肝癌细胞端粒酶激活的可能机制:乙型肝炎病毒X基因-端粒酶反转录酶途径

目的研究乙型肝炎病毒x基因(HBx)对肝癌细胞端粒酶活性及其催化亚单位端粒酶反转录酶(TERT)表达的影响,探讨肝癌细胞端粒酶激活的分子机制.方法分别应用端粒序列重复扩增法(TRAP)和定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测QGY7701肝癌细胞株(n=5)和转HBx基因肝癌细胞株QGY/HBx(n=5)的端粒酶活性及TERT mRNA表达.结果 HBx阳性的QGY/HBx肝癌细胞TERT基因表达水平1.54±0 14较HBx阴性的QGY7701肝癌细胞0.76±0.08明显增高(P＜0.01);与之对应,QGY/HBx细胞的端粒酶活性也显著高于QGY7701细胞[(4.28±2.81)×105比(2.43±1.46)×105,P＜0.05].结论 HBx基因可增强肝癌细胞端粒酶活性,上调TERT基因表达;HBx-TERT途径可能是肝癌细胞端粒酶端粒激活的一个重要机制.     

乙型肝炎病毒x蛋白对人肝癌细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨乙型肝炎病毒x蛋白 (hepatitisBvirusxprotein ,HBx)在体内外对人肝癌细胞增殖和凋亡的影响。方法将携带HBx基因的表达质粒 pHA HBx转染HepG2细胞 ,通过检测细胞生长曲线、倍增时间和3 H TdR掺入率观察HBx对细胞增殖活性的影响 ;将整合HBx基因的HepG2细胞接种裸鼠 ,建立表达HBx的人肝癌裸鼠模型 ,用阿霉素进行裸鼠腹腔化学药物治疗 ,观察肝癌组织的生长状况 ;用TUNEL方法检测切除的裸鼠癌标本中凋亡细胞的比例。结果转染HBx基因的HepG2细胞倍增时间为 2 8 5h ,对照组为 32 5h ;3 H TdR掺入率 :转染HBx基因组为 (10 2 1± 78)cpm ,对照组为 (85 9± 6 9)cpm ,转染组细胞明显高于对照组细胞 (t =2 5 4 ,P <0 0 1) ;转染HBx基因的细胞在裸鼠体内形成的癌重量为 (3 10± 0 39) g ,对照组癌重量为 (2 6 1± 0 2 8) g ,两组之间差异有显著意义 (t=2 0 3,P <0 0 5 ) ;裸鼠腹腔化学药物治疗后 ,转染组的癌细胞凋亡为 3 5±0 75 ,对照组为 2 2 5± 6 5 ,转染HBx基因的细胞凋亡明显减少 (χ2 =6 6 9,P <0 0 1)。结论HBx可以提高HepG2细胞的增殖活性 ,促进裸鼠体内肝癌生长 ,对阿霉素诱导的肝癌细胞凋亡具有抑制作用。     

NKG5SV基因导入对自然杀伤细胞杀伤肝癌细胞能力的影响及其机制研究

目的研究导入NKG5SV基因对NK细胞肝癌杀伤作用的影响及其机理.方法将NKG5SV和对照基因LacZ基因分别导入肝癌病人的NK细胞,K562细胞杀伤实验检测NK活性,MTT法检测不同NK细胞对肝癌细胞株和正常肝细胞株的杀伤,并进行形态学观察.DAPI荧光染色法和小片段DNA定量法检测和定量细胞凋亡.结果肝癌病人NK细胞、NK-LacZ细胞、NK-NKG5SV细胞,健康人NK细胞的NK活性(%)分别为5.96±0.38、6.03±0.42(P＞0.05)、27.67±0.18(P＜0.05)、30.33±0.83(P＜0.05).作用72?h后肝癌病人NK细胞、NK-LacZ细胞、NK-NKG5SV细胞对SMMC-7721肝癌细胞株的杀伤活性(%)分别为45±5,46±9(P＞0.05)、69±4(P＜0.01).SMMC-7721细胞的凋亡细胞数(个/高倍视野)和凋亡DNA量(μg/板)分别为1.5±0.3、1.4±0.5(P＞0.05)、1.9±0.6(P＞0.05),70±10、72±9(P＞0.05)、76±10(P＞0.05).结论NKG5SV基因导入肝癌病人的NK细胞通过增加其细胞溶解作用而提高其肿瘤杀伤能力.     

