结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B-ESAT6的融合表达及纯化

目的　融合表达结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B ESAT6 ,为结核病的预防提供有效亚单位疫苗。方法　设计含不同酶切位点的Ag85B和ESAT6引物 ,采用聚合酶链反应 (polymerasechainreaction ,PCR)的方法从结核分枝杆菌毒株H3 7Rv DNA中分别扩增出相应大小的DNA片段 ,将片段分别与PGEM T easy载体连接测序。将测序正确的Ag85B和ESAT6按照不同的酶切位点克隆入PPROEXHT表达载体 ,挑选出阳性克隆 ,将诱导的表达产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)分析 ,同时与含6个组氨酸 (histidine 6×his)的单克隆抗体 (monoclonalantibody ,mAb)进行固定化蛋白质免疫学测定(Western blot) ,将用含Ni 鳌合剂的Ni NTA亲合柱纯化的表达产物免疫小鼠 ,用结核分枝杆菌培养上清滤液蛋白 (culturefiltrateproteins ,CFP)作为抗原 ,酶联免疫吸附试验 (enzyme linkedimmunosorbentassay ,ELISA)测定免疫小鼠血清特异性抗体的滴度。结果　PCR获得的Ag85B和ESAT6序列与基因文库 (GenBank)报道的完全一致。两者在大肠杆菌DH5α株中融合表达的产物约为 370 0 0 ,与预计大小相吻合。Western blot结果显示 ,在相对分子量约 370 0 0处有表达产物与 6×hismAb特异性结合带。表达产物为包涵体 ,通过Ni NTA纯化系统 ,可得到纯化的目的蛋白。Ag8     

分枝杆菌胞壁融合表达Ag85B-ESAT-6穿梭质粒的构建

目的　构建E coli BCG(BacilleCalmette Guerin)穿梭载体 ,在母牛分枝杆菌细胞壁融合表达结核分枝杆菌 (MTB)的分泌蛋白Ag85B ESAT 6。方法　用聚合酶链反应 (PCR)从MTB毒株H3 7Rv基因中扩增出结核分枝杆菌 190 0 0抗原 ( 19 ss)胞壁区及其上游调控元件基因 ,克隆入E coli BCG穿梭载体 pOLYG中 ,构建表达蛋白能嵌入细胞壁中的E coli BCG穿梭载体。用间接免疫荧光染色法观察该载体携带所构建的结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B和ESAT 6基因在母牛分枝杆菌宿主中的融合表达。结果　经测序证实所克隆的 19 ss基因序列正确 ,所构建的E coli BCG穿梭载体 (pCW )能完成在大肠杆菌和母牛分枝杆菌细胞之间的穿梭 ,经免疫荧光检查外源基因Ag85B ESAT 6可融合表达于分枝杆菌宿主表面。 结论　本方法可成功构建能够在分枝杆菌胞壁融合表达MTB分泌蛋白Ag85B ESAT 6的E coli BCG穿梭质粒     

结核分枝杆菌融合基因疫苗的研究进展

BCG在不同地区的免疫保护作用差异很大（0％～80％），加上耐多药菌株的出现，寻找比BCG免疫保护效果更好的疫苗成为当今抗结核疫苗研究的当务之急。结核病DNA疫苗中，单一抗原免疫的免疫保护作用不及两种抗原混合免疫，但是DNA混合免疫又有费用高、副作用多和难推广等缺点，而融合基因疫苗则可克服混合免疫的不足。     

结核分支杆菌Ag85 B分泌蛋白基因疫苗的构建和免疫原性的研究

目的：构建编码结核分支杆菌（MTB）Ag85B分泌蛋白的重组真核表达质粒,并研究其免疫原性。方法：采用聚合酶链反应（PCR）方法从结构分支杆菌H37Ra基因组DNA中扩增出Ag85B分泌蛋白基因,用HindⅢ和EcoRⅠ消化后,与同样酶消化的pcDNA3连接,转化大肠杆菌JM109,阳性克隆用酶切鉴定;重组表达质粒肌注免疫小鼠4周后,分别用dot blotting和ELISA方法检测抗体的产生和滴度,结果：酶切监定重组表达质粒pTB30s构建成功,dot blotting检测免疫小鼠血清抗Ag85B特异性抗体阳性,ELISA检测抗体几何平均滴度为1：120。结论：应进一步研究pTB30s刺激机体的细胞免疫应答,以用于结核病（TB）的防治研究。     

