210株结核分枝杆菌利福平耐药基因rpoB突变特征研究

目的了解结核分枝杆菌利福平耐药株rpoB基因突变特点。方法对结核分枝杆菌临床分离株包括rpoB基因利福平耐药决定区(RRDR)81个碱基在内的286bp的片段进行PCR-SSCP分析,并对经检测显示有突变的结核分枝杆菌的rpoB基因此扩增区域进行序列测定。结果共对210株结核分枝杆菌临床分离菌株进行了研究,其中利福平耐药株110株,非利福平耐药株40株,敏感株60株。PCR-SSCP检测显示110株利福平耐药株中有75株有突变存在,经测序分析,77.3%(58/75)的菌株发生rpoB基因的单位点突变,主要集中在456位60.3%(35/58)和451位25.9%(15/58);22.7%(25/110)的菌株发生了联合突变。此外,经PCR-SSCP检测,40株非利福平耐药株中有3株发生突变,60株敏感株中有2株发生突变。经直接测序分析突变涉及位点为436位、451位和460位。结论结核分枝杆菌利福平耐药的主要原因是rpoB基因耐药决定区发生突变,其中456位丝氨酸和451位组氨酸是最常见的突变位点。     

等位基因特异性多重聚合酶链反应方法用于快速检测结核分枝杆菌利福平耐药株

目的建立检测耐利福平(RFP)结核分枝杆菌的等位基因特异性多重聚合酶链反应(multiplex allele specific polymerase chain reaction,MAS-PCR)方法,快速、特异地检测rpoB基因核心突变区的主要突变,用于快速诊断结核分枝杆菌对利福平的耐药性。方法根据结核分枝杆菌的rpoB序列,分别设计出3对特异性寡聚核苷酸引物,采用MAS-PCR技术,分别检测rpoB基因上531、526、516这3个最常见的突变位点的突变。结果对临床分离的利福平敏感株(15株)及利福平突变株(81株)进行检测,以直接测序结果为参照,对利福平耐药株的总检出率为81.5%(66/81)。结论MAS-PCR方法敏感、特异,可快速、简便地检测结核分枝杆菌rpoB基因突变,有利于耐药结核分枝杆菌的快速检测。     

新乡地区结核分枝杆菌利福平耐药株基因型研究北大核心CSCD

目的分析新乡地区结核分枝杆菌利福平耐药株基因型,为控制耐药性发展与耐药株传播奠定基础。方法收集患者痰液样本370例,鉴定结核分枝杆菌。对菌株进行耐药性分析及rpoB基因扩增及测序,分析耐药株基因型。结果370例新乡地区患者中分离174株结核分枝杆菌,分离率为47.03%。其中,2016-2018年各分离结核分枝杆菌29、63和82株,分离率为36.25%、45.32%和54.30%。2016年29株结核分枝杆菌对利福平、异烟肼、链霉素、氧氟沙星的耐药率分别为48.28%、44.83%、34.48%和27.59%;2017年63株结核分枝杆菌耐药率分别为61.90%、47.62%、38.10%、26.98%;2018年82株结核分枝杆菌耐药率分别为70.73%、57.32%、39.02%和35.37%。111株利福平耐药的结核分枝杆菌中,87株发生rpoB基因变异,基因突变率为78.38%。其中Ser→Leu在521位点突变58株(52.25%)和His→Leu在526位点突变22株(19.82%)是主要基因突变类型。此外,有24株(21.62%)未发生变异。结论2016-2018年新乡地区患者结核分枝杆菌分离率逐年增高。结核分枝杆菌对利福平耐药率最高,且逐年增高。利福平耐药株的耐药性产生的主要机制是rpoB基因发生位点突变。     