野生型和突变型RASSF1A基因对人肝癌细胞生长的影响

目的　探讨野生型 /突变型RASSF1A基因的表达对人肝癌细胞株QGY 770 3在体内外生长的影响。方法　构建突变型RASSF1A基因的真核表达载体 ,通过脂质体介导的基因转染法将野生型 /突变型RASSF1A基因的真核表达载体及空载体转染肝癌细胞株QGY 770 3 ,G418筛选稳定表达株 ,并以逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)和Westernblot进行鉴定。通过细胞生长曲线、软琼脂集落形成试验和裸鼠致瘤性试验对各稳定表达株的生物学行为进行检测。结果　成功建立稳定表达野生型和突变型RASSF1A基因的肝癌细胞株。以转染空载体的QGY 770 3细胞为对照 ,野生型RASSF1A基因的表达可明显抑制肝癌细胞在体外的生长 ,显著降低肝癌细胞在软琼脂中形成的克隆数目 (P <0 .0 1)和大小 ,显著减慢裸鼠皮下瘤的生长速度和重量 (P <0 .0 1)。突变型RASSF1A基因的表达对肝癌细胞的生长影响不大。结论　野生型RASSF1A的重表达有助于QGY 770 3恶性表型的逆转 ;野生型RASSF1A基因是一个肝癌相关的抑癌基因。     

生长激素受体在Bel-7402与QGY-7701人肝癌细胞株中的表达

目的了解Bel-7402与QGY-7701人肝癌细胞株生长激素受体(GHR)的表达情况,以获得肝癌GHR在细胞水平上的定量表达。方法分别采用放射性配体分析与RT鄄PCR法检测GHR在Bel鄄7402与QGY-7701肝癌细胞株的表达。结果7402肝癌细胞可表达GHRmRNA,在蛋白表达水平放射性配体法发现GHR在此肝癌细胞位点数量(Site,103/cell)为7.348±0.891,平衡解离常数为0.63±0.04583nmol/L;未发现7701肝癌细胞株表达GHR。结论7402肝癌细胞株表达GHR,可为将来研究rhGH与原发性肝癌的增殖关系奠定一些实验基础。     

乙型肝炎病毒X基因在体内外对肝癌细胞增殖活性的影响

目的 探讨乙型肝炎病毒x(HBx)基因对肝癌细胞增殖活性的影响。方法将携带HBx基因的表达质粒pHA-HBx转染HepG2肝癌细胞,G418筛选阳性细胞克隆,RT-PCR鉴定HBx基因的整合及表达;通过细胞计数,观察HBx基因对肝癌细胞生长曲线和倍增时间的影响;流式细胞术检测细胞周期的变化;^3H-TdR掺入法检测细胞增殖活性;裸鼠接种观察HBx基因在体内对肝癌细胞增殖的影响。结果HBx基因在体内外对HepG2细胞的增殖活性均有明显影响,细胞生长曲线左移,倍增时间缩短;G0／G1。期细胞减少,S期和G2／M期细胞增多;转染后的细胞^3H-TdR掺入率较对照组增高;转HBx基因的裸鼠移植瘤的生长速度较对照组细胞明显加快。结论HBx基因在体内外均可提高肝癌细胞的增殖活性,增加肝癌细胞的恶性表型,加速肿瘤生长。     

