Tet-on基因表达系统反应质粒P~(TRE-HIF-1α)的构建和表达鉴定

目的克隆和构建携带人低氧诱导因子-1α（HIF-1α）的Tet-on基因表达系统反应质粒P^TRE-HIF-1α。方法以缺氧的肝癌细胞株HepG2总RNA为模板，进行RT-巢式PCR，获得HIF-1α的cDNA，克隆人Tet-on基因表达系统反应质粒P^TRE2hyg，酶切重组子鉴定。将构建好的P^TRE-HIF-1α用脂质体法转入HepG2^Tet-on细胞，在强力霉素的作用下，用RT-PCR及Western blot法鉴定重组质粒的表达。结果扩增出HIF-1α的eDNA测序结果与Genbank记载完全一致，并成功克隆人P^TRE2hyg，将反应质粒P^TRE-HIF-1α转入HepG2^Tet-on细胞，可以完整有效表达HIF-1α且受强力霉素的调控。结论成功克隆和构建携带HIF-1α基因的Tet-on基因表达系统反应质粒P^TRE-HIF-1α，并证明其表达能在HepG2^Tet-on细胞中受强力霉素调控。     

Tet-on基因表达系统调控HIF-1α表达对肝癌细胞凋亡的影响

目的探讨HIF-1α表达在体外对肝癌细胞凋亡的影响。方法利用Tet—on基因表达系统调控HePG2细胞HIF-1α的表达，观察细胞凋亡。结果酶切和DNA测序证实Tet—on基因表达系统反应质粒P^tre-hif-1α构建成功。获得了受强力霉素调控、稳定表达HIF-1α的肝癌细胞。经阿霉素诱导凋亡后，强力霉素终浓度为0μg／ml、0．02μg／ml、0．2μg／ml、1μg／ml、2μg／ml、5μg／ml时的细胞凋亡率分别为59．6％、50．9％、38．1％、30．5％、23．9％、18．3％；强力霉素0．02μg／ml、0．2μg／ml、1μg／ml、2μg／ml、5μg／ml处理细胞后，Casepase-3活性分别降低了2．3、5．5、8．7、12．6、18．8倍。RT—PCR检测结果显示，随着强力霉素浓度的增加，HIF-1α表达水平增加，Survivin和Bcl-2基因表达强度逐渐增加，差异有统计学意义（P〈0．001）。结论HIF-1α基因在体外可以抑制肝癌细胞凋亡，而且随着HIF-1α表达水平的增加，对肝癌细胞的凋亡抑制作用进一步加强，可能与HIF-1α诱导survivin和Bcl-2的表达及抑制casepase-3的活性有关。     

缺氧诱导对人结肠癌SW480细胞缺氧诱导因子-1α和Survivin基因表达的影响

目的 构建缺氧诱导模型和观察缺氧对人结肠癌SW480细胞系缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）和Survivin基因表达的影响。方法 利用氯化钴（CoCl2）构建缺氧诱导模型；利用逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）分别测定CoCl2缺氧诱导与SW480细胞HIF—1α和Survivin基因mRNA表达的时效关系（0、2、4、8、24h）和量效关系（0、50、100、150、200／μmol／L）。结果HIF-1α和Survivin基因mRNA表达与氯化钴浓度呈明显的剂量依赖关系；HIF-1α基因表达随诱导时间的延长而逐渐增强，4h亚组出现一个表达高峰，Survivin基因在缺氧诱导4h呈现表达最高峰；HIF-1α与survivin基因mRNA的表达在缺氧诱导量效关系（r=0．521，P＜0．05）和时效关系（r=0．693，P＜0．05）中均呈显著正相关。结论 缺氧可以诱导HIF—1α和Survivin基因的表达增加；HIF—1α与Survivin基因的表达均呈显著相关，提示Survivin基因可能与HIF—1α存在某种调控关系并在缺氧抗凋亡机制中发挥作用。     