rpoB基因点突变与结核分枝杆菌对利福平耐药相关性的研究

目的了解浙江地区分离的结核分枝杆菌临床菌株对利福平（RFP）的耐药率及该菌rpoB基因点突变与RFP耐药性的关系。方法从浙江地区肺结核病人的痰液或咽拭子标本中分离并鉴定结核分枝杆菌72株。采用K-B纸片法和E-试验法检测上述结核分枝杆菌临床菌株对RFP的耐药性。采用PCR检测上述结核分枝杆菌临床菌株rpoB基因携带率。通过对RFP敏感或耐药各10株结核分枝杆菌临床菌株rpoB基因T-A克隆后测序，了解该基因氨基酸序列第516、526和531位点突变情况及其与RFP耐药性的关系。结果38．9％（28／72）结核分枝杆菌临床菌株对RFP耐药。所有结核分枝杆菌临床菌株均携带rpoB基因。1株RFP敏感的结核分枝杆菌临床菌株rpoB基因氨基酸序列中出现S526L点突变。5株RFP耐药的结核分枝杆菌临床菌株rpoB基因氨基酸序列中出现S526L点突变，另5株发生H531D点突变，但均未发现516位氨基酸突变或526和531位氨基酸联合突变。结论浙江地区分离的结核分枝杆菌临床菌株有较高的RFP耐药频率。上述结核分枝杆菌临床菌株对RFP耐药性与rpoB基因氨基酸序列526或531位点突变密切相关。     

对利福平耐药的结核分枝杆菌rpoB基因突变与耐药程度关系的探讨

目的　探讨对利福平耐药结核分枝杆菌的rpoB基因的突变位置与耐药程度的关系。方法　 32株对5 0 μg·mL-1的利福平耐药 (R5 0 )、2 2株对 2 5 0 μg·mL-1的利福平耐药 (R2 5 0 )、10株对利福平、异烟肼、乙胺丁醇及链霉素敏感的结核分枝杆菌株 (R0 )和 1株H3 7Rv结核分枝杆菌株包括核心区域在内的rpoB基因片段进行了DNA序列分析。结果　 (1) 10株 (R0 )对利福平、异烟肼、乙胺丁醇及链霉素敏感的结核分枝杆菌株和 1株H3 7Rv结核分枝杆菌株未检测到rpoB基因易突变区的改变 ;(2 )耐利福平的低耐药 (R5 0 )结核分枝杆菌突变 2 5株 (78 1% ) ;耐利福平的高耐药 (R2 5 0 )结核分枝杆菌突变 2 1株 (95 5 % ) ,两者差异无显著性 (P =0 170 ) ;(3)耐利福平的低耐药 (R5 0 )结核分枝杆菌突变点呈散在分布 ;(4 )耐利福平的高耐药 (R2 5 0 )结核分枝杆菌突变以 5 31位氨基酸突变为主 (5 7 1% )以及联合突变较多见 (2 3 8% ) ,与R5 0相比两者差异有显著性。结论　大部分对利福平耐药的结核分枝杆菌均有rpoB基因突变。在对利福平低耐药结核分枝杆菌的rpoB基因中 ,其突变位置呈散在分布。在对利福平高耐药结核分枝杆菌的rpoB基因中 ,5 31位密码子突变及多个密码子联合突变是其主要突变特征。     

利用DNA芯片技术检测新疆结核分枝杆菌rpoB基因与对利福平耐药水平的关系

目的研究新疆地区结核分枝杆菌rpoB基因的突变与对利福平耐药水平的关系。方法采用DNA芯片技术对耐利福平菌株rpoB基因进行检测。结果 46株结核分枝杆菌利福平初始耐药分离株,对利福平高耐药株30株,低耐药株13株。DNA芯片检测显示43株发生基因突变,低耐药株突变主要在526位点,少数在531位点;高耐药株主要在526位点及531位点上,其中3株为526和516位点同时发生联合突变,其余3株未见突变。结论以结核分枝杆菌标准株H37Rv为对照,新疆结核分枝杆菌对利福平耐药表现为结核分枝杆菌RNA聚合酶的β亚基的编码基因rpoB基因的点突变,而高耐药则表现为rpoB基因的526位和531位点突变及联合突变特征。     

