抗肝癌单链双功能抗体基因逆转录病毒表达载体的构建及病毒包装细胞系的建立

人类基因治疗技术的迅速发展使越来越多针对先天性和获得性疾病的基因治疗方案进入临床试验,同时,逆转录病毒作为介导基因转染的载体也是目前基础和临床应用研究中最广泛使用的基因转移方法[1-3].迄今所掌握的研究资料表明,接受逆转录病毒介导基因治疗的患者中尚未发现因病毒感染导致的不良反应.因此,我们选择改造的缺陷型逆转录病毒载体pLXSN,将分泌型抗肝癌单链双功能抗体基因(sFv-TNF-α)克隆至该载体,进行病毒包装并筛选具有高滴度感染性重组病毒产生细胞系的研究.     

人肝癌组织胰岛素样生长因子Ⅱ基因启动子表达及其意义

人胰岛素样生长因子Ⅱ（IGF-Ⅱ）是一种重要的胎儿生长因子，其基因含4个不同的启动子（P1～P4）。在生长发育过程中，4个启动子不同的生物活性，具有组织特异性和发育阶段独立性表达特征，P2～P4为胚胎型启动子，P1为成人型启动子。在胎肝和新生儿肝中IGF-Ⅱ mRNA表达量最高，其中P3活性最大，其次分别为P4及P2，P1失活，在成人肝脏中IGF-Ⅱ mRNA表达量显著下调，约为新生儿峰值的1／10，其中P1活性最大，依次为P4、P2及P3，约70％成人肝脏P3呈关闭状态，仅30％成人呈微量表达。近年研究发现，IGF-Ⅱ在模型动物肝脏和人类肝脏的癌前病变及肝癌组织中呈过量表达，但不同学者报道的IGF-Ⅱ异常表达量及阳性率差异较大，且多数为IGF-Ⅱ蛋白水平的定性研究。我们分析了乙型肝炎病毒（HBV）阳性肝癌的P1～P4调控的IGF-Ⅱ转录子表达水平的变化及其与临床病理特征的关系，旨在阐明IGF-Ⅱ基因启动子在肝癌癌变中的作用及其临床意义。     

HSV-tk/GCV自杀基因系统对人食管癌细胞的作用

0 引言基因治疗是当前肿瘤治疗的前沿课题,其中“药物敏感基因(drug sensitivity gene)”的应用尤为引人嘱目,单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)/丙氧鸟苷(GCV)系统是目前最常用的药敏基因治疗系统.我们采用携带 HSV-tk 基因的重组逆转录病毒感染人食管癌细胞系 ECA109,观察 HSV-tk/GCV 系统对食管癌细胞的体内外杀伤作用.1 材料和方法1.1 材料限制性内切酶、T_4 DNA 连接酶和 Taq DNA 聚合酶购自 Promega 公司;Lipofect AMINE Kit 为 Life Technoligies产品;G418,GCV 购自 Sigma 公司.pIC19R/MC1-TK 质粒由美国匹兹堡大学 Huang L.教授惠赠,内含1.7kb 的 HSV-tkcDNA 片段;逆转录病毒载体 pDOR-neo 质粒由本文作者惠宏(?)提供.逆转录病毒辅助包装细胞 PA317购自美国 ATCC 公司;人食管细胞癌细胞系 ECA109由第四军医大学消化病研究所提供;6周龄 Balb/c 雄性裸小鼠由第四军医大学实验动物中心提供并饲养.     

逆转录病毒载体介导的端粒酶抑制基因促进肝癌细胞凋亡

目的:探讨逆转录病毒载体介导的反义端粒酶抑制基因对肝癌细胞系BEL-7402的凋亡诱导作用.方法:用电穿孔的方法把正、反义端粒酶抑制基因导入包装细胞,包装出完整的病毒,用此病毒感染肝癌细胞系BEL-7402,绘制细胞生长曲线来研究其抗肿瘤疗效.应用MTT、流式细胞术研究细胞凋亡情况.结果:肿瘤细胞感染逆转录病毒后,肿瘤生长受到明显抑制,转染反义hTR病毒组BEL-7402细胞凋亡率显著高于转染正义hTR病毒和生理盐水组(61.32%±2.24%vs23.02%±2.13%,4.11%±1.00%,P<0.01),转染反义hTR与5-FU联用细胞凋亡率更高,为71.71%±2.53%.结论:反义端粒酶抑制基因能明显抑制肿瘤细胞的体外生长,与抗肿瘤药物5-FU有协同作用,联合用药可以增强疗效,具有明显抗肿瘤作用.     

