF、TGF-β对人牙髓干细胞增殖和分化能力的影响，体外三维培养下诱导人胚胎面突外胚间充质干细胞向成牙本质样细胞分化，牙本质涎磷蛋白反义核酸对体外培养牙胚发育、矿化的影响．     

牙髓、牙周膜及脐带间充质干细胞三系分化能力的体外比较研究

目的:比较牙髓、牙周膜和脐带三种不同来源间充质干细胞的(Mesenchymal stem cells,MSCs)三系分化潜能.方法:培养分离人脐带间充质干细胞(Umbilical cord mesenchymal stem cells,UCMSCs)、牙髓干细胞(Dental pulp stem cells,DPSCs)和牙周膜干细胞(Periodontal ligament stem cells,PDLSCs);倒置显微镜观察细胞形态,体外诱导这3种MSCs向成骨、成脂和成软骨方向分化,通过茜素红染色、油红O染色、阿尔辛蓝染色分别鉴定细胞成骨、成脂和成软骨分化能力,进一步实时荧光定量PCR检测比较3种细胞成骨相关基因OCN和RUNX2及成脂相关基因PPAR-γ的表达水平.结果:这3种MSCs细胞形态略有不同,三者均可向成骨、成脂和成软骨方向分化,但其分化潜能有所差异,DPSCs成骨和成脂向分化能力强,UCMSCs则更适于成脂和成软骨向分化,而PDLSCs成软骨向分化较具优势.结论:DPSCs,PDLSCs和UCMSCs三系分化潜能不同,本研究为干细胞临床转化中选择理想细胞来源提供实验依据.     

体外三维培养下诱导人胚胎面突外胚间充质干细胞向成牙本质样细胞分化

目的: 探讨人胚胎面突外胚间充质干细胞向成牙本质样细胞分化的过程.方法:采用体外细胞三维立体培养的方法在转化生长因子β1(TGFβ1)、牙本质非胶原蛋白(DNCP)的诱导下通过形态学观察、免疫组化、RT-PCR等方法探索外胚间充质干细胞向成牙本质样细胞分化的可能性及生长因子在其中所起的作用.结果:人胚胎面突外胚间充质干细胞在胶原中生长良好.培养4 d在TGFβ1+DNCP组中细胞出现核极化有很长的突起细胞平行排列.诱导的细胞有许多与成牙本质细胞相似的超微结构.抗牙本质涎蛋白(DSP)呈阳性反应.碱性磷酸酶活性增强.细胞在矿化液中能形成矿化结节.RT-PCR显示mRNA水平表达成牙本质细胞特异的牙本质涎磷蛋白(DSPP).结论:三维立体培养下人胚胎面突外胚间充质干细胞在TGFβ1及DNCP的作用下能分化为成牙本质样细胞.本结果将外胚间充质干细胞作为前体诱导分化出成牙本质样细胞为研究牙齿的发育及分化提供了良好的模型和实验依据.     

转化生长因子-β（TGF-β）对骺板肥大区软骨细胞分化作用的研究

转化生长因-β(TGF-β)是软骨内成骨重要的局部生长因子。为揭示TGF-β对软骨内成骨的作用机制．本实验采用鸡胚股骨无血清培养、生化测定碱性磷酸酶(ALP)活性、酶组化、免疫组化等方法，观察TGF-β在不同作用时间和剂量对骺板肥大区软骨细胞分化的作用。结果显示，TGF-β可使肥大区软骨细胞表达Ⅰ型胶原、纤堆连接蛋白(FN)，使ALP活性增加，并存在着量效和时效关系。结果表明TGF-β可以诱导和促进骺板软骨肥大区软骨细胞向成骨细胞分化，但阻碍分化的成骨细胞成熟。其结果充实了软骨内成骨的基本理论，亦为临床上应用TGF-β治疗骨缺损提供理论依据。     

