骨髓间充质干细胞向少突胶质细胞的定向分化☆

目的：神经反射通路的重建和再髓鞘化是影响脊髓损伤后恢复的一个关键性因素，而少突胶质细胞存活的多少直接影响轴突再生后髓鞘化。探讨骨髓间充质干细胞向少突胶质细胞定向分化的可行性。 方法：实验于2006-09/2007-06在同济医院骨科实验室完成。①动物：2~4周龄清洁级SD大鼠5只，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。②实验方法：大鼠颈脱臼法处死，无菌条件下取双侧股骨、胫骨，去除两端骨骺，暴露骨髓腔，用DMEM培养液反复冲洗，收集冲洗液，重悬细胞种植于25 cm2培养瓶中，培养体系中含DMEM、体积分数为0.1的胎牛血清、终浓度为2 mmol/L谷氨酰胺及100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素，采用贴壁法+胰蛋白酶消化法进行纯化。取培养至第4代的骨髓间充质干细胞，加入含有碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、胰岛素样生长因子、N2添加剂的无血清培养基进行诱导分化。③实验评估：观察诱导过程中骨髓间充质干细胞的形态学变化。半定量RT-PCR检测少突胶质细胞特异性标志物mRNA的表达。应用抗微管相关蛋白、抗神经纤维酸性蛋白、抗半乳糖脑苷脂、抗磷脂碱性蛋白抗体进行免疫细胞化学染色，检测骨髓间充质干细胞定向分化为少突胶质细胞的阳性率。 结果：①骨髓间充质干细胞向少突胶质细胞诱导分化过程中的形态学变化：经诱导分化后，大部分骨髓间充质干细胞表现出少突胶质细胞的形态学特征，胞质向细胞核回缩，细胞突起向外延伸，折光性增强，随时间延长多个细胞突起相互连接形成典型的网状结构。②少突胶质细胞特异性标志物mRNA的表达：细胞诱导分化后可检测到磷脂碱性蛋白mRNA、半乳糖脑苷脂mRNA的特异性条带。③少突胶质细胞阳性率：在诱导分化条件下，半乳糖脑苷脂阳性率为65%，磷脂碱性蛋白阳性率为45%，微管相关蛋白2阳性率为10%。 结论：碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子与胰岛素样生长因子联合应用，能够有效促进骨髓间充质干细胞向少突胶质细胞分化。     

甲状腺激素对大鼠骨髓间充质干细胞分化为少突胶质细胞的影响

背景：如何为脱髓鞘疾病的细胞替代治疗提供丰富的少突胶质细胞来源是急需解决的问题。 目的：实验拟采用表皮生长因子及碱性成纤维细胞因子诱导骨髓间充质干细胞向神经干细胞方向分化,撤退细胞因子后,用甲状腺激素诱导神经干细胞向少突胶质细胞分化。 设计、时间及地点：细胞观察实验,于2007-08/12在泸州医学院神经生物学研究室完成。 材料：普通级SD大鼠5只用于骨髓间充质干细胞的培养。 方法：采用密度梯度离心法从大鼠骨髓中分离培养骨髓间充质干细胞,传至第4代,用含碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、N2辅助因子、甲状腺激素T3的DMEM/F12诱导液诱导向神经干细胞分化。诱导后4 d,更换成含胎牛血清、甲状腺激素T3的DMEM/F12分化液,诱导向少突胶质细胞分化。 主要观察指标：骨髓间充质干细胞生长情况和形态变化,采用SABC法进行免疫细胞化学检测神经细胞特异性标志的表达。 结果：原代细胞接种3 d后多数贴壁,传代后细胞贴壁速度加快,增殖能力更强。诱导液处理第4天,圆形细胞聚集成簇。换成分化液后,细胞伸出树枝状细长突起,交织成网,形成少突胶质细胞样细胞。骨髓源性细胞簇表达巢蛋白阳性,示神经干细胞;从细胞簇分化的细胞,多数细胞表达半乳糖脑苷脂,部分细胞表达髓鞘碱性蛋白,示少突胶质细胞,少数细胞表达微管相关蛋白2阳性,示神经元。 结论：甲状腺激素在体外可诱导骨髓间充质干细胞向少突胶质细胞分化。     