蛋白酶体抑制剂Velcade诱导肝癌细胞HepG2凋亡

目的探讨蛋白酶体抑制剂Vekade诱导人肝癌细胞株HepG2凋亡的作用和机制。方法以不同浓度Velcade处理HepG2细胞24h和48h。四甲基偶氮唑蓝比色法评价细胞生长情况；流式细胞术检测细胞凋亡；Westernblot测定caspase3改变；RT—PCR检测Bcl-2家族、CyclinA和CyclinDmRNA的表达。结果不同Velcade浓度（32、64、128、256、512nmol／L）处理HepG2细胞48h后，细胞活性较对照组明显减少（分别是91．4％±2．1％、75．0％±3．7％、57．3％±1．6％、52．7％±1．6％和31．4％±2．6％），与对照组（100．0％±1．7％）比较具有显著性差异（P〈0．05）。128nmol／L的Velcade处理HepG2细胞，48h流式细胞仪检测结果显示SubGl细胞百分数明显升高，SubGl细胞百分数（27．3％±5．3％），与对照组（4．3％±0．5％）差别显著（P〈0.05），同时，Pro—caspase3明显下降；但Velcade对Bcl-2家族表达无明显影响；Velcade诱导HepG2细胞G2／M阻滞，抑制CyclinA和CyclinD表达。结论Velcade诱导肝癌细胞凋亡不通过改变Bcl-2家族表达，可能存在其它途径；Velcade诱导肝癌细胞G2／M周期阻滞与调节通过下调CyclinA和CyclinD表达相关。     

Tet-on基因表达系统调控HIF-1α表达对肝癌细胞增殖的影响

目的 探讨HIF-1α表达对肝癌细胞增殖和细胞周期的影响.方法 利用Tet-on基因表达系统调控肝癌细胞系HepG2中HIF-1α的表达,检测细胞周期和细胞增殖的变化.结果 酶切和DNA测序证实Tet-on基因表达系统反应质粒PTRE-HIF-1α构建成功.获得了受强力霉素调控、稳定表达HIF-1α的肝癌细胞.随着强力霉素浓度增加,hiF-1α基因表达增加,HIF-1α在体外明显增加HepG2细胞增殖活性;G0/G1期细胞指数减少,细胞增殖指数增多.RT-PCR检测结果表明,随着HIF-1α基因表达增加,Cyclin A mRNA表达增加(P＜0.001),Cyclin D1和Cyclin E mRNA表达水平无明显变化(P＞0.05).结论 HIF-1α基因在体外可以通过HIF-1α表达水平的增加而促进肝癌细胞增殖活性,通过CyclinA表达增加缩短了肝癌细胞增殖周期.     

瘢痕疙瘩成纤维细胞培养中缺氧与缺氧诱导因子-1α表达的相关性

目的研究缺氧程度与瘢痕疙瘩中缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor,HIF－1α）基因表达的量化关系和关联性,进一步探讨缺氧通过HIF-1a途径促进异常瘢痕形成的机制。方法设立不同O2浓度组,在常氧及不同程度缺氧条件下培养瘢痕疙瘩成纤维细胞,应用Western印迹技术检测比较各组间HIF－1α基因蛋白的表达,进行数据处理和统计学分析。结果瘢痕疙瘩成纤维细胞在常氧（20％）、不同缺氧浓度（10％、5％、1％）下．HIF－1α蛋白表达相对含量（HIF－1α／β肌动蛋白）分别为0．007±0．006、0．133±0．006、0．537±0．015和0．903土0．021,表明缺氧系统中瘢痕疙瘩成纤维细胞HIF—1α蛋白表达明显上调。结论缺氧条件促进了瘢痕疙瘩中HIF-1α蛋白的表达,而且表达的量与缺氧程度呈正相关。缺氧通过HIF－1α基因途径与异常瘢痕的形成密切相关。     