临床依赖利福平分支杆菌的初步研究

目的 研究依赖利福平分支杆菌^[1]（依R菌）菌株的依R程度、菌落及菌体的形态特点,以期为依R菌的定义和鉴定提供依据。方法 从分支杆菌菌株库中选出在含R培养基中生长更旺盛的22株菌株,用L-J氏培养基复苏培养。选取单个菌落接种不同R浓度的培养基中培养;对不同实验管（对照管、R管）中的菌落进行计数、称重、形态观察,并作抗酸染色观察菌体形态。结果 22株依R菌经菌种鉴定为结核分支杆菌。依R菌对R的依赖性仅限于某个浓度范围（R:5～600ug/ml);不同的菌株其依赖范围不同,但大都在R100～300ug/ml范围内生长最旺盛。依R管与非依R管（对照管）中菌落（菌体）形态均有明显的差异,其菌落重量差为2.2～5倍。结论 目前我们所发现的依R菌株均为结核分支杆菌。依R菌对R的依赖为相对依赖。分支杆菌在含R培养基中菌落生长更旺盛和菌体粗大、浓染的特征,可作为依R菌初步鉴定的依据。     

结核分枝杆菌利福平依赖株与耐药株的耐药状况比较

目的 调查结核分枝杆菌利福平依赖株和耐药株对临床常用抗结核药物的耐药性差异,并探讨其临床意义。 方法 采用匡氏双相琼脂培养基分离痰结核分枝杆菌并作耐药性和依赖性测定。 结果依赖组菌株对8种药物的耐药率均高于耐药组菌株,2组菌株对链霉素(S)、乙胺丁醇(E)、对氨基水杨酸 (PAS)、阿米卡星(Am)的耐药率差异有统计学意义(P<0.05),对左氧氟沙星(Lfx)的耐药率差异有统计学意义(P<0.01);100%依赖株和98.6%耐药株为MDR株;依赖株和耐药株中XDR菌株的比例分别为14.6%和5.8%,P=0.05。 结论 结核分枝杆菌利福平依赖株均为MDR株,对一线和二线抗结核药物耐药率高,XDR株比例高,应予高度警惕和关注。     

结核分枝杆菌rpoB基因突变特征与利福平耐药水平关系的研究

目的 了解结核分枝杆菌rpoB基因突变特征与利福平耐药水平的关系。方法 测定266株(109株利福平耐药株,157株利福平敏感株)结核分枝杆菌利福平MIC值及其rpoB基因序列,分析不同突变特征的菌株其利福平MIC值的差异。结果 109株利福平耐药株rpoB基因皆发生错义突变,常见突变密码子531与526的突变频率分别为69.7%与17.4%。利福平耐药株中单密码子突变株占82.6%,多重密码子突变株占17.4%。531单密码子突变株与526单密码子突变株之间平均利福平MIC值差异无统计学意义(P=0.87),但两独立样本T检验分析显示,多重密码子突变株平均利福平MIC值(115.8 μg/mL)显著高于单密码子突变株平均利福平MIC值(48.4 μg/mL)(t=2.659,P=0.016)。利福平敏感株未发生错义突变。5.5%(6/109)的利福平耐药株仅在rpoB基因起始端发生突变,突变密码子分别是247,251和253。结论 531与526是最常见突变密码子,且以单密码子突变为主;531与526单密码子突变株之间利福平耐药水平差异无统计学意义,但多重密码子突变株利福平耐药水平显著高于单密码子突变株利福平耐药水平;rpoB基因起始端突变可能是除利福平耐药决定区域之外导致利福平耐药的第2个耐药决定区;rpoB基因DNA序列分析有助于结核分枝杆菌利福平耐药表型和耐药水平的预测。     

新乡地区结核分枝杆菌利福平耐药株基因型研究

目的分析新乡地区结核分枝杆菌利福平耐药株基因型,为控制耐药性发展与耐药株传播奠定基础。方法收集患者痰液样本370例,鉴定结核分枝杆菌。对菌株进行耐药性分析及rpoB基因扩增及测序,分析耐药株基因型。结果 370例新乡地区患者中分离174株结核分枝杆菌,分离率为47.03%。其中,2016-2018年各分离结核分枝杆菌29、63和82株,分离率为36.25%、45.32%和54.30%。2016年29株结核分枝杆菌对利福平、异烟肼、链霉素、氧氟沙星的耐药率分别为48.28%、44.83%、34.48%和27.59%;2017年63株结核分枝杆菌耐药率分别为61.90%、47.62%、38.10%、26.98%;2018年82株结核分枝杆菌耐药率分别为70.73%、57.32%、39.02%和35.37%。111株利福平耐药的结核分枝杆菌中,87株发生rpoB基因变异,基因突变率为78.38%。其中Ser→Leu在521位点突变58株(52.25%)和His→Leu在526位点突变22株(19.82%)是主要基因突变类型。此外,有24株(21.62%)未发生变异。结论 2016-2018年新乡地区患者结核分枝杆菌分离率逐年增高。结核分枝杆菌对利福平耐药率最高,且逐年增高。利福平耐药株的耐药性产生的主要机制是rpoB基因发生位点突变。     