乙型肝炎病毒x蛋白促进裸鼠人肝癌模型的VEGF表达

目的探讨乙型肝炎病毒x蛋白(HBx)促进肝癌细胞增殖的作用机制。方法将编码HBx基因全长的表达质粒pHA-HBx转染肝癌HepG2细胞,用G418筛选阳性克隆;采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)鉴定HBx基因在HepG2细胞基因组的整合;分别用转染HBx基因前后的细胞建立肝癌裸鼠模型,观察两组裸鼠肿瘤组织生长增殖状况;采用免疫组织化学染色方法检测两组裸鼠肿瘤组织中VEGF的表达。结果 HBx基因成功整合入肝癌HepG2细胞基因组;转染HRx基因前后的两组HepG2细胞在裸鼠体内的接种成瘤率均为100％;转染HBx基因的肿瘤生长速度较未转染组明显加快;接种8周后,转染组肿瘤体积(2．86±0．34)cm3,未转染组为(2．48±0．22)cm3,两组间差异有统计学意义(t=1．905,P<0．05);转染组肿瘤组织中VEGF的表达较对照组明显增强(x2= 7．66,P<0．01)。结论 HBx可促进裸鼠肝癌组织VEGF表达,增加肝癌细胞的增殖活性,加速肿瘤组织生长。     

腺病毒介导的分化基因RA-538诱导肝癌细胞增殖抑制和凋亡的研究

目的研究携带分化基因RA-538的重组腺病毒(Ad-RA538)对人肝癌细胞的抑制作用及机制.方法Ad-RA538感染人肝癌细胞系BEL-7402和QSG-7701,绘制生长曲线,克隆形成实验评价Ad-RA538对肝癌细胞增殖的抑制作用,应用流式细胞术、DNA原位末端标记、梯形DNA研究细胞周期及细胞凋亡情况,逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和免疫印迹法(Western blot)检测相关基因的表达.结果感染Ad-RA538后,RA538在肝癌细胞内获得了表达,并且降低了c-myc的表达.肿瘤细胞的增殖受到明显抑制,感染Ad-RA538 5 d后,BEL-7402的活细胞数为(10.0±3.7)×104,对照组为(172.7±11.9)×104(P＜0.001);QSG-7701感染Ad-RA538 3 d后的活细胞数为(23.0±4.3)×104,对照组为(91.7±7.2)×104(P＜0.001);感染Ad-RA538后BEL-7402和QSG-7701形成的克隆数分别为13±4和15±2,明显少于对照组的188±9和175±9(P＜0.001),而且还出现了细胞周期的阻滞和凋亡.结论Ad-RA538对肝癌细胞具有明显的抑制作用,是有前途的抗肿瘤基因药物.     

野生型p53基因对不同内源性p53状态的肝癌细胞株生长的影响

目的探讨外源性野生型p53(wild-type p53,WT-p53)基因对具有不同内源性p53功能状态肝癌细胞生长的影响.方法通过表达WT-p53的重组腺病毒载体(Ad-p53),将p53基因导入具有不同内源性p53功能状态的肝癌细胞株Bel-7402、QGY-7701和PLC/PRF/5中,用MTT法检测Ad-p53对各细胞株生长的影响,流式细胞仪分析各组细胞中DNA含量及凋亡的比例.结果当取40、200、800 MOI值的表达p53的腺病毒分别转染PLC/PRF/5、Bel-7402和QGY-7701细胞时,72 h后行MTT检测,OD值分别为在 PLC/PRF/5细胞,空载体(Ad-LacZ)组0.98±0.16,Ad-p53组0.02±0.00(P＜0.01);在Bel-7402细胞Ad-LacZ组1.04±0.23,Ad-p53组0.10±0.02(P＜0.01);而在QGY-7701细胞Ad-LacZ组1.88±0.24,Ad-p53组1.86±0.19(P>0.05).细胞周期分析显示,在PLC/PRF/5,表现为既诱导细胞凋亡,又诱导细胞周期阻滞.在Bel-7402,表现为诱导细胞周期阻滞.结论外源性p53对肝癌细胞生长的抑制可能与内源性p53功能状态无关.     