间充质干细胞向神经细胞诱导过程中表面标记的变化

背景：成熟的中枢神经系统缺乏再生能力。因此，找寻新的神经干细胞来源就显得尤为重要。 目的：观察碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子对间充质干细胞诱导分化为神经元样细胞的差异。 方法：从正常人骨髓中分离获取间充质干细胞，体外培养扩增、纯化后种植于96孔板中，调整细胞密度为0.25×108 L-1，每孔200 μL DMEM/F12培养液，从第0~7天，每天于固定时间在5个孔里加入20 μL MTT，放入培养箱继续培养4 h后吸净孔内的培养液，加入二甲基亚砜100 μL/孔。另外，一部分细胞用碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子单独或联合对其进行诱导分化。MTT法绘制细胞的生长曲线，RT-PCR比较两种细胞因子诱导细胞的差异，TRAP(PCR)-ELISA检测诱导后细胞的端粒酶活性。 结果与结论：未诱导的第4代间充质干细胞有nestin，GFAP和NF-M mRNA的表达，随着诱导时间延长表达逐渐加强，但是诱导7 d后nestin的表达量逐渐下降。MAP2 mRNA的表达在诱导后出现，随着诱导，表达逐渐加强。碱性成纤维细胞生长因子+表皮生长因子诱导组和碱性成纤维细胞生长因子诱导组MAP2 mRNA的表达量明显多于表皮生长因子诱导组，而表皮生长因子组可见较多胶质纤维酸性蛋白的表达。提示间充质干细胞可以在体外培养，扩增以及向神经干细胞分化。分化后的神经干细胞具有增殖的活性，但是不具备肿瘤细胞的无限增殖性。     

人骨髓间充质干细胞诱导向多巴胺能神经元的分化

背景：体内外研究发现人骨髓间充质干细胞分化为神经元的比率都明显低于胶质细胞,并且这为数不多的神经元会逐渐死亡,而最终存活的细胞中神经元的数量更少。 目的：观察人骨髓间充质干细胞体外诱导分化为多巴胺能神经元的潜能。 方法：分离纯化和扩增人骨髓间充质干细胞,在体外先用碱性成纤维细胞生长因子和表皮细胞生长因子进行预诱导后,以胶质细胞源性神经营养因子和血管紧张素Ⅱ联合诱导人骨髓间充质干细胞向神经元和多巴胺能神经元分化。观察分化过程中细胞的形态变化,利用免疫组织化学检测神经元和多巴胺能神经元特异性标志物的表达情况。 结果与结论：人骨髓间充质干细胞经诱导后的细胞呈现双极、多极和锥形的典型神经元细胞的形态,明显表达抗人神经巢蛋白[(55.7±4.3)%]和神经元特异性烯醇化酶[(78.2±6.7)%],而且大部分人骨髓间充质干细胞表达酪氨酸羟化酶[(48.5±5.6)%],不表达神经胶质细胞标记物胶质纤维酸性蛋白。提示在适宜的条件下,人骨髓间充质干细胞可分化成神经元和多巴胺能神经元样细胞。     

不同方法诱导成人骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的比较

背景：骨髓间充质干细胞可以在体外通过多种诱导剂诱导分化为神经元样细胞，不同诱导剂的细胞分化率、细胞活力以及Nestin染色阳性细胞率不同。 目的：对比多种诱导剂诱导骨髓间充质干细胞分化神经元样细胞结果，探寻一种较好的诱导剂。 方法：取健康成人骨髓于无菌层流室中，加入淋巴细胞分离液离心取白膜，将细胞置于含碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、DMEM、体积分数为10%胎牛血清的培养瓶中，37 ℃ 体积分数为5%CO2培养箱中培养，传至第3代分为β-巯基乙醇+二甲基亚砜组，脑源性神经生长因子+维甲酸组，胶质细胞源性神经营养因子+维甲酸组和碱性成纤维细胞生长因子组分别加入诱导剂，观察细胞型态变化，细胞活力测定，免疫组织化学检测神经细胞标志物。 结果与结论：锥虫蓝染色比较各组细胞活力，胶质细胞源性神经营养因子+维甲酸组细胞活力最高(P < 0.05)，β-巯基乙醇+二甲基亚砜组活力最低(P < 0.05)，脑源性神经生长因子+维甲酸组与碱性成纤维细胞生长因子组细胞活力差别无显著性意义(P > 0.05)。神经细胞标志物表达，胶质细胞源性神经营养因子+维甲酸组阳性率高于其余3组(P < 0.05)。结果提示，成人骨髓间充质干细胞可以诱导分化为神经元样细胞，胶质细胞源性神经营养因子+维甲酸组细胞活力高，神经标志物表达阳性率高(P < 0.05)。     