结核分枝杆菌Ag85A／ESAT-6嵌合型质粒DNA疫苗和抗结核药物联合治疗小鼠耐药结核病的效果研究

目的研究结核分枝杆菌Ag85A／ESAT-6嵌合型质粒DNA疫苗和抗结核药物联合治疗小鼠耐药结核病的效果。方法用结核分枝杆菌高耐利福平低耐异烟肼临床分离株HB240尾静脉注射BALB／c小鼠1个月后，将小鼠随机分成2组，第1组用利福平（RFP）、异烟肼（INH）治疗12周，第2组用RFP、INH和结核分枝杆菌Ag85A／ESAT-6嵌合型质粒DNA疫苗（免疫5次）联合治疗12周；治疗结束后4和8周，分别取肺、肝和脾观察病理改变、称取质量、作菌落计数。结果治疗结束后4和8周，第2组小鼠体质量均超过第1组，但无显著性差异（P〉0．05）。治疗结束后4周，第2组肺、脾脏指数（0．017，0．011）均略低于第1组（0，020，0，012）（P〉0．05）；治疗结束后8周，第2组肺、肝脏指数（O．021，0．047）均略低于第1组（0．022，0．048）（P〉0．05）；而第2组脾脏指数（0．008）显著低于第1组（0．012）（P〈0．05）。治疗结束后4周，第2组有4例脾脏未见明显病变，第1组仅1例脾脏未见明显病变；治疗结束后8周，第2组有1例肺门淋巴结肿大，而第1组有3例；第2组有5例脾脏未见明显病变，第1组仅2例脾脏未见明显病变。治疗结束后4周，第2组肺菌落计数和脾菌落计数比第1组显著减少，分别减少70％和80％。结论DNA疫苗和抗结核药物联合治疗小鼠耐药结核病疗效高于单纯化疗。     

分泌表达Ag85B与ESAT6融合蛋白的重组卡介苗菌株的筛选

目的筛选获得分泌表达Ag85B与ESAT6融合蛋白的重组卡介苗(BCG)菌株。方法采用多聚合酶链反应(PCR)方法从结核分枝杆菌毒株H37Rv中扩增出热休克蛋白60(Hsp60)基因及其信号肽序列α-ss，将测序正确的hsp60和α-ss基因分别克隆人大肠杆菌(E.coli．)-BCG穿梭载体pOLYG中，构建分枝杆菌分泌表达载体pDE22，按相应的酶切位点将ag85b和esat6按照不同的连接方式联合克隆入pDE22载体，分别命名为pDE22-Ag85B-ESAT6和pDE22-ESAT6-Ag85B，将纯化的重组质粒电穿入BCG，经潮霉素抗性筛选和PCR的方法鉴定出含目的基因的重组BCG阳性克隆。收集重组BCG的培养上清液，经浓缩和透析后，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和固相化蛋白质免疫学测定(Western-blot法)分析。结果两株重组：BCG菌株的培养上清液分泌表达相对分子质量约37000的蛋白，且分别可与抗Ag85B和抗ESAT6蛋白免疫小鼠的血清有相应的结合条带。结论分泌表达Ag85B与ESAT6融合蛋白的重组BCG菌株构建成功，有望为结核病的预防提供有效的疫苗。     

结核分枝杆菌Ag85A DNA疫苗抗结核作用的研究

结核病是由Mtb引起的一种呼吸道传染病,全球结核病疫情仍然十分严峻,而卡介苗预防结核病的效果并不理想,研究新型结核病疫苗已成为国内外结核病研究的热点之一。将本课题组自1998年至今研究Mtb Ag85A DNA疫苗的免疫原性、治疗效果进行综合与概述,结果表明Mtb Ag85A DNA疫苗可诱导小鼠体液免疫和Th1型细胞免疫应答,可减少小鼠组织中的Mtb尤其是耐多药Mtb的数目,该疫苗与常规化疗联合不仅可提高机体免疫力,并可有效地杀灭或抑制Mtb,从而提高化疗效果。     

结核分支杆菌Ag85B-MPT64融合基因疫苗的构建及其在小鼠体内的表达

我们将结核杆菌Ag85B和MPT64编码基因用疏水甘氨酸接头 ,经过基因拼接 (geneSOEing)法融合构建DNA疫苗并研究其免疫原性 ,为进一步研究其融合基因疫苗的免疫保护作用奠定基础。材料与方法　H3 7Rv购自中国医学科学院微生物菌种保藏中心 ,重组Ag85B和MPT64纯化蛋白及多价抗血清由本教研室收藏。纯化蛋白衍生物 (PPD )标准品由成都生物制品研究所提供。BABL/c小鼠购自重庆医科大学实验动物中心。根据H37Rv标准菌株Ag85B和MPT64的编码序列 ,设计引物。P1:5′ AAGCTTATGTTCTCCCGGCCGGG 3′为Ag85B上游引物 ,下划线部分…     