沉默乙型肝炎病毒编码X蛋白基因表达增强索拉非尼促人肝癌细胞株PLC的凋亡

目的 探讨沉默乙型肝炎病毒编码X蛋白(HBx)基因后对索拉非尼促人肝癌细胞株PLC凋亡的影响及其机制.方法 应用小干扰RNA(siRNA)方法沉默HBx基因,应用实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测HBx mRNA表达水平,流式细胞技术检测细胞凋亡,Real-time PCR基因芯片检测HBx-siRNA转染后索拉非尼作用肝癌敏感细胞株PLC丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路基因的表达.结果 HBx特异的siRNA作用后,HBx mRNA表达水平为0.61,与其他对照组比较显著下调(P＜0.05).索拉非尼作用HBx-siRNA干扰后PLC细胞株凋亡表达率为43％,显著高于其他对照组(P＜0.05).索拉非尼作用PLC细胞后,与对照组比较,实验组MAPK信号通路中有13个差异表达基因,其中＞2.0倍的有2个,≤0.5倍的有11个.用siRNA干扰去除HBx基因的影响,经索拉非尼作用PLC细胞后,与对照组比较,实验组MAPK信号通路中有37个差异表达基因,其中＞2.0倍的有1个,≤0.5倍的36个.结论 沉默HBx基因增强了索拉非尼促人肝癌细胞株PLC的凋亡作用,可能是沉默HBx基因表达后,扩大和增强了索拉非尼对MAPK信号通路基因的抑制作用.     

外科性黄疸对T细胞和NK细胞活性的影响

目的　探讨黄疸对外周血T细胞和自然杀伤 (NK)细胞的活性的影响。方法　通过应用CD系列单克隆抗体对 2 0例术前黄疸患者外周血T细胞和NK细胞的活性进行检测 ,观察免疫功能改变。结果　良性黄疸组CD3 (65 .0 9± 6.5 2 )、CD4(4 0 .5 8± 5 .82 )及NK(16.62± 6.91)细胞活性与对照组相比下降明显 (P <0 .0 5 ) ;CD8(3 5 .40± 6.0 7)细胞活性上升 (P <0 .0 5 )。恶性黄疸组CD3 (62 .44± 7.2 8)、CD4(3 0 .0 1± 6.89)及NK(16.2 3± 7.0 2 )细胞活性同样下降明显 (P <0 .0 5 ) ;且良恶性黄疸组CD4(3 0 .0 1± 6.89)细胞活性比较有显著性意义 (P <0 .0 5 )。而黄疸持续时间仅对CD4(分别为 2 3 .43± 3 .70 ,3 0 .0 1± 6.89)有影响。结论　良恶性黄疸能降低T淋巴细胞和NK细胞的活性 ,对机体免疫功能产生一定的影响。     

阻断转化生长因子β1自分泌环对骨肉瘤细胞恶性表型的影响

[目的]观察阻断转化生长因子β1(TGFβ1)自分泌环对骨肉瘤细胞恶性表型的影响。[方法]将反义TGFβ1基因转染骨肉瘤细胞MG-63,G418筛选14d后获得转染细胞系MG-TGFβ1(-)。取MTT法检测转染细胞增殖活性,并观察细胞软琼脂克隆形成数和裸鼠体内致瘤能力。[结果]与MG-63和空载体转染细胞MG-pcDNA3相比,MG-TGFβ1(-)细胞增殖活性明显受到抑制。MG-TGFβ1(-)的软琼脂克隆形成数(28·2±5·6)比MG-63组(48·6±8·1)和MG-pcDNA3组(45·2±4·7)明显减少,裸鼠体内形成肿瘤的体积(83·4±27·4)mm3也明显小于MG-63组(191·3±21·5)mm3和MG-pcDNA3组(204·2±30·7)mm3。[结论]反义TGFβ1基因转染骨肉瘤细胞可以逆转肿瘤细胞的恶性表型,进一步的研究将有助于提高骨肉瘤的治疗效果。     

放射线敏感性自杀基因的构建及其在肝癌细胞中的表达

目的　利用可被放射线激活而转录的早期生长反应基因 1 (Egr 1 )启动子驱动单纯疱疹病毒胸苷激酶基因 (tk)在肝癌细胞中高效表达。方法　构建以Egr 1为启动子 ,以tk为目的基因的重组质粒 pET ,经脂质体介导转染人肝癌细胞株SMMC 772 1 ,经G41 8抗性筛选、分别以 0、5、7.5、1 0、1 5、2 0Gy剂量γ射线照射、逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)半定量分析、比较tk基因的mRNA表达。结果　转染后的肝癌细胞株经射线照射后其tkmRNA的表达较未照射组 (55 .2±7.2 )有明显提高 ,以 1 5Gy最为显著 (1 1 7.2± 1 1 .1 ,P <0 .0 0 1 )。结论　经γ射线照射后 ,可被放射线转录激活的Egr 1启动子可引起tk基因在肝癌细胞中高效表达 ,从而为肝癌的基因 放射治疗的实验研究打下坚实的基础     