表皮生长因子干预小鼠非黏附骨髓间充质干细胞成纤维细胞集落形成及向神经元样细胞的分化**

背景：非黏附骨髓间充质干细胞在体外可以不断形成成纤维细胞集落形成单位，并且可诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞，表现出一定的多分化潜能。 目的：探讨表皮生长因子对非黏附骨髓间充质干细胞形成成纤维细胞集落的影响，及其在体外向神经细胞分化的能力。 方法：分离小鼠双侧股骨、胫骨，全骨髓法分离总骨髓细胞，采用反复转移非黏附的骨髓细胞培养法纯化非黏附骨髓间充质干细胞。取第5代总骨髓细胞和非黏附骨髓间充质干细胞，加入含表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子的神经细胞诱导液培养2周。观察非黏附骨髓细胞产生成纤维细胞集落形成单位的能力，表皮生长因子对成纤维细胞集落形成单位的影响，甲苯胺蓝和免疫细胞化学染色鉴定相关蛋白的表达。 结果与结论：总骨髓细胞、反复转移的非黏附骨髓间充质干细胞均能够不断产生成纤维细胞集落形成单位。给予表皮生长因子处理后，非黏附骨髓间充质干细胞成纤维细胞集落形成单位的效率明显增高。诱导2周后，免疫细胞化学染色显示，总骨髓细胞和非黏附骨髓间充质干细胞均表达神经细胞特异性蛋白NeuN和NF-200；经甲苯胺蓝染色在部分细胞中可见神经元特异性标记尼氏体。证实表皮生长因子可有效促进小鼠非黏附骨髓间充质干细胞形成成纤维细胞集落形成单位的效率，经反复转移的非黏附骨髓间充质干细胞能够诱导分化为神经细胞。     

双重荧光标记验证静脉移植碱性成纤维细胞生长因子基因修饰骨髓间充质干细胞在脑缺血模型大鼠脑内的存活及分化

背景：碱性成纤维细胞生长因子可以促进骨髓间充质干细胞的增殖和向神经细胞方向分化，并被认为是胶质细胞的分裂原。 目的：以双重荧光标记验证静脉移植碱性成纤维细胞生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞在脑缺血模型大鼠脑内的存活及分化情况，及其向神经元样细胞和神经胶质细胞分化的趋势。 设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2005-07/2006-03在中南大学实验动物中心实验室完成。 材料：选用50只SD大鼠，按随机数字表法分为4组：假手术组（n=10），脑缺血/再灌注损伤模型组（n=10），骨髓间充质干细胞治疗组（n=15），碱性成纤维细胞生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞治疗组（n=15）。 方法：除假手术组外，其余3组制备局灶性脑缺血再灌注模型。分别将骨髓间充质干细胞或碱性成纤维细胞生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞通过静脉移植至实验性脑缺血大鼠体内，脑缺血再灌注损伤组大鼠注入相同体积的DMEM培养基。 主要观察指标：应用5-溴-2-脱氧尿苷-神经元特异核蛋白及5-溴-2-脱氧尿苷-胶质纤维酸性蛋白双重荧光标记法观察移植细胞在脑内的存活和分化情况，比较各组大鼠脑缺血后的神经功能评分及脑梗死体积变化。 结果：移植7 d后，碱性成纤维细胞生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞组大鼠脑内5-溴-2-脱氧尿苷阳性细胞数、5-溴-2-脱氧尿苷-神经元特异核蛋白双标阳性细胞数均高于骨髓间充质干细胞治疗组（P < 0.05），两组间5-溴-2-脱氧尿苷-胶质纤维酸性蛋白双标阳性细胞数差异无显著性意义（P > 0.05）。再灌注7 d后，静脉移植骨髓间充质干细胞和碱性成纤维细胞生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞均能改善脑缺血后大鼠的神经功能、减少脑梗死体积，碱性成纤维细胞生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞的作用明显优于骨髓间充质干细胞。 结论：碱性成纤维细胞生长因子诱导的骨髓间充质干细胞静脉移植后可在脑内缺血区存活，并分化为比例更合适的神经元和神经胶质细胞，发挥神经修复作用。     