常氧条件下调控表达缺氧诱导因子1α对肝癌细胞增殖和侵袭能力的影响

目的探讨在体外常氧条件下,诱导表达缺氧诱导因子1d（HIF-1α）对肝癌细胞（HepG2）增殖及侵袭能力的影响。方法利用Tet—on基因调控系统构建能诱导表达HIF-1α的HepG2^Tet-on-HIF-1α“细胞系;常氧条件下,噻唑兰法检测HIF-1α对细胞增殖、黏附能力的影响,Transwell法检测其对HepG2细胞侵袭能力的影响。结果常氧条件下,强力霉素（1μg／m1）可诱导HepG2^Tet-on-HIF-1α“细胞HIF-1αmRNA和蛋白表达增加;增殖实验中,Dox（＋）组与Dox（一）组各时段吸光度A490nm值无差异（P〉0．05）;黏附实验中,Dox（＋）组的A490nm值明显高于Dox（-）组（P=0．008）;Dox（＋）组侵袭细胞数[（37．6114-8．424）个]明显高于Dox（-）组[（25．3334-8．117）个]（P〈0．01）。结论Tet—on基因调控系统可上调HIF-1α mRNA的转录并增加其蛋白的表达;常氧条件下,HIF-1α不影响HepG2细胞的增殖,但明显增加其黏附和侵袭能力。     

沉默缺氧诱导因子-1α对肝癌细胞化疗敏感性影响及相关机理的研究

目的观察应用短发夹RNA（shRNA）沉默缺氧诱导因子（HIF）-1α对肝癌细胞化疗敏感性的影响并探讨其相关机理。方法脂质体包裹HIF-1ashRNA表达载体（pshRNA-HIF-1α）转染到肝癌细胞HepG2细胞中，G418筛选，建立稳定的HIF-1α沉默的细胞系，并以转染空白质粒（pHK）作对照。逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）检测沉默HIF-1α后HIF-1amRNA和多药耐药基因1（mdrl）mRNA变化；免疫印迹（Western blot）检测细胞HIF-1α及P-糖蛋白（Dgp）的变化。CoCl2模拟缺氧环境下，MTT和流式细胞术检测不同剂量的化疗药物（阿霉素）在HIF-1α沉默后对细胞生长抑制率和凋亡率的影响。结果pshRNA—HIF-1α转染细胞后HIF-1α干扰率在mRNA水平和蛋白水平分别为82．18％和75．51％。沉默HIF-1α后细胞mdrl mRNA和P-gp表达显著降低（P〈0．05），生长抑制率和凋亡率明显增高（P〈0．05）。结论shRNA沉默HepG2细胞HIF-1α可以通过下调mdrlmRNA和Dgp表达逆转肝癌化疗耐药，增强肝癌细胞对化疗的敏感性；可通过沉默HIF-1α作为肝癌基因治疗的一种新途径。     

基因沉默缺氧诱导因子-1α对BxPC-3细胞株糖酵解基因表达的影响

目的 观察沉默缺氧诱导因子(HIF)-1α基因表达对于缺氧微环境下人胰腺癌BxPC-3细胞株中糖酵解相关基因表达的影响.方法 通过合成小于扰RNA((siRNA))转染沉默BxPC-3细胞株中HIF-1α基因表达.将细胞分为空白对照组(BxPC-3)、空白质粒转染对照组(GFP)和HIF-1α基因沉默组(sh-HIF-1α),分别在正常环境(21.0％O2)和缺氧环境(0.5％～1.0％ O2)中培养48 h后,检测各组细胞中糖酵解相关基因[如丙酮酸激酶1(PDK-1)、乳酸脱氢酶A(LDH-A)和柠檬酸合成酶(CS)]的表达以及细胞糖酵解产物乳酸含量的改变.结果 与正常环境比较,缺氧培养后sh-HIF-1α组细胞内HIF-1αmRNA增加了12.4％,蛋白增加了1.6倍,显著低于BxPC-3组和GFP组(P＜0.05),PDK-1和LDH-A的表达也明显低于两个对照组(P＜0.05).相应的sh-HIF-1α组的乳酸含量为(4.8 ±0.3)nmol/106个细胞,明显低于BxPC-3组(9.1±0.5)nmol/106个细胞和GFP组(9.2±0.5) nmol/106个细胞(P＜0.05).相反,缺氧时BxPC-3组和GFP组细胞中与线粒体氧化磷酸化相关的CS基因表达明显下降,低于其在sh-HIF-1α组细胞中的表达(P＜0.05).结论 缺氧可以诱导BxPC-3细胞株中HIF-1α基因高表达并促进糖酵解相关的PDK-1和LDH-A等基因表达.而通过沉默HIF-1α基因,可以抑制上述基因的表达,并促进CS基因表达,从而抑制肿瘤细胞的糖酵解代谢.     