胎盘间充质干细胞牙向分化的体外研究

目的探讨胎盘间充质干细胞牙向分化的可能性。方法双酶(胶原酶和胰蛋白酶)消化法获得SD大鼠胎盘间充质干细胞,免疫细胞化学鉴定其表型、成脂成骨诱导鉴定其多向分化能力。SD大鼠胎鼠牙胚细胞条件培养基诱导胎盘间充质干细胞14 d,免疫细胞化学检测DSP和DMP-1,RT-PCR及凝胶电泳检测DSPP和DMP-1基因。结果胎盘间充质干细胞表达CD29、CD44和CD105,而不表达CD31、C34和CD45。成骨和成脂诱导后形成钙结节以及脂滴。牙向诱导后的胎盘间充质干细胞形态无明显改变,表达成牙本质细胞特异性相关蛋白-DMP-1、DSP和特异性基因-DMP-1和DSPP。结论胎盘间充质干细胞具有牙向分化的潜能。     

TGF-β2诱导小鼠腭突细胞成软骨分化的研究

目的 探讨转化生长因子β2(transforming growth factor-β2,TGFβ2)诱导小鼠腭突细胞成软骨分化的作用.方法 取胎龄13.5天的小鼠分离培养腭突细胞,并分别加入不同的细胞因子进行成软骨诱导培养.A组为空白对照组,B组为TGFBR1(转化生长因子受体1)抑制剂-SD208组,C组为加入TGF-β2组,D组SD208+TGF-β2组.通过比较蛋白聚糖、蛋白聚糖半定量,以及软骨标志基因的表达水平,评价各组细胞因子诱导腭突细胞成软骨能力大小及作用.结果 在TGF-β2作用下腭突细胞向软骨细胞分化,TGF-β2组蛋白聚糖及软骨相关基因表达量最高,显著高于A、B、D组(P<0.01).B、D组蛋白聚糖及软骨相关基因的表达量较A组明显降低(P<001).结论 腭突细胞在TGF-β2诱导下具有成软骨分化能力.     

转化生长因子β1 mRNA在鼠磨牙形态发生过程中表达的研究

目的 探讨转化生长因子β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）mRNA在鼠磨牙形态发生过程中的表达及其意义。方法 制备鼠磨牙各发育阶段标本,用原位杂交法分析TGF-β1mRNA在牙胚中的表达与分布。结果 TGF-β1 mRNA在鼠磨牙形态发生过程中以时间和空间上特异的模式来表达。TGF-β1 mRNA在成釉细胞层和牙乳头细胞中很丰富,TGF-β1在成牙本质细胞和成釉细胞层的表达随这些细胞的分化程度而增高。结论 TGF-β1在牙形成过程中通过旁分泌和自分泌机制发挥重要作用。     

人牙乳头细胞内Smad5蛋白表达的免疫组化研究

目的：观察Smad5蛋白在体外原代培养的人牙乳头细胞内的表达及其在转化生长因子－β超家族信号转导中的作用。方法：原代培养的人牙乳头细胞，分别以骨形成蛋白－2（bone morphogenetic protein-2,BMP－2）和转化生长因子－β1（transforming growth factor－β1，TGF－β1）刺激，免疫组化检测Smad5的表达，图像分析仪半定量。结果：人牙乳头细胞（空白对照组）胞浆内可见Smad5阳性表达，胞核内未见阳性表达；BMP－2实验组胞核内Smad5强阳性表达，胞浆内为弱阳性表达；TGF－β1实验组细胞胞浆Smad5阳性，胞核未见表达。结论：人牙乳头细胞内存在Smad5的表达，Smad5能转导BMP－2信号至核内发挥作用，但不能TGF－β1信号，提示BMP－2在牙齿发育过程中信号传递可能是通过Smad5的信号途径实现的。     