细胞因子联合纹状体条件培养液定向诱导间充质干细胞体外分化为多巴胺能神经元

背景：在众多体外诱导间充质干细胞向多巴胺能神经元的诱导分化研究中，诱导阳性率仍不理想。 目的：实验应用碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和纹状体条件培养液定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为多巴胺能神经元，拟探讨提高诱导阳性率的方法。 设计、时间及地点：以细胞为对象的对照观察细胞学实验，于2006-07/2007-12在山东大学齐鲁儿童医院和山东大学第二医院血液实验室完成。 材料：健康成年Wistar大鼠用于骨髓间充质干细胞的分离，新生Wistar大鼠用于纹状体条件培养液的制备。 方法：采用贴壁法分离纯化健康成年Wistar大鼠骨髓间充质干细胞进行传代培养。取出生24 h内新生Wistar大鼠，完整剥离其大脑组织制备纹状体条件培养液。取体外培养的第5代间充质干细胞，用含碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子的预诱导液进行预诱导，24 h后去除预诱导液，换用纹状体条件培养液进行诱导。 主要观察指标：倒置显微镜下观察细胞形态变化，并应用细胞免疫化学技术检测细胞内神经元特异烯醇化酶和酪氨酸羟化酶表达。 结果：大鼠骨髓间充质干细胞经碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和纹状体条件培养液诱导后细胞胞体逐渐回缩成团，形成梭形，部分细胞可见突起伸出，类似神经元。细胞免疫化学检测，诱导后细胞神经元特异烯醇化酶阳性表达率为( 72.70±14.81)%，酪氨酸羟化酶阳性表达率为(34.50±15.93)%。 结论：应用碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子联合纹状体条件培养液诱导分化体系，获得了高比例的神经元，其中包括较多的多巴胺能神经元。     

肝细胞生长因子诱导骨髓间充质干细胞表达甲胎蛋白和白蛋白

背景：对于诱导骨髓间充质干细胞成肝细胞样细胞的研究,在大鼠及小鼠及人类中已有相关报道。甲胎蛋白和白蛋白均为肝细胞系较为特异的标志。 目的：进一步验证肝细胞生长因子对骨髓间充质干细胞的诱导分化作用。 方法：采用密度梯度离心和贴壁培养法相结合分离培养人骨髓间充质干细胞,以含20 μg/L 肝细胞生长因子和10 μg/L 碱性成纤维细胞生长因子的低糖DMEM培养基诱导培养,对照组取同代细胞,常规培养液培养。诱导培养7,14,21和28 d采用免疫组织化学方法检测甲胎蛋白和白蛋白的表达及RT-PCR技术检测白蛋白 mRNA表达。 结果与结论：诱导组骨髓间充质干细胞呈类上皮样细胞。诱导组在培养7 d时,甲胎蛋白表达阳性率为81.5%,随着培养时间延长,甲胎蛋白阳性表达率逐渐减弱,而白蛋白阳性表达率及白蛋白mRNA表达逐渐增强,至培养28 d,白蛋白阳性表达率达91.2%,对照组细胞均无白蛋白、白蛋白mRNA及甲胎蛋白表达。结果证实,肝细胞生长因子可诱导骨髓间充质干细胞表达甲胎蛋白和白蛋白。     