缺氧诱导因子-1α对HepG2细胞生长的影响及其初步机制

目的观察缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)对HepG2细胞生长及凋亡相关蛋白的影响,并探讨其意义。方法将H1F-1α转染入人肝癌细胞HepG2中,观察HepG2细胞生长。建立人肝癌裸鼠模型,随机将其分为两组：对照组(A组,10只),HIF-1α转染细胞组(B组,10只)。1个月后,切除瘤灶、称瘤重、计算促瘤率。标本用Western blot检测HIF-1α、凋亡相关蛋白Survivin、bcl-2和Caspase-3的表达。结果HIF-1α转染HepG2细胞后,细胞生长速率加快。转染HIF-α的裸鼠肿瘤生长较对照组快,A组、B组的瘤重分别为(3．51±0．33)、(4．64±0．40)g,促瘤率为32%。B组HIF-1α、Survivin和bcl-2的蛋白水平明显高于A组,但Caspase-3的水平则低于A组。结论转染HIF-1α体内、外均可促进肝癌HepG2细胞的生长,其机制除促进血管生成外,还可能与其能抑制凋亡有关。     

二甲基乙二酰基甘氨酸对缺氧复氧诱导的肾小管上皮细胞损伤的保护作用及其机制

目的 通过脯氨酸羟化酶抑制剂二甲基乙二酰基甘氨酸（DMOG）稳定缺氧诱导因子1α（HIF-1α）表达,探讨其对缺氧复氧诱导的肾小管上皮细胞（HKC）损伤的保护作用及其机制。 方法 制作无糖缺氧复氧细胞损伤模型,用不同浓度的DMOG预处理,锥虫蓝染色和乳酸脱氢酶（LDH）活性方法检测细胞活力及损伤;Annexin V和PI染色流式细胞仪技术检测细胞凋亡;实时荧光定量PCR方法检测红细胞生成素（EPO）、热休克蛋白70（HSP70）和血红素氧合酶1（HO-1） mRNA的表达;Western印迹法检测HIF-1α、活性caspase-3和Bcl-2蛋白表达。 结果 正常情况下HKC细胞内几乎无HIF-1α蛋白表达,DMOG刺激6 h后HIF-1α蛋白及其靶基因EPO、HSP70和HO-1 mRNA表达均显著上调（均P ＜ 0.01）,且呈浓度依赖性。500 μmol/L或1 mmol/L DMOG预处理可明显改善缺氧复氧诱导的细胞损伤,表现为细胞存活率升高（95.6%±1.8%、96.1%±1.0%比 83.3%±3.1%）;培养上清液中LDH 活性下降;细胞凋亡减少（8.6%±2.7%、6.1%±2.3%比19.2%±4.0%）（均P ＜ 0.05）。另外,细胞内活性caspase-3蛋白表达显著下调,而Bcl-2蛋白表达则显著上调（均P ＜ 0.05）。 结论 DMOG预处理可稳定肾小管上皮细胞内HIF-1α表达,对缺氧复氧诱导的肾小管上皮细胞损伤具有一定保护作用。其机制可能与促进EPO、HSP70和HO-1表达,抑制caspase-3活化,上调Bcl-2表达有关。     

Omi/HtrA2预测肝细胞癌预后中的作用及其与缺氧诱导因子-1α的相关性

目的 探讨Omi/HtrA2的表达水平在预测肝细胞癌预后中的作用及其与缺氧诱导因子(HIF)-1α的相关性.方法 采用免疫组化法检测43例原发肝癌组织标本中Omi/HtrA2和HIF-1α的表达水平,并结合随访资料进行分析.将重组质粒pTRE-HIF-1α转染到HepG2Tet-on细胞,以含0、0.02、0.20、1.00、2.00、5.00 mg/L浓度强力霉素的培养液体外培养已转染pTRE-HIF-1α的HepG2Tet-on细胞,应用RT-PCR法检测不同表达水平HIF-1α对Omi/HtrA2表达的影响.结果 Omi/HtrA2表达与肝细胞癌肝门淋巴结转移和术后2年内肝内复发相关.Omi/HtrA2表达阳性患者肝癌切除术后1、2、3、4、5年累积生存率明显高于Omi/HtrA2表达阴性患者(x2=6.13,P=0.013).HIF-1α和Omi/HtrA2在免疫组化染色的同一切片中,HIF-1 α表达阴性或者弱阳性标本中Omi/HtrA2多表达为阳性或强阳性,HIF-1α表达阳性或者强阳性标本中Omi/HtrA2多表达为阴性或弱阳性.RT-PCR方法检测结果显示,随着HIF-1α表达水平的增加,Omi/HtrA2基因的表达强度逐渐降低(F=106.766,P＜0.01).结论 Omi/HtrA2可能成为预测肝细胞癌预后的一个重要分子标记.肝癌组织中Omi/HtrA2与HIF -1α表达水平呈负相关,在Omi/HtrA2参与肝癌细胞凋亡过程中,HIF-1α可能参与调控了Omi/HtrA2的表达.     