人Tum-5基因逆转录病毒载体及包装细胞株的构建

目的 构建携带Tum-5基因的逆转录病毒载体并对其进行包装,获得稳定的产毒细胞系.方法 采用RT-PCR法从胎肾组织中扩增Tum-5基因片断,并将其定向克隆到逆转录病毒载体pLXSN中进行PCR、双酶切和测序鉴定.利用电穿孔方法 将获得的重组质粒转染PA317细胞,经G418 筛选抗性克隆,收集病毒上清后感染NIH3T3 细胞测定病毒滴度.结果 PCR、酶切证实Tum-5基因克隆至逆转录病毒载体pLXSN,Tum-5基因测序结果 和原始序列相同.重组逆转录病毒载体转染PA317 包装细胞,RT-PCR证实转染后的PA317细胞上清液中存在携带人Tum-5基因的病毒RNA,病毒滴度为2.05×104cfu/ml.结论 成功的构建了携带人Tum-5基因的逆转录病毒载体,获得了稳定的产毒细胞系.     

乙型肝炎病毒C型重组杆状病毒的构建及鉴定

目的构建乙型肝炎病毒（HBV）中国株及其拉米夫定耐药相关变异株的重组杆状病毒.方法将1.2倍HBV基因组（血清adr型、基因C型）连接至杆状病毒的转移载体pFastBacI上,然后转化入DH10Bac菌株中,在细菌内的辅助质粒辅助作用下与杆状病毒基因组Bacmid发生位点特异性转座,形成含有HBV基因组的重组Bacmid,转染昆虫sf9细胞后,包装产生HBV重组杆状病毒vAcHBVc.采用连续聚合酶链反应（PCR）引入方法进行定点突变,构建YVDD变异株质粒,并按照上述方法构建HBV YVDD变异株重组杆状病毒vAcHBVYVDD,扩增并滴定.为便于观察重组杆状病毒的转染和扩增效率及病毒滴度测定,同时构建了含绿色荧光蛋白（GFP）的HBV重组杆状病毒vAcGFPHBVc.结果 HBV野毒株和变异株重组杆状病毒均构建成功,通过免疫空斑及TCID50定量测定病毒滴度为106～108pfu/ml左右.结论应用Bac to Bac杆状病毒表达系统可有效快速地构建HBV C型重组杆状病毒,以用于HBV体外复制系统的建立,为HBV野毒株及变异株生物学特性的研究及抗病毒药物的筛选提供技术平台.     

重组人GDNF基因逆转录病毒真核表达载体的构建及表达

目的 构建含有胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)和加强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)的逆转录病毒载体,将其导入包装细胞PT67,检测基因在细胞中的表达.方法 PCR法扩增GDNF基因及IRES2-EGFP基因,测序验证正确后与逆转录病毒载体pLXSN连接,构建重组逆转录病毒质粒pLXSN-IRES2-EGFP-GDNF.EcoR I酶切鉴定重组质粒.脂质体Lipofectamine 2000介导下转染包装细胞PT67,G418筛选并检测病毒滴度.流式细胞仪和荧光显微镜分别检测转染效率和基因表达.结果 PCR扩增得到大小约558 bp和1 308 bp的特异性条带,测序证实,获得正确的人GDNF序列和EGFP序列.经EcoR I酶切鉴定,成功构建重组质粒pLXSN-IRES2-EGFP-GDNF.荧光显微镜检测显示GDNF基因获得良好表达,流式细胞仪检测转染效率为24.4%.结论 正确克隆了人GDNF基因全序列并构建重组逆转录病毒pLXSN-IRES2-EGFP-GDNF质粒.基因转染包装细胞PT67获良好表达.     