骨髓间充质干细胞成骨方向诱导过程中的基因表达

背景：目前骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化演变中的基因表达模式尚不明确。 目的：观察骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导分化过程中碱性磷酸酶、骨桥蛋白、Ⅰ型胶原、碱性成纤维细胞生长因子和骨钙素基因的表达情况,验证骨髓间充质干细胞是否向成骨细胞成熟分化。 方法：抽取2月龄新西兰大白兔股骨骨髓,全骨髓贴壁法培养获得骨髓间充质干细胞,用矿化诱导培养基(DMEM/F12、地塞米松1×10-8 mmol/L、β-磷酸甘油钠0.01 mol/L、维生素C 0.05 g/L)进行成骨诱导培养,用反转录-聚合酶链反应方法检测诱导培养后第一二代骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶、骨桥蛋白、Ⅰ型胶原、碱性成纤维细胞生长因子和骨钙素基因的表达情况,并对该骨髓间充质干细胞表面抗原CD44进行鉴定。 结果与结论：经矿化诱导培养基诱导培养后,第一二代骨髓间充质干细胞阶段性表达碱性磷酸酶、骨桥蛋白、Ⅰ型胶原、碱性成纤维细胞生长因子和骨钙素基因;第1代骨髓间充质干细胞抗原CD44阳性率达44.4%。提示兔骨髓间充质干细胞在体外矿化诱导培养中逐渐向成骨细胞分化,分别于诱导后第一二代细胞中阶段性顺序表达成骨细胞特异性基因碱性磷酸酶、骨桥蛋白、Ⅰ型胶原、碱性成纤维细胞生长因子和骨钙素,该细胞已具备成骨细胞特征,为揭示骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化过程中基因表达机制提供了实验依据。     

骨髓源及脂肪源干细胞向神经元样细胞诱导分化潜力的比较研究

目的 比较骨髓源基质干细胞(BMSCs)和脂肪源间充质干细胞(ADSCs)向神经元样细胞诱导分化的潜力. 方法 体外分离培养来自成年SD大鼠的BMSCs和ADSCs,传至第5代时加入表皮生长因子(EGF,10ng/mL)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF,20ng/mL),诱导6 h、12 h、24h、72 h、1周、2周后,用免疫荧光染色和Westernblot检测两种细胞的神经细胞特异性标志(巢蛋白和β.微管蛋白Ⅲ)的表达,并做统计学分析. 结果 BMSCs和ADSCs经诱导后,细胞形态发生变化,均表达神经细胞特异性标志.免疫荧光染色结果显示诱导后各时间点BMSCs和ADSCsnstin阳性率或β.tubulin Ⅲ阳性率比较差异均有统计学意义(P<0.05),且诱导后ADSCs表达nestin阳性细胞或β.tubulinⅢ的能力在各个时间点都比诱导后BMSCs强.说明诱导后的ADSCs向神经元样细胞方向分化的能力更强.Western blot结果也与免疫荧光染色结果类似. 结论 两种不同来源的干细胞在分化成神经元样细胞方面的能力不同.ADSCs比BMSCs具有相对更强的神经元样细胞分化能力.     

骨髓基质干细胞向神经元样细胞分化前后BMP4基因差异表达的初步研究

目的初步探讨骨髓基质干细胞（BMSC）向神经元样细胞分化前后骨形态发生蛋白4（BMP4）基因的表达变化情况。方法体外培养大鼠BMSC,用碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和表皮生长因子（EGF）对其进行诱导,分别于诱导前和诱导后第7天行基因芯片检测BMP4基因表达水平,并采用实时定量PCR进行验证。结果在BMSC向神经元样细胞诱导分化后的芯片表达谱中,BMP4基因的表达明显上调,且实时定量PCR亦证实此结果。结论在BMSC向神经元样细胞的分化过程中,BMP4基因可能发挥着重要的作用。     

Neuronal differentiation effects of vascular endothelial factor on bone marrow stromal cells