缺氧应激对HepG2细胞中甲硫氨酸腺苷转移酶2A基因表达的影响

目的 观察体外缺氧条件下肝癌细胞株HepG2中缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)和甲硫氨酸腺苷转移酶2A(MAT2A)的表达,探讨HIF-1α在低氧条件下对MAT2A基因表达的调控作用.方法 构建人MAT2A启动子真核表达载体质粒,CoCl2化学模拟肿瘤缺氧环境,检测缺氧条件下MAT2A启动子活性,HIF-1α和MAT2A在HepG细胞中的共定位、mRNA和蛋白水平的表达.以及小干扰RNA(siRNA)沉默HIF-1α后对MAT2A基因表达的影响.结果　缺氧24 h能使HepG2细胞活性增加到高峰(41.26±2.34),同时MAT2A基因的表达也较常氧时显著升高(P＜0.01),siRNA转染HepG2细胞后能显著下调HIF-1α蛋白表达(抑制率90%),并导致MAT2A基因的表达也受到明显抑制.结论　缺氧促使HepG2细胞中HIF-1α在蛋白水平表达升高,缺氧时HIF-1α能上调MAT2A基因的表达水平.

Abstract：

Objective To observe the expression of hypoixa inducible factor-1α (HIF-α) and methionine adenosyltransferase-2A (MAT2A) gene in HepG2 cells under hypoxia in vitro, and explore the regulation of MAT2A gene expression by HIF-1α. Methods Human MAT2A promoter eukaryotic expression vector was constructed. CoCl2 was used as a chemical hypoxia-inducible reagent to mimic tumor bypoxic microenvironment. MAT2A promoter activity, and mRNA and protein expression of HIF-α were detected in the HepG2 cells transfected with RNA interference (RNAi) originated by small interfering RNA (siRNA). The change of MAT2A gene expression was observed after HIF-1α gene silencing. Results Under hypoxia for 24 h, HepG2 cell activity was increased to (41.26 ± 2. 34 ), and the mRNA and protein expression levels of MAT2A were up-regulated (P ＜0. 01 ). After siRNA targeting, the HIF-1α was downregulated efficiently in HepG2 cells (inhibition ratio: 90% ), and MAT2A gene was down-regulated as well. Conclusion Hypoxia can increase protein level of HIF-1α in HepG2 cells, and HIF-1α up-regulates the gene expression of MAT2A.     

缺氧诱导因子1α在肝癌细胞上皮-间充质化中的作用

目的:探讨缺氧诱导因子1 α(HIF-1 α)在肝癌上皮-间充质化(EMT)中的作用.方法:采用可调控HIF-1 α表达的肝癌HepG2Tet-on-HIF-1α细胞系,首先用real-time PCR与Western blot方法检测低氧环境中HepG2Tet-on-HIF-1α细胞EMT相关分子(E-cadherin,vimentin,FSP-1)及HIF-1 α的mRNA和蛋白表达水平,然后在常氧环境下,采用强力霉素(Dox)诱导HepG2Tet-on-HIF-1α细胞HIF-1 α过表达,以及HepG2Tet-on-HIF-1α细胞经Dox处理后再转染HIF-1αsiRNA,观察上述分子的表达情况.结果:低氧处理后,HepG2Tet-on-HIF-1α细胞EMT相关分子及HIF-1 α的mRNA和蛋白表达水平较常氧状态下均明显增加(均P＜0.05);常氧环境下,Dox能诱导HepG2Tet-on-HIF-1α细胞HIF-1 α过表达,同时明显增加EMT相关分子的mRNA和蛋白表达水平(均P＜0.05),但转染HIF-1αsiRNA后,Dox的诱导作用被取消.结论:HIF-1α促进HepG2细胞EMT,并可能是肝癌基因治疗的有效靶点.     