结核杆菌Ag85B基因疫苗与结核杆菌Ag85B和细胞因子GM-CSF共表达基因疫苗在小鼠体内的免疫效应比较

目的比较结核杆菌Ag85B基因疫苗与结核杆菌Ag85B和细胞因子GM-CSF共表达基因疫苗在小鼠体内的免疫效应,为研制高效结核杆菌基因疫苗奠定基础。方法将雌性C57BL/6健康小鼠54只,随机分为3组,即结核杆菌Ag85B和细胞因子GM-CSF共表达基因疫苗(pIRES-Ag85B/GM-CSF)组、结核杆菌Ag85B基因疫苗(pIRES-Ag85B)组和空载体(pIRES)组,分别小鼠肌内注射疫苗,检测小鼠体内特异性体液免疫和细胞免疫应答相关指标,同时另取C57BL/6小鼠,随机分成4组,第1、2、3组免疫方法与上述各组免疫方法相对应,第4组每只小鼠背部皮下注射1×106CFU卡介苗(BCG),作为阳性对照,进行动物免疫保护性实验,比较分析两种基因疫苗在小鼠体内的免疫效应。结果结核杆菌Ag85B和细胞因子GM-CSF共表达基因疫苗在小鼠体内的免疫原性和免疫保护性明显强于结核杆菌Ag85B基因疫苗。结论结核杆菌Ag85B和细胞因子GM-CSF共表达基因疫苗能增强结核病基因疫苗的免疫原性和免疫保护性。     

Ag85B核酸疫苗的免疫原性和保护性研究

扩增结核分枝杆菌的Ag85B基因并克隆于真核表达载体 pJW4 30 4 ,转染COS - 7细胞后 ,Westernblot检测表明该基因在细胞内得到了正确表达。用该质粒免疫C5 7BL/ 6小鼠 ,免疫三次后 ,用纯化的重组蛋白Ag85B检测小鼠血清中的抗体 ,抗体滴度达到 1:10 2 4 0 0 ,(γ -干扰素测定表明 ,免疫动物的干扰素含量达到 116 0 3± 10 4 pg /ml。实验结果说明Ag85B核酸疫苗在实验动物体内引起了较强的免疫应答。三次免疫后经静脉强毒攻击 ,免疫组小鼠肺脏和脾脏的细菌数比对照空载体组分别减少了 1 5和 15倍以上。本研究表明 ,该核酸疫苗能同时诱导机体产生细胞和体液免疫应答并获得较高的保护效率。     

结核杆菌Ag85A DNA疫苗在小鼠体内的免疫效应比较

目的探索增强结核杆菌DNA疫苗有效性的新方法，为研制并开发新一代高效结核杆菌DNA疫苗奠定基础。方法分别构建结核杆菌Ag85A抗原基因真核表达质粒及其与小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的真核嵌合表达质粒，体外转染COS7细胞检测两种重组质粒的表达活性后，将其分别用作DNA疫苗给BALB／c小鼠肌内注射，检测小鼠体内特异性体液免疫和细胞免疫应答相关指标，同时进行动物免疫保护性实验，比较分析两种DNA疫苗在小鼠体内的免疫效应。结果结核杆菌Ag85A抗原蛋白基因与小鼠粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子的嵌合DNA疫苗在小鼠体内的免疫原性明显强于Ag85A抗原基因非嵌合DNA疫苗，但两种DNA疫苗的免疫保护性无明显差异。结论粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子与结核杆菌免疫保护性抗原基因嵌合DNA疫苗能显著增强结核病DNA疫苗的免疫原性。     

结核分支杆菌Ag85B DNA疫苗的构建及其免疫作用的研究

目的 研究pcDNA3-Ag85B质粒DNA疫苗的免疫原性及其诱生细胞免疫应答的作用。方法 将结核分支杆菌Ag85B基因插入载体pcDNA3中,制备pcDNA3-Ag85B DNA疫苗。分别以生理盐水、pcDNA3及pcDNA3-Ag85B免疫BALB／c小鼠,检测小鼠抗Ag85B抗体水平（ELISA）和体外循异抗原刺激诱导的免疫小鼠脾细胞IL－2、IL－4、IL－10、IFN－γ表达水平。结果 pcDNA3-Ag85B诱生的抗Ag85B效介明显高于生理盐水组和pcDNA3组;pcDNA3-Ag85B免疫小鼠脾细胞在Ag85B抗原刺激下,IL－2和IFN－γ mRNA转录水平明显高于对照组,而IL－4和IL－10 mRNA转录水平在3组中无明显变化。结论 pcDNA3-Ag85B质粒DNA疫苗不仅能增强体液免疫,亦可诱导Th1型细胞免疫。     