BACKGROUND:Studies have demonstrated that bone marrow stromal cells (BMSCs) undergo neuronal differentiation under certain in vitro conditions.However,very few inducers of BMSC differentiation have been used in clinical application.The effects of vascular endothelial growth factor (VEGF) on in vitro neuronal differentiation of BMSCs remain poorly understood.OBJECTIVE:To investigate the effect of VEGF on neuronal differentiation of BMSCs in vitro,and to determine the best VEGF concentration for experimental induction.DESIGN,TIME AND SETTING:In vitro comparative study was performed at the Central Laboratory and Laboratory of Male Reproductive Medicine,Shenzhen Hospital of Peking University from October 2008 to August 2009.MATERIALS:Recombinant human VEGF165 was purchased from Peprotech Asia,Rehovot,Israel.Neuron-specific enolase (NSE) was purchased from Beijing Biosynthesis Biotechnology,China.METHODS:BMSCs were harvested from adult Sprague Dawley rats.The passaged cells were pre-induced with 10 ng/mL basic fibroblast growth factor for 24 hours,followed by differentiation induction with 0,5,10,and 20 ng/mL VEGF,respectively.MAIN OUTCOME MEASURES:Morphological changes in BMSCs prior to and following VEGF induction.Expression of NSE following induction was determined by immunocytochemistry.RESULTS:Shrunken,round cells,with a strong refraction and thin bipolar or multipolar primary and secondary branches were observed 3 days after induction with 5,10,and 20 ng/mL VEGF.However,these changes were not observed in the control group.At 10 days after induction,the number of NSE-positive cells was greatest in the 10 ng/mL VEGF-treated group (P< 0.05).The number of NSE-positive cells was least in the control group at 3 and 10 days post-induction (P< 0.05).Moreover,the number of NSE-positive cells was greater at 10 days compared with at 3 days after induction (P< 0.05).CONCLUSION:Of the VEGF concentrations tested,10 ng/mL induced the greatest number of neuronal-like cells in vitro from BMSCs.     

mdx鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养及向肌细胞的诱导分化

背景：自体干细胞移植治疗可以克服异体干细胞移植治疗的局限性,但目前对于进行性肌营养不良模型mdx鼠骨髓间充质干细胞生物学特性及肌分化潜能研究未见报道。 目的：拟建立体外分离培养mdx鼠骨髓间充质干细胞的方法,并观察其成肌分化能力。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2006-01/07在中山大学附属第一医院神经病学实验室完成。 材料：4~6周龄纯系雄性mdx鼠10只,购自美国Jackson实验室,饲养于中山大学北校区动物实验中心。碱性成纤维细胞生长因子和兔抗鼠MHC抗体为Chemicon公司产品。 方法：全骨髓法体外分离mdx鼠骨髓间充质干细胞,差速贴壁法纯化扩增,胰酶+EDTA消化传代。取传至第3代的细胞,按1×104/孔接种于24孔板,置于含两性霉素B、碱性成纤维细胞生长因子、胎牛血清的DMEM培养基中向肌细胞方向诱导分化,2周后更换为不含两性霉素B、但添加马血清的DMEM培养基继续培养2周。 主要观察指标：鼠骨髓间充质干细胞形态、表面标志、生长曲线及成肌诱导分化。 结果：原代培养24 h后,鼠骨髓间充质干细胞约80%贴壁生长,第3代细胞多呈梭形,形态比较均一。鼠骨髓间充质干细胞表达CD29和CD44等间质类细胞的表面分子,不表达CD11B和CD45等淋巴造血细胞的表面分子。接种后第一两天细胞处于潜伏期,第3天细胞增殖旺盛,进入对数生长期,至第4天细胞数增长一倍,第5天进入平台期。两性霉素B诱导后细胞有少量死亡,停用后更换马血清促进细胞成肌,7~10 d可见有肌管样细胞形成,免疫荧光染色可见肌管样细胞呈MHC阳性,DAPI复染后可见肌细胞内有多个细胞核。 结论：在两性霉素B与马血清依次诱导条件下,体外可成功分离培养基因缺陷mdx鼠骨髓间充质干细胞,并证明其具有成肌分化潜能。     

Pre-oligodendrocytes from adult human CNS.

CNS remyelination and functional recovery often occur after experimental demyelination in adult rodents. This has been attributed to the ability of mature oligodendrocytes and/or their precursor cells to divide and regenerate in response to signals in demyelinating lesions. To determine whether oligodendrocyte precursor cells exist in the adult human CNS, we have cultured white matter from patients undergoing partial temporal lobe resection for intractable epilepsy. These cultures contained a population of process-bearing cells that expressed antigens recognized by the O4 monoclonal antibody, but these cells did not express galactocerebroside (a marker for oligodendrocytes), glial fibrillary acidic protein (a marker for astrocytes), or vimentin. Selective elimination of O4-positive (O4+) cells by complement-mediated lysis resulted in inhibition of oligodendrocyte development in vitro. Since O4+ cells have an antigenic phenotype reminiscent of the rat adult oligodendrocyte-type 2 astrocyte progenitor and appear to develop into oligodendrocytes rather than type 2 astrocytes with time in culture, we call them "pre-oligodendrocytes." Neither pre-oligodendrocytes nor oligodendrocytes incorporated 3H-thymidine in response to rat astrocyte-conditioned medium, platelet-derived growth factor, insulin-like growth factor (IGF-1), or basic fibroblast growth factor (bFGF). However, IGF-1 increased the relative abundance of oligodendrocytes to pre-oligodendrocytes, while bFGF had the opposite effect. Cells with the antigenic phenotype of pre-oligodendrocytes were also identified in tissue prints of adult human white matter. We propose that, in human demyelinating diseases such as multiple sclerosis, pre-oligodendrocytes may divide and/or migrate in response to signals present in demyelinated lesions and thus facilitate remyelination.     