缺氧诱导因子1α表达对裸鼠肝癌皮下移植瘤生长的促进作用

目的 探讨缺氧诱导因子1α表达对肝癌移植瘤生长的影响.方法 建立强力霉素诱导缺氧诱导因子1α表达的裸鼠肝癌HepG2 Tet-on-HIF-1α 细胞皮下移植瘤模型;荷瘤裸鼠口服强力霉素(Dox)后,观察上调缺氧诱导因子1α对皮下移植瘤生长的影响.结果 荷瘤裸鼠口服强力霉素可以上调裸鼠皮下移植瘤中缺氧诱导因子1α mRNA和蛋白表达水平;肿瘤体积Dox(+)组vs.Dox(-)组为(513.545±276.229)mm 3 vs.(166.506±110.142)mm 3 (P<0.05),肿瘤重量(1.251±0.438)g vs.(0.640±0.296)g(P<0.05),肿瘤生长速度Dox(+)组明显超过Dox(-)组,肿瘤内面积坏死率明显小于Dox(-)组(31.360%±2.728%)vs.(36.640±3.804%)(P<0.05);同Dox(-)组相比,Dox(+)组裸鼠体重下降更为明显(P<0.01).两组荷瘤鼠均无肝、肺转移发生.结论 强力霉素可以诱导裸鼠肝癌HepG2 Tet-on-HIF-1α 细胞皮下移植瘤模型中缺氧诱导因子1α的表达,促进肿瘤的生长.     

缺氧诱导因子1α依赖性缺氧诱导人肝癌细胞多药耐药相关基因的表达及意义

目的探讨缺氧环境下人肝癌细胞中多药耐药相关基因和缺氧诱导因子1α(HIF1α)的表达和意义,从而部分阐明肝细胞癌发生多药耐药的机制,为逆转肝癌耐药提供新的分子靶点。方法将人肝癌细胞系HepG2细胞分别行不同时间低氧培养和转染HIF1α/PCDNA3质粒;应用荧光定量聚合酶链反应技术和蛋白免疫印迹技术分别检测每组HepG2细胞中多药耐药相关基因(mdr1)、多药耐药相关蛋白1(MRP1)和肺耐药相关蛋白(LRP)在mRNA和蛋白水平的表达。结果在缺氧组,随着缺氧时间的延长HepG2细胞中多药耐药相关基因mdr1、MRP1和LRP的表达均逐渐增高,且以MRP1变化更为显著;而且这些多药耐药相关基因的表达升高与缺氧诱导因子1α的表达呈同步化改变。在HIF1α/PCDNA3质粒转染细胞中这些多药耐药相关基因的表达亦明显升高。结论缺氧可通过核转录因子HIF1α上调肝癌细胞内mdr1,LRP、MRP1等多药耐药相关基因的表达,从而使肝细胞癌获得多药耐药性。生长局部微环境的缺氧是诱导肝癌产生多药耐药性的重要原因之一。核转录因子HIF1α和这些多药耐药相关基因将可能成为逆转肝癌耐药的新的分子靶点。     

缺氧及沉默缺氧诱导因子-1α对BxPC-3细胞中RUNX3基因表达的影响

目的 观察缺氧及应用小干扰RNA (siRNA)沉默缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因对胰腺癌细胞株BxPC-3中RUNX3基因表达的影响.方法 构建人RUNX3基因真核表达载体质粒pEGFP-RUNX3,CoC12化学模拟肿瘤缺氧环境,检测缺氧以及siRNA沉默HIF-1α对BxPC-3细胞中RUNX3基因在mRNA和蛋白水平的影响.结果 缺氧能使BxPC-3细胞中RUNX3基因的表达较常氧时显著升高[表达为(9.13±1.55),P＜0.05],siRNA转染BxPC-3细胞后能显著下调HIF-1α蛋白表达(抑制率90％),并导致RUNX3基因的表达也受到明显抑制.结论 缺氧促使BxPC-3细胞中HIF-1α在蛋白水平表达升高,缺氧时HIF-1α能上调RUNX3基因的表达水平.     