脓肿分枝杆菌细胞壁通透性的研究

目的了解脓肿分枝杆菌的细胞壁的通透性.方法在含RFP的液体培养基中加入Tween 80以增加细菌细胞壁的通透性,观察对RFP具不同MIC的脓肿分枝杆菌的生长在450 nm的光吸收值（OD450）的变化,同时用电镜对脓肿分枝杆菌标准株、临床耐药株和敏感株的细胞壁进行超微结构的观察.结果临床耐药菌株在同时含1/5MIC浓度的RFP和0.05%Tween 80的液体培养基中生长的OD450值与单含RFP的OD450值比较有显著性差异（P＜0.05）;临床敏感株和结核杆菌耐药株在两种培养基中的OD450值比较无显著性差异;在电镜下观察,脓肿分枝杆菌耐药株的细胞壁可见有薄层深染线,而敏感株的细胞壁结构均匀.结论脓肿分枝杆菌确实存在细胞壁的低通透性,且脓肿分枝杆菌耐药株和敏感株的细胞壁在结构上有一定差异,因此膜通透性低下可能是其耐RFP的重要原因.     

六安地区结核分枝杆菌耐药基因katG 和rpoB 的突变特征

目的 分析临床分离的结核分枝杆菌katG 和rpoB 基因的突变情况与耐药之间的关系,了解六安地区耐药结核分枝杆菌的基因突变特征。方法 采用比例法对六安地区65 株结核分枝杆菌临床分离株进行药敏试验;通过特异性引物,对目的基因片段katG 和rpoB 进行扩增、测序后进行分析。结果 60 株结核分枝杆菌中分别有有9 株耐异烟肼和14 株耐利福平,其中同时耐异烟肼和利福平的6株。9 株耐异烟肼菌株中,4 株katG 在315（Ａ GC→ACC 或ACA）位点发生突变,占44.4％;14 株耐利福平菌株中,11 株rpoB 分别在516（GAC→GTC）、526(CAC→CGC 或TAC)和531(TCG→TTG)位点发生突变,占总耐药菌株的78.6％;6 株同时对利福平和异烟肼耐药,其中5 株katG 或rpoB 基因发生突变,占83.3％。结论 六安地区结核分枝杆菌耐异烟肼和耐利福平分别主要是由katG 和rpoB 基因突变引起,其中耐异烟肼主要在315（AGC→ACC 或ACA）位,而耐利福平在516（GAC→GTC）、526(CAC→CGC或TAC)和531(TCG→TTG)位,都发生了突变。     

套式PCR及测序方法用于痰标本中结核分枝杆菌rpoB耐药基因突变检测

目的应用套式PCR—DNA测序方法直接检测痰标本中结核分枝杆菌相关的rpoB基因突变，以期建立一种直接检测分枝杆菌耐利福平的快速方法，并评价其临床应用价值。方法采用套武PCR—DNA测序方法直接检测112例活动性肺结核患者和20例非结核性肺部疾病患者痰、标本中结核分枝杆菌rpoB基因突变情况。同份痰标本同时做涂片抗酸染色，罗氏培养及菌型鉴定。结果112例活动性肺结核患者痰标本套式PCR扩增87例呈阳性，产物DNA测序31例有rpoB基因突变。其中分离出耐利福平株的32例痰中29例发生了基因突变，耐药突变率90．6％（29／32），39例菌阴（涂阴培阴）痰中有2例发生突变。分离出对利福平敏感株的37例痰中未发生突变，20例非结核性肺部疾病患者痰标本套式PCR扩增均为阴性，特异性100％。结论套式PCR—DNA测序可望为直接检测临床痰标本中结核分枝杆菌耐利福平的准确、特异、快速的方法。     