核因子κB受体活化因子配体和肿瘤坏死因子α经炎性牙周膜干细胞外泌体促进破骨细胞分化

目的　慢性牙周炎表现的病理性骨吸收非常常见,牙周膜干细胞（PDLSCs）的外泌体（Exo）对骨吸收的作用和影响尚不明确,本研究分析了该Exo蛋白组分对破骨细胞分化的影响。方法　分别从正畸前拔牙患者和慢性牙周炎患者的牙周膜组织中提取PDLSCs,通过流式细胞术检测表面标记物;通过差速离心分别提取2种细胞的Exo,即Exo-WT和Exo-CP,并通过Western blot、透射电子显微镜（TEM）、蛋白浓度检测、纳米粒径追踪检测Exo特征;通过蛋白质谱检测2种Exo的蛋白组分;通过酶联免疫吸附（ELISA）验证了差异表达蛋白肿瘤坏死因子α（TNF-α）、核因子κB受体活化因子配体（RANKL）、白细胞介素（IL）-1α、转化生长因子β（TGF-β）、骨形态发生蛋白2（BMP-2）表达水平;将10、100、1 000 μg·mL^-1的Exo-CP或Exo-WT加入RAW264.7培养基中并于5 d时通过实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）、Western blot、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色检测破骨分化相关指标表达情况;采用SPSS 24.0软件对实验数据进行统计学分析。结果　Exo-CP富集的差异表达蛋白主要与破骨细胞分化的TNF信号通路、核转录因子κB（NF-κB）信号通路相关;ELISA实验证实了Exo-CP中高表达TNF-α、RANKL、IL-1α,低表达TGF-β1、BMP-2（P<0.05）;Exo-CP作用于RAW264.7,显著提高了细胞的破骨分化相关基因及蛋白的表达水平,TRAP染色可见分化的破骨细胞,且呈现浓度依赖性,100、1 000 μg·mL^-1浓度Exo-CP对破骨细胞分化的促进作用显著高于10 μg·mL^-1浓度组（P<0.05）。结论　慢性牙周炎的病理性骨吸收可能由炎性PDLSCs所分泌的Exo通过促进破骨细胞分化引起,Exo中主要的作用蛋白可能为RANKL和TNF-α,本研究为慢性牙周炎骨吸收的发病机制提供了新视角。     

IGF-1对骨髓基质细胞分泌BMP-2和VEGF的影响

目的 :研究不同浓度的胰岛素样生长因子 1(IGF -1)对骨髓基质细胞 (MSC)分泌骨形成蛋白 -2(BMP -2 )和血管内皮细胞生长因子 (VEGF)的影响。方法 :培养大鼠骨髓基质细胞 ,对第三代细胞分别用 5 0ng/ml,2 5ng/ml ,12 .5ng/ml,6.2 5ng/ml,3 .12 5ng/ml的IGF -1进行培养 ,以正常培养的MSC为对照组 ,分别于1、3、5、7d对MSC进行VEGF或BMP -2免疫组化观察。通过图像分析观测MSC分泌BMP -2和VEGF的变化。结果 :IGF -1对BMP -2的分泌有一定的促进作用。IGF -1可以明显促进MSC表达VEGF ,以 5 0ng/ml合成作用最明显 ,IGF -1促进MSC分泌VEGF和BMP -2具有时间及浓度依赖性。结论 :IGF -1可明显地促进MSC分泌BMP -2和VEGF。     

Effect of novel chitosan-fluoroaluminosilicate glass ionomer cement with added transforming growth factor beta-1 on pulp cells

Introduction

Vital pulp therapy might benefit from the sustained release of transforming growth factor beta-1 (TGF-β1) from dental restorative materials. Chitosan has previously been shown to enable sustained release of bovine serum albumin (BSA) from glass ionomer cement (GIC). Because BSA can prolong release of growth factor, chitosan-fluoroaluminosilicate GIC with albumin (BIO-GIC) should sustain the effect of growth factor. This study investigated the effect of BIO-GIC with added TGF-β1 on pulp cells.

Methods

BIO-GIC was prepared from GIC (conventional type) incorporated with 15% of chitosan and 10% of BSA. TGF-β1 (100 ng) was added in BIO-GIC+TGF-β1 and GIC+TGF-β1 groups during each disk specimen (10 mm diameter, 1 mm high) preparation. Two control groups were BIO-GIC and GIC. The effect of each specimen on pulp cells was investigated by using the Transwell plate technique. Cell proliferation was determined by MTT assay at 2 time periods (each period lasting 3 days). Pulp cell differentiation was examined by alkaline phosphatase activity and also by cell mineralization, which was measured by calculating the area of mineralization with von Kossa staining.