ECEL1基因PSCSI-GFP慢病毒载体的构建

目的设计并构建针对ECEL1基因的RNA干扰慢病毒载体。方法依照ECEL1基因为模板,设计RNA干扰靶点,根据选定的靶点序列,设计短发夹RNA(shRNA)干扰序列,在两端添加相应的限制性内切酶酶切位点,合成单链DNA oligo,退火缓冲液中配对形成双链DNA oligo。利用Age I和EcoR I双酶线性化GV115载体。把载体和DNA oligo相连接,其连接产物转化大肠杆菌感受态细胞,经PCR扩增并测序鉴定。再通过质粒抽提,转染,浓缩与纯化后获得重组的ECEL1基因RNAi慢病毒,用"HIV-1p24抗原ELISA法"测定样品滴度。选取检测合格的慢病毒感染人肝癌细胞(BEL-7404),并设置对照组,荧光观察感染率。并使用Real-time PCR法及Western blot检测人肝癌细胞(BEL-7404)中ECEL1基因敲减后mRNA和蛋白质的表达量。2组间比较采用两独立样本t检验。结果 (1)根据ECEL1基因模板设计后,选定psc48784片段作为RNA干扰靶点,制备双链DNA oligo,PCR鉴定阳性重组子并测序,验证psc48784为正确的克隆。经过质粒抽提,转染以及浓缩纯化后,成功构建ECEL1基因RNAi慢病毒。物理检测与无菌检测合格。(2)通过HIV-1 p24抗原ELISA法测定ECEL1基因RNAi慢病毒样品病毒滴,测定样品病毒滴度为3×108TU/ml;表明已成功构建高滴度且合格的ECEL1基因RNA干扰慢病毒。(3)用ECEL1基因RNAi慢病毒感染人肝癌细胞(BEL-7404),荧光观察结果显示细胞感染效率达到80%,细胞状态稳定;使用Real-time PCR的方法及Western blot检测实验组人肝癌细胞(BEL-7404)中ECEL1基因在mRNA和蛋白质水平的表达量受到抑制(P值均0. 05),敲减效率达到70. 5%。结论成功构建ECEL1基因PSCSI-GFP慢病毒载体并获得稳定高滴度的病毒样品,并获得稳定的ECEL1基因敲减的人肝癌细胞(BEL-7404)。     

重组单纯疱疹病毒-胸苷激酶和人白介素-2基因痘苗病毒真核表达载体的构建

目的 松建含单纯疱疹病毒-胸苷激酶（HSV-tk）和人白介素-2（hIL-2）基因的痘苗病毒真核表达载体pMJ601,为进一步实施胃癌的基因治疗作必要的准备。方法 利用目的的基因与载体的连接、感受态细胞的制备及转化、质粒抽提、琼脂糖凝胶电泳、酶切、DNA序列分析等多种基因工程技术,将纯化回收的HSV-tk和hIL-2分别与pMJ601进行连接、转化并鉴定。结果 分别用BamH I-HindⅢ和Sal I-BamH I酶切位点,将HSV-tk与hIL-2DNA成功地克隆到pMJ601真核表达载体。结论 重组HSV-tk hIL-2基因PMJ601的构建,为进一步研究胃癌的基因治疗打下坚实的基础。     

hTERT启动子调控下PE38KDEL表达载体的构建及其在MiaPaCa2人胰腺癌细胞中的表达

目的探讨端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子调控铜绿假单胞菌外毒素衍生物（PE38KDEL）表达载体的构建及其在MiaPaCa2人胰腺癌细胞中的表达。方法通过PCR法扩增hTERT启动子,全基因合成PE38KDEL,将其分别亚克隆到pIRES2-EGFP及phTERTp-IRES2-EGFP质粒的多克隆位点中;均经酶切及测序鉴定。通过脂质体法将两质粒分别转染MiaPaCa2及WI-38细胞,观察荧光表达情况,通过RT-PCR检测PE38KDEL的表达。结果经酶切及测序鉴定证实质粒构建成功,pPE38KDEL-IRKS2-EGFP转染后MiaPaCa2和WI-38细胞中均有PE38KDEL基因表达;但phTERTp—PE38KDEL-IRES2-EGFP转染后仅MiaPaCa2中有PE38KDEL基因表达。结论hTERT调控下PE38KDEL表达载体构建成功,并可在MiaPaCa2人胰腺癌细胞中靶向性表达,为探讨胰腺癌的靶向基因治疗提供了实验依据。