单耐利福平结核分枝杆菌耐药分子机制研究

目的 探讨单耐利福平结核分枝杆菌中耐药相关基因突变以及药物外排泵两种不同耐药机制的功能。 方法 从国家结核病参比实验室2007-2008年全国耐药基线调查菌株库中挑选单耐利福平的菌株23株。采用直接测序法检测利福平耐药相关基因rpoB突变情况。提取rpoB无突变菌株的RNA后反转录并采用real-time PCR方法检测20个药物外排泵基因的表达量,对比菌株最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration,MIC）实验结果,筛选可能与利福平药物外排相关的基因,并选用大肠埃希菌为模式生物,构建表达载体,检测过表达目的外排泵的大肠埃希菌对利福平的耐药程度以验证。结果 在23株单耐利福平的菌株中,有16株（69.6%）检测到rpoB突变,其中包括531位点突变9株,526位点突变6株及533位点突变1株。Ser531Leu、His526Asp表现为高浓度耐药,其MIC分别为192 μg/ml和256 μg/ml;而突变类型His526Gly、His526Leu、His526Arg和Leu533Pro表现为低浓度耐药,其MIC分别为0.75 μg/ml、4 μg/ml、2 μg/ml和0.5 μg/ml。在rpoB未突变菌株中,通过real-time PCR发现Rv2936、Rv0783和Rv0933的转录水平与MIC呈正相关。在对照组和转入pEASY-E1-Rv0933的大肠埃希菌中MIC均为 8 μg/ml,而转入pEASY-E1-Rv2936和 pEASY-E1-Rv0783的大肠埃希菌的MIC均有不同程度的提高,分别为32 μg/ml和16 μg/ml。结论 不同耐药突变类型导致的耐药程度不同,Rv2936和Rv0783可能是与利福平耐药相关的的药物外排泵基因。     

中国耐利福平结核分支杆菌rpoB基因突变特点

目的：为了阐明中国结核病耐利福平菌株rpoB基因突变特点。方法：对212株结核分支杆菌菌株包括rpoB基因核心区域81个碱基在内的588个碱基进行序列测定,其中利福平耐药株163株;利福平敏感株46株,及人工诱导的利福平耐药株3株。结果：有89．0％（145／163）的耐药株存在rpoB基因突变,而对照敏感株无突变。531位氨基酸突变率为49．1％;526位氨基酸突变率为17．8％;联合突变发生率为12．3％;还有2株细菌存在同义突变;未检测到发生缺失或插入突变的菌株。高耐药组（耐250μg/ml利福平）531位氨基酸的突变率显著高于低耐药组（耐50μg/ml利福平）,P＜0．05。结论：中国结核菌耐利福平菌株的rpoB基因突变的发生率约为90％,其中最常见的突变位点是531位色氨酸和526位组氨酸,二者总体突变率是66．9％;利福平高耐药组531位氨基酸发生突变的几率高于低耐药组,插入和缺失突变在我国比较罕见;DNA序列分析对临床用药有指导意义。     

套式PCR及测序方法用于痰标本中结核分枝杆菌rpoB耐药基因突变检测

目的应用套式PCR-DNA测序方法直接检测痰标本中结核分枝杆菌相关的rpoB基因突变,以期建立一种直接检测分枝杆菌耐利福平的快速方法,并评价其临床应用价值。方法采用套式PCR-DNA测序方法直接检测112例活动性肺结核患者和20例非结核性肺部疾病患者痰标本中结核分枝杆菌rpoB基因突变情况。同份痰标本同时做涂片抗酸染色,罗氏培养及菌型鉴定。结果112例活动性肺结核患者痰标本套式PCR扩增87例呈阳性,产物DNA测序31例有rpoB基因突变,其中分离出耐利福平株的32例痰中29例发生了基因突变,耐药突变率90.6%(29/32),39例菌阴(涂阴培阴)痰中有2例发生突变。分离出对利福平敏感株的37例痰中未发生突变,20例非结核性肺部疾病患者痰标本套式PCR扩增均为阴性,特异性100%。结论套式PCR-DNA测序可望为直接检测临床痰标本中结核分枝杆菌耐利福平的准确、特异、快速的方法。     