丙型肝炎病毒蛋白对肝细胞RASSF2 mRNA表达的影响及其机制

目的:探讨丙型肝炎病毒(HCV)蛋白NS3、Core、NS5A对肝细胞RASSF2 mRNA表达及RASSF2A启动子甲基化的状态的影响。方法:用RT-PCR检测分别转染NS3、Core、NS5A表达质粒的肝QSG7701细胞(NS3/QSG7701、Core/QSG7701、NS5A/QSG7701)以及正常肝细胞L02中RASSF2 mRNA的表达;用甲基化特异性PCR检测NS3/QSG7701、Core/QSG7701及NS5A/QSG7701细胞中RASSF2A启动子甲基化的状态,以及去甲基化药物5-aza-d C处理后,各细胞RASSF2 mRNA表达情况与生物学行为的变化。结果:与正常肝细胞L02比较,NS3/QSG7701、Core/QSG7701、NS5A/QSG7701细胞中RASSF2 mRNA的表达均明显降低(均P0.05);3种细胞的RASSF2A启动子均发生完全甲基化。经5-aza-d C处理后,RASSF2 mRNA的表达在NS3/QSG7701和Core/QSG7701细胞中明显上调(均P0.05),但在NS5A/QSG7701细胞中无明显变化(P0.05);NS3/QSG7701和Core/QSG770细胞经5-aza-d C处理后,增殖率下降、凋亡率增加(均P0.05)。结论:NS3、Core、NS5A能通过RASSF2A启动子甲基化,且NS5A还通过其他机制降低RASSF2表达,该作用可能参与了HCV相关肝细胞癌的发生。     

ABCG2在人肝癌细胞株中的表达及其相关功能

目的探讨干细胞标志物三磷酸腺苷结合盒超家族G家族第2个成员(ATP-binding cassette super-family G member 2,ABCG2)在人肝癌细胞株中的表达及其与肝癌耐药的关系,观察人肝癌细胞株中ABCG2阳性表达和阴性表达细胞的功能差异。方法流式细胞仪检测ABCG2在人肝癌细胞株PLC/PRF/5、7402、7701及7721中的阳性表达,计算5-氟尿嘧啶(5-FU)、阿霉素的半数抑制浓度(IC50)值。采用免疫荧光染色观察ABCG2在肝癌7721细胞株中的表达,并进行无菌流式分选,观察ABCG2阳性表达与ABCG2阴性表达的肝癌7721细胞的功能差异。结果在4种肝癌细胞株中7721细胞株ABCG2表达阳性率最高(P<0.05),且流式细胞图中阳性表达和阴性表达细胞呈明显双峰。5-FU、阿霉素对7721细胞株的IC50值明显高于其他3种细胞株,除与5-FU对7701细胞的IC50值差异无统计学意义(P>0.05)外,其余比较差异均有统计学意义(P<0.05)。分选后的ABCG2阳性表达细胞与阴性表达细胞的增殖差异无统计学意义(P>0.05);ABCG2阳性表达细胞较阴性表达细胞更多处于相对静止期(P<0.05)。结论 ABCG2在人多种肝癌细胞株中均表达,ABCG2表达阳性率越高的细胞较表达阳性率越低的细胞更具有耐药性,ABCG2阳性表达细胞处于相对静止期。     