结核分枝杆菌休眠相关抗原Rvl733cDNA疫苗的构建及免疫学特性研究

目的 构建结核分枝杆菌（Mtb）休眠相关抗原Rv1733c的真核表达载体,并评价其作为DNA疫苗的免疫学特性。 方法 利用限制性酶切的方法从本室前期保存的pMD-18T-Rv1733c质粒中构建Rv1733c的真核表达载体pcDNA-Rv1733c。将pcDNA-Rv1733c重组质粒稳定转染P815细胞,并用间接免疫荧光法检测Rv1733c的表达。采用数字表法随机将BALB/c小鼠分为3组,每组10只,即pcDNA-Rv1733c质粒DNA组、生理盐水组和BCG组。pcDNA-Rv1733c质粒DNA组和生理盐水组采用肌内注射方式免疫,间隔2周免疫1次,共免疫3次。BCG组采用皮下免疫一次。各组小鼠每2周采血,ELISA检测血清中特异性抗体水平和IgG2a/IgG1抗体亚类比率与比值。初次免疫8周后,MTS［3-(4,5-diethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-etrazolium,inner salt］（四氮唑蓝盐化合物）法检测小鼠脾淋巴细胞特异性增殖、ELISPOT检测脾淋巴细胞分泌IFN-γ的水平。流式细胞法检测脾淋巴细胞中CD4⁺和CD8⁺ T细胞所占比率;LDH法检测CTL（cytotoxic T lymphocytes;细胞毒性T淋巴细胞）活性。 结果 成功构建Rv1733c的真核表达载体pcDNA-Rv1733c。间接免疫荧光实验表明pcDNA-Rv1733c质粒稳定转染的P815细胞中能够稳定表达Rv1733c蛋白。pcDNA-Rv1733c质粒DNA免疫小鼠后能诱导小鼠产生特异性抗体,抗体亚类以IgG2a为主,随着免疫时间的延长,IgG2a/IgG1的比值趋于平衡;脾淋巴细胞增殖指数（2.00±0.36）高于BCG组（1.1±0.06）（t=3.096,P<0.05）;特异性分泌IFN-γ的脾淋巴细胞频数(41.48±5.30) SFC/10⁶高于生理盐水组（2.75±1.37）SFC/10⁶（t=4.752,P<0.05）;然而脾淋巴细胞中CD4⁺、CD8⁺ T细胞所占比率［分别为(18.15±2.30)%、(7.68±1.34)%］、CTL杀伤活性［(29.52±1.96)%］都与生理盐水组相当［(16.43±2.02)% (t=0.571,P>0.05)、(7.32±0.42)% (t=0.234,P>0.05)、（25.28±2.51）%（t=0.726,P>0.05）］。 结论 成功构建Rv1733c真核表达载体pcDNA-Rv1733c;并能够诱导小鼠机体产生特异性的体液和细胞免疫应答,提示用于结核病新型疫苗的研究具有一定的意义。     

中试生产的结核DNA疫苗免疫效能研究

目的 以300 L发酵罐中试规模生产的冻干Mtb Ag85A质粒DNA疫苗为基础免疫小鼠,对该疫苗的免疫效能进行研究。 方法 将4~6周龄的BALB/c小鼠20只通过数字表法随机分为2组,一组免疫Mtb Ag85A质粒DNA疫苗（结核DNA疫苗免疫组）,另一组免疫PBS作为阴性对照（PBS对照组）;于免疫前采血,肌内注射免疫3次。在第3次免疫后3周摘眼球处死小鼠,收集血清,进行血清特异性抗体检测和细胞因子(IFN-γ、IL-4)检测;同时对每只小鼠取脾细胞进行特异性γ干扰素 (IFN-γ) 分泌检测和脾细胞CD4⁺、CD8⁺百分率检测。 结果 （1）免疫前后免疫组与对照组抗体水平吸光度A值均小于0.2。（2）结核DNA疫苗免疫组血清细胞因子IL-4水平［（146.2±34.3）pg/ml］低于PBS对照组［（177.7±28.1）pg/ml］,差异有统计学意义（t=2.244,P=0.038）,而IFN-γ水平［（129.6±159.0）pg/ml］虽然高于PBS对照组［（76.5±21.5）pg/ml］,但差异无统计学意义（t=－1.047,P=0.309）。（3）酶联免疫斑点检测结果表明结核DNA疫苗免疫组脾细胞特异性IFN-γ分泌水平（分泌IFN-γ细胞个数）（103.60±112.14）高于PBS对照组（5.78±5.83）,差异有统计学意义（t=36.538,P=0.018）。（4）结核DNA疫苗免疫组CD4⁺细胞百分率均值（21.57%）高于PBS对照组（12.17%）,差异有统计学意义（t=3.043,P=0.038）;CD8⁺细胞百分率均值（13.70%）与PBS对照组（10.57%）相比,差异无统计学意义（t=0.847,P=0.445）。 结论 Mtb Ag85A质粒DNA疫苗主要刺激机体Th1型细胞免疫,而对诱导机体产生Th2型细胞免疫应答没有显著的促进作用。     