RPA-LFD技术快速检测结核分枝杆菌利福平耐药性的应用

目的 基于重组酶聚合酶扩增(RPA)技术结合侧向流动试纸条(LFD),建立可快速检测结核分枝杆菌(MTB)利福平耐药的方法,并初步评价其临床应用价值.方法 采用比例法对182株结核分枝杆菌临床分离株进行利福平耐药性检测.建立RPA-LFD技术,检测182株菌株中利福平耐药决定区(RRDR)常见突变位点rpoB 531、...     

脓肿分枝杆菌细胞壁通透性的研究

目的　了解脓肿分枝杆菌的细胞壁的通透性。方法 在含RFP的液体培养基中加入Tween 80以增加细菌细胞壁的通透性,观察对RFP具不同MIC的脓肿分枝杆菌的生长在450nm的光吸收值(OD₄₅₀)的变化,同时用电镜对脓肿分枝杆菌标准株、临床耐药株和敏感株的细胞壁进行超微结构的观察。结果 临床耐药菌株在同时含1/5MIC浓度的RFP和0.05%Tween 80的液体培养基中生长的OD₄₅₀值与单含RFP的OD₄₅₀值比较有显著性差异(P<0.05);临床敏感株和结核杆菌耐药株在两种培养基中的OD₄₅₀值比较无显著性差异;在电镜下观察,脓肿分枝杆菌耐药株的细胞壁可见有薄层深染线,而敏感株的细胞壁结构均匀。结论 脓肿分枝杆菌确实存在细胞壁的低通透性,且脓肿分枝杆菌耐药株和敏感株的细胞壁在结构上有一定差异,因此膜通透性低下可能是其耐RFP的重要原因。     

19952004年芬兰耐药结核分枝杆菌分离株分子基因学分析

背景：利用现代分子生物学来帮助我们理解结核分枝杆菌的传播和流行病学机理。目的：分析耐药结核分枝杆菌分子流行病学和1995--2004年芬兰耐异烟肼及利福平相关突变菌株。设计：对3959株新结核分枝杆菌菌株进行了药物敏感性试验，如有必要，所有的耐药性表型菌株都进行了IS6110限制性片段长度多态性和间隔寡核苷酸分型分析。对耐异烟肼及利福平菌株分别进行了katG315位密码子和rpoB耐性基因测序。结果：在测试的3959（92．4％为培养阳性）株分离株中，183个（4．6％）对至少一种一线抗结核药耐药；14（0．4％）株为耐多药。37株（20．4％）耐性菌株属于17个簇，其中最大的簇包括4个分离株。北京家族占所有耐药菌株的8．8％（16株）。在异烟肼耐药菌株中，katG的Ser315Thr突变占46．7％（56株）；在利福平耐药菌株中rpoB突变占85．7％（18株）。结论：耐药结核病在芬兰传染率很少，尤其在本地和外来人口间。如果存在产生耐多药的危险因素，筛查异烟肼和利福平耐药相关突变是可行的。     

应用等位基因特异性多重聚合酶链反应同步检测结核分枝杆菌的耐药性

目的建立可同步检测结核分枝杆菌katG和ropoB基因突变的等位基因特异性多重聚合酶链反应（MAS-PCR）的方法，以快速检测结核分枝杆菌对利福平（RFP）和异烟肼（INH）的耐药性。方法根据结核分枝杆菌katG和rpoB基因序列，分别设计特异性寡聚核苷酸引物，采用MAS-PCR技术，分别检测katG基因315位点和rpoB基因中531、526和516三个最常见的突变位点。结果19株INH敏感株中均未发现katG基因315位点的突变，耐药株中发现有79．2％（61／77）的菌株存在突变；15株RFP敏感株中未发现rpoB基因突变。MAS-PCR方法可检测出81．5％（66／81）的利福平耐药株。结论MAS-PCR方法对katG和rpoB基因的同步检测有较高的敏感性和特异性，有望用于耐药结核分枝杆菌的快速检测。