经不同途径应用NK-NKG5-SV细胞防治肝细胞肝癌的研究

目的研究NKG5-SV导入肝癌病人NK细胞对其抗肝细胞肝癌作用的影响.方法Percoll不连续密度梯度离心法分离肝癌病人外周血NK细胞,以逆转录病毒为载体将NKG5-SV基因和报告基因LacZ导入NK细胞.将不同NK细胞与LCI-D20裸鼠人肝癌同时皮下接种或待LCI-D20肿瘤成瘤后瘤内注射,观察对肿瘤成瘤和生长的影响.术中经切缘或脾内注射不同的NK细胞,观察其对LCI-D20肝癌切除术后转移复发的影响.结果不同NK细胞与LCI-D20肝癌同时皮下接种NK-NKG5-SV细胞组成瘤率、肿瘤直径(cm)均低于NK-LacZ细胞组(P均小于0.01).肿瘤内注射不同NK细胞,NK-NKG5-SV细胞组的肿瘤生长明显低于NK-LacZ细胞组(P均小于0.05).肝癌切除术中应用NK细胞对照组、NK-LacZ细胞组、NK-NKG5-SV细胞组切缘复发瘤直径、肝内转移灶数目、转移灶累及肝叶数、转移灶累及腹内部位数分别为切缘注射1.51±0.47、0.86±0.49、00±1.76,2.40±1.80、0.80±0.54、0.40±1.18,01),2.60±0.70、1.40±0.54、1.0.50=0.19(P＜0.4.20=2.16、1.80±0.13、0.60±0.54(P＜0.05).脾内注射1.18±0.34、0.86±0.40、0.70±0.35,2.40=1.6 7、0.60±0.89(P＜0.05)、0.40±0.89(P＜0.05),2.2±1.09、0.4±0.54(P＜0.05)、0.2± 0.01(P＜0.01).4.60±1.14、1.20±1.70(P＜0.01)、0.80±1.09(P＜0.01).结论NK细胞具有抑制LCI-D20肝癌生长及防治肝癌切除术后转移复发的作用.NKG5-SV基因转染NK细胞后可提高NK细胞的抗肝癌作用.     

乙型肝炎病毒X蛋白对DNA甲基转移酶3A/3B表达的影响

目的观察乙型肝炎病毒X蛋白（HBx）对QSG7701细胞中DNA甲基转移酶（DNMT）3A/3B表达的影响。方法本研究室前期构建好的重组表达质粒pcDNA-X及空载体pcDNA3.0分别转染QSG7701细胞,经含G418的选择性培养基筛选获得稳定转染HBV-X基因的细胞克隆（pcDNA-X/QSG7701）及稳定转染空载体pcDNA3.0的细胞克隆（pcDNA3.0/QSG7701）。采用RT-PCR、Westernblot分别检测转染细胞中HBxmRNA和HBx蛋白的表达。Real-timePCR检测3种细胞DNMT3A/3BmRNA的表达情况。免疫组织化学法检测3种细胞DNMT3A/3B蛋白的表达情况。结果RT-PCR、Westernblot检测结果显示pcDNA-X/QSG7701细胞中有HBxmRNA及HBx蛋白的表达。Real-timePCR结果显示pcDNA-X/QSG7701中DNMT3A/3BmRNA表达水平显著高于pcDNA3.0/QSG7701及未转染的细胞QSG7701（P〈0.05）。免疫组织化学检测结果显示pcDNA-X/QSG7701细胞中DNMT3A/3B蛋白表达水平显著高于pcDNA3.0/QSG7701及QSG7701细胞（P〈0.05）。结论稳定转染HBV-X基因的人源性永生化非瘤性肝细胞QSG7701中DNMT3A/3BmRNA和蛋白的表达水平均显著升高,提示HBV-X基因在mRNA及蛋白水平能上调转染细胞中DNMT3A/3B的表达,而细胞中DNMT3A/3B表达的增加是否能进一步影响癌基因、抑癌基因的表达水平,从而导致细胞癌变,尚有待进一步研究。     