结核分枝杆菌Ag85B-ESAT-6融合蛋白重组耻垢分枝杆菌对小鼠的免疫原性研究

目的 评价表达Mtb Ag85B-ESAT-6融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌（Ag85B-ESAT-6-rM.s）在小鼠中的免疫原性。 方法 6周龄BALB/c小鼠经背部皮下注射1×10⁶ CFU（colony-forming unit,菌落形成单位）的Ag85B-ESAT-6-rM.s,同时设M.s免疫组（10只）、BCG免疫组（10只）、Ag85B-ESAT-6融合蛋白免疫组（10只）和生理盐水组（10只）。接种免疫后1～6周,尾静脉采血,检测小鼠外周血CD4⁺和CD8⁺ T细胞所占百分比;免疫后6周,MTS［3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium, inner salt］法检测小鼠脾淋巴细胞增殖和酶联免疫斑点检测（enzyme-linked immunospot assay,ELISPOT）检测脾淋巴细胞分泌γ干扰素（interferon γ,IFN-γ）、白细胞介素-2（interleukin-2,IL-2）和白细胞介素-4（interleukin-4,IL-4）等细胞因子的水平。 结果 Ag85B-ESAT-6-rM.s免疫小鼠后能够明显刺激小鼠外周血CD4⁺和CD8⁺ T细胞的产生,其所占百分比［（59.6±1.5）%］明显高于BCG免疫组［(48.8±2.3)%］（t=12.252,P<0.05）和原始M.s免疫组［(45.7±1.6)%］（t=20.166,P<0.05）。Ag85B-ESAT-6-rM.s免疫小鼠的脾淋巴细胞增殖指数（3.23±0.31）与BCG免疫刺激的增殖指数（2.95±0.36）相当（t=1.864,P>0.05）,但其诱生IFN-γ的能力［斑点形成细胞(spot forming cells,SFC) ］［(167.5±36.6)SFC/10.6］明显高于BCG［(98.5±26.9)SFC/10⁶ ］（t=4.804,P<0.05）。 结论 Ag85B-ESAT-6融合蛋白在耻垢分枝杆菌中的表达能够明显提高M.s的免疫原性,并能够刺激小鼠机体产生有利于抗Mtb感染的免疫反应,作为TB新型候选疫苗具有一定的研究前景。     

重组分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白和CFP32的表达及其抗原性

目的 重组表达结核分枝杆菌CFP10和ESAT 6的融合蛋白及卡介苗（BCG）CFP32,分析其抗原性。 方法 用重组PCR从结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组DNA中扩增获得融合基因cfp10-esat6;从BCG基因组DNA中扩增cfp32基因。经克隆和测序分析后,分别亚克隆至表达载体pQE-30和pET-23a(+),在大肠埃希菌BL21中表达重组蛋白,予以纯化、 鉴定,Western blot和间接ELISA分析重组蛋白的抗原性。 结果构建了重组表达质粒pQE30-cfp10-esat6和 pET-cfp32,表达了CFP10-ESAT6融合蛋白和CFP32。CFP10-ESAT6蛋白表达量约占菌体总蛋白的15.2%,纯化后蛋白纯度约为92%,浓度为0.456-g/L;CFP32蛋白表达量约占菌体总蛋白的10.6%,纯化后蛋白纯度约为90%,浓度为0.310-g/L。纯化CFP10-ESAT6融合蛋白和CFP32检测结核病的敏感性分别为85.7%和71.4%,特异性均为100%。 结论 重组表达获得具有良好抗原性的重组融合蛋白CFP10-ESAT6和重组蛋白CFP32。