缺氧诱导乳鼠脊髓神经元HIF-1α表达和凋亡的体外实验研究

目的 研究缺氧诱导脊髓神经元低氧诱导因子-1α（HIF-1α）表达和凋亡的变化，探讨HIF-1α在耐受缺氧和诱导凋亡机制中的作用。方法 以体外培养的乳鼠脊髓神经元细胞为研究对象。采用激光共聚焦显微镜（LCSM）、DNA琼脂糖凝胶电泳观察缺氧诱导脊髓神经元凋亡的变化；免疫组化检测HIF-1α在缺氧脊髓神经元中的表达；流式细胞术（FCM）检测缺氧对脊髓神经元P53、bcl-2蛋白水平表达的影响。结果 持续缺氧显著抑制脊髓神经元细胞的生长；荧光显微镜下可见脊髓神经元细胞呈典型凋亡的形态学改变。脊髓神经元缺氧2、4h时HIF-1α、P53、bcl-2表达上调（P〈0．01），8h时其表达下调（P〈0．05）。结论 缺氧诱导的HIF-1α的表达，在脊髓神经元的耐受缺氧和诱导凋亡机制中起着重要的作用。     

微环境诱导肝细胞癌多药耐药的形成及机制

目的探讨微环境在肝癌多药耐药（MDR）表型形成中的作用，并初探其作用机制，为逆转肝癌耐药提供有效的新的分子靶点。方法模拟肝癌体内生长的局部微环境，使HepG2细胞分别在缺氧、低糖的微环境下生长或稳定整合HBX基因。应用荧光定量聚合酶链反应（PCR）技术和Westernblot技术分别检测这些局部微环境因素作用下的HepG2细胞内多药耐药相关基因mdr1、肺耐药相关蛋白基因（LRP）、多药耐药相关蛋白基因（MRP1）和缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）的mRNA和蛋白水平的表达。同时运用免疫细胞化学技术检测肝癌耐药细胞株中HIF-1α蛋白的表达。以及检测转染了HIF-1α质粒的HepG2细胞中上述相关多药耐药基因的表达。结果在缺氧、低糖环境下生长或稳定整合了HBX基因的HepG2细胞均不同程度地高表达多药耐药相关基因和HIF-1α；在肝癌耐药细胞株中HIF-1α蛋白高表达；稳定转染了HIF-1α质粒的HepG2细胞显著高表达多药耐药相关基因。结论肝癌生长的微环境可通过核转录因子HIF-1α调控多药耐药相关基因的表达。从而诱导肝癌多药耐药表型的形成；HIF-1α有望成为逆转肝癌耐药的新的分子靶点。     

急性低氧和低氧习服影响HepG2细胞内红细胞生成素基因的表达

目的　观察急性低氧和低氧习服影响人HepG2细胞内红细胞生成素 (EPO) ,低氧诱导因子 1α(HIF 1α)和肝细胞核因子 4(HNF 4)基因表达。方法　HepG2细胞在 1%O2 下培养 2 4h后 ,2 1%O2 下培养 2 4h ,以此为 1个周期 ,连续低氧训练 6个周期 ,细胞达到低氧习服状态后 ,用Northern杂交方法检测EPO、HIF 1α和HNF 4基因表达。结果　HepG2细胞在急性低氧条件下培养48h后 ,胞内EPO、HIF 1α和HNF 4基因表达升高 ,mRNA含量分别升至常氧对照细胞的 4.3、2 .3、1.2倍 ;在低氧训练过程中 ,HepG2细胞内EPO、HIF 1α和HNF 4基因的mRNA含量逐渐下降 ;细胞达到低氧习服后 ,再急性低氧 48h ,EPO基因表达水平接近常氧对照组 ,HIF 1α和HNF 4的mRNA含量分别为常氧对照组的 81.4%和 12 2 .4%。结论　HepG2细胞达到低氧习服后 ,急性低氧对EPO基因表达的诱导作用减弱甚至受到抑制。与HNF 4相比 ,HIF 1α在急性低氧或低氧习服影响EPO基因表达中起着更为重要的作用。