HBx基因大鼠卵圆细胞株的建立及鉴定

目的 构建带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的真核表达质粒pEGF-HBx,建市稳定、高效表达乙型肝炎病毒x基因(HBx)的大鼠卵圆细胞株,以便进一步研究HBx基因和卵圆细胞在肝癌发牛过程中的作用和机制.方法 用PCR方法从质粒pcDNA3.1-HBx中扩增含Kpn Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点的HBx基因序列.对增强型绿色荧光蛋白质粒(pEGFP-NI)及扩增的HBx目的 基因片段进行双酶切,纯化后用连接酶连接得到重组体pEGFP-HBx,将其转化大肠杆菌DHSα,抗生素筛选培养得到阳性克降,提取质粒后用双酶切和基因测序进行鉴定.通过脂质体介导将质粒pEGFP-HBx转染到大鼠卵圆细胞株(LE/6)中,经G418筛选,尤限传代后得到稳定表达EGFP-HBx融合蛋白的细胞株.分别采用RT-PCR和免疫细胞化学技术检测细胞株中HBx基凶的表达情况.结果 双酶切及基因测序结果均显示构建的pEGFP-HBx质粒中含有完整的HBx基因片段.将得到的抗性细胞株培养传代20次后仍表达强的荧光;RT-PCR及免疫细胞化学检测均发现HBx基因在抗性细胞(LE/6)中得到了稳定转录和翻译.结论 已成功构建带HBx基因的真核表达质粒pEGFP-HBx,获得了稳定、高效表达EGFP-HBx融合蛋白的大鼠卵圆细胞株,为进一步研究HBx基凶和卵圆细胞在肝癌发生过程中的作用和机制奠定了实验基础.     

淫羊藿甙逆转胃癌细胞恶性表型的研究

目的观察淫羊藿甙(ICA)抑制胃癌细胞黏附、移动及侵袭的效应,探讨ICA对其恶性表型的逆转作用。方法常规培养人胃癌细胞株SGC-7901细胞；200 mg/L淫羊藿甙作用细胞48 h后,检测黏附率、迁移速度、侵袭力(Transwell法)及蛋白激酶A(PKA)活性。结果200 mg/L ICA处理48 h后,SGC-7901细胞在Ⅰ型胶原上黏附40 min时和80 min时,其黏附率分别为34．72%、58．12%,均明显低于对照组的40．31%、68．42%(P＜0．05),并且这种黏附抑制作用随时间的延长更为明显；细胞迁移速度[(1．27±0．22)μm/h]和细胞的侵袭力[(41．67±4．80)细胞数/每视野],均较对照组明显降低[(2．28±0．39)μm/h；(137．25±7．25)细胞数/每视野](P＜0．01)；但PKA活性由(0．6±0．1)U/ml增高到(0．9±0．1)U/ml(P＜0．01)。结论ICA抑制SGC-7901细胞黏附、移动及侵袭,增加了细胞内PKA活性,从而发挥逆转其恶性表型的作用。     

肝癌组织中CUL4A的表达及其对肝癌细胞生长的影响

目的:探讨肝癌组织中泛素连接酶Cullin 4A(CUL4A)的表达情况及CUL4A对肝癌细胞生长的影响。方法:选择2013年1月—2015年12月72例肝癌组织标本及其癌旁组织标本和72例正常肝组织标本作为对照,免疫组化法检测肝癌组织、癌旁组织和正常肝组织中CUL4A的表达情况,用CUL4A-siRNA、NC-siRNA转染Hep-G2、QSG-7701肝癌细胞,CCK法检测细胞的增殖情况,PI染色、流式细胞术检测细胞周期,Transwell法检测细胞的侵袭迁移能力。结果:肝癌组织中CUL4A的表达明显高于癌旁组织和正常肝组织(t=48.657,P=0.000)。肝癌组织中CUL4A的表达和肝癌的分化程度、肿瘤直径、淋巴结转移、TNM分级有关(t=7.254、5.254、5.835、8.212,P=0.000、0.007、0.004、0.000)。转染CUL4A-siRNA的Hep-G2、QSG-7701肝癌细胞株在3 d和7 d时的OD值明显低于NC-siRNA组(t=3.132、5.264;3.152、5.834,P=0.037、0.008;0.041、0.011)。转染CUL4A-siRNA的Hep-G2、QSG-7701肝癌细胞株S期细胞比例低于NC-siRNA组(F=4.124、4.142;P=0.014、0.009)。转染CUL4A-siRNA的Hep-G2、QSG-7701肝癌细胞株侵袭转移能力低于NC-siRNA组(t=3.756、4.635;4.104、4.967,P=0.003、0.000;0.003、0.000)。结论:肝癌组织中CUL4A的表达升高,肝癌组织中CUL4A的表达与肝癌的分化