Results

Percentage of viable cells of GIC+TGF-β1 group was the highest after the first period. This might suggest an initial rapid release of TGF-β1 from GIC. After the second period, BIO-GIC, BIO-GIC+TGF-β1, and GIC+TGF-β1 had more than 90% cell survival. It was significantly greater than GIC (82% ± 2%). There was no significant difference in alkaline phosphatase activity. BIO-GIC+TGF-β1 had the highest mineralization area during 21 days.

Conclusions

BIO-GIC could retain the effect of TGF-β1.     

转化生长因子β1对口腔鳞状细胞癌脑转移细胞系Tb细胞生长抑制作用的研究

目的 探讨转化生长因子(transforming growth factor,TGF)β1对口腔鳞状细胞癌脑转移细胞系Tb细胞的生长抑制作用及可能的机制.方法 采用细胞计数法检测TGF-β1对Tb细胞的生长抑制作用,流式细胞仪检测细胞周期的变化,微阵列分析法(superarray)筛查smad蛋白介导的TGF-B(TGF-β-Smads)信号通路中基因表达水平的变化,反转录聚合酶链反应(RT-PCR)验证差异表达基因.结果 TGF-β1对Tb细胞有明显的生长抑制作用(P<0.05).流式细胞仪检测显示,TGF-β1能够使Tb细胞周期阻滞于G1期(P<0.05).微阵列分析法筛查结果显示,TGF-β1作用后,活化素受体样激酶1(activin receptor-like kinase-1,ACVRL-1)、抗苗勒激素(anti-mullerian hirmine,AMH)、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子2B(cyclim-dependent kinase inhibitor-2B,CDKN-2B)、TGF-相互作用因子(indnced factor,TGIF)基因表达增加,而畸形肿瘤衍生生长因子1(teratocarcinomaderived growth factor-1,TDGF-1)基因表达降低.RT-PCR验证结果表明,ACVR-1(0.67±0.08)、CDKN-2B基因表达(2.16±0.95)与微阵列分析法结果一致,差异有统计学意义(P<0.05),AMH(0.38±0.07)、TDGF-1(0.44±0.06)及TGIF(0.52±0.10)基因表达水平无统计学意义(P>0.05).结论 TGF±β1对口腔鳞状细胞癌脑转移细胞系Tb细胞有明显的生长抑制作用,其机制可能与细胞周期调控及调节TGF-β1-Smads信号通路中ACVRL-1、CDKN-2B基因表达有关.     

The Effect of Transforming Growth Factor Beta 1 on the Mineralization of Human Cementoblasts

IntroductionTransforming growth factor beta 1 (TGF-β1) plays an important role in bone mineralization and has been reported to promote osteoblast proliferation and differentiation. However, there is no report about the effects of TGF-β1 on human cementoblasts. The purpose of this study was to clarify the effect of TGF-β1 on the proliferation and differentiation of the human cementoblast cell line (HCEM) in vitro.MethodsHCEM cells were stimulated with TGF-β1 at concentrations of 0.05, 0.5, 5, and 10 ng/mL. A proliferation assay was performed from 24–72 hours. The effect of TGF-β1 on mineralization was analyzed by quantifying the area stained with alizarin red on days 7 and 14. Real-time polymerase chain reaction was used to assess the effect of TGF-β1 on the mineralization-related genes alkaline phosphatase, bone sialoprotein, and type I collagen on days 3, 7, and 14.ResultsTGF-β1 did not affect cell proliferation. TGF-β1 together with the mineralization medium (consisting of ascorbic acid, dexamethasone, and β-glycerophosphate) increased the alizarin red–stained area on days 7 and 14. Real-time polymerase chain reaction revealed that alkaline phosphatase messenger RNA expression was increased in TGF-β1–stimulated HCEM cells in mineralization medium on days 3 and 7, whereas bone sialoprotein and type I collagen messenger RNA expression was increased on day 7.ConclusionsAlthough TGF-β1 does not affect cell proliferation, it does promote cell differentiation and mineralization of HCEM cells.