Efficient gene transfer in mouse neural precursors with a bicistronic retroviral vector

Gene transfer into neural precursors is a powerful approach to study the function of specific gene products during nervous system development. Here we describe a retrovirus-based methodology to transduce foreign genes into mouse neural precursors. We used a high-titer bicistronic retroviral vector that encodes a marker gene, placental alkaline phosphatase (plap), and a selection gene, neomycin phosphotransferase II (neoR), under the translational control of two retroviral internal ribosome entry segments. Transduction efficiency even without selection was up to 95% for multipotential neurospheres derived from embryonic striata and grown with basic fibroblast growth factor 2. Expression of plap and neoR was sustained with time in culture and upon differentiation into neurons, astrocytes, and oligodendrocytes, as shown by double immunofluorescence labeling with cell type-specific markers, Western blotting, and neomycin resistance. However, levels of plap were decreased in differentiated oligodendrocytes. Transduction with the same vector of neonatal oligodendrocyte precursors grown in oligospheres consistently resulted in a lower proportion of plap-immunoreactive cells and enhanced cell death in the absence of neomycin. However, plap expression was maintained in some differentiated oligodendrocytes expressing galactocerebroside or myelin basic protein. In that neurospheres can be easily expanded in vitro and factors enabling their differentiation into the three main central nervous system cell types are being elucidated, this methodology could be used in the future to produce large number of transduced, differentiated neural cells.     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向GABA能神经元分化

目的研究骨髓间充质干细胞（BMSCs）在体外向γ-氨基丁酸（GABA）能神经元方向的分化。方法大鼠股骨骨髓分离出BMSCs,培养传代,通过10%胎牛血清（FBS）、20 ng/ml表皮生长因子（EGF）和改良Eagle培养基（DMEM/F12）预诱导24 h,随之加入含10 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、10 ng/ml骨形成蛋白-2（BMP-2）和10 ng/ml脑源性神经营养因子（BDNF）作用48 h后,再以10μmol/L全反式维甲酸（ATRA）培养48 h,最后用40 mmol/L KCl刺激15 min完成诱导分化。对照组用10%FBS和DMEM/F12培养不添加任何诱导因子。形态学观察和Western blot对分化后的细胞进行鉴定分析。结果实验组细胞在形态学上表现出典型的神经元样细胞形态,对照组无明显变化;Western blot分析知实验组Ⅰ和实验组Ⅱ都有分化为GABA能神经元的趋势,但实验组Ⅱ的分化率高于实验组Ⅰ。结论BMSCs可在体外分化为GABA能神经元。     

成鼠骨髓基质细胞分化为神经元的体外研究

目的 :通过一定的培养条件 ,使骨髓基质细胞 (BMSC)分化为神经元和胶质细胞。方法 :以含有 EGF、b FGF的培养液培养 BMSC,经传代、换液去除杂质细胞 ,撤掉 EGF、 b FGF并加胶质细胞条件培养液及 BDNF,待细胞分化后进行形态学观察及 NSE、 GFAP染色。结果 :撤掉 EGF、 b FGF并加 BDNF,胶质细胞条件培养液后 2天可见分化细胞 ,NSE阳性细胞占细胞总数的 38.47± 3.2 7% ,GFAP阳性细胞占细胞总数的 5 0 .73± 3.2 6 % ,GFAP阳性细胞占细胞总数的 5 0 .73± 4.6 5 %。结论 :本实验通过 EGF、 b FGF及适宜的培养液成功对骨髓基质细胞进行定向 ,使其转化为神经干细胞并最终诱导其分化为神经元和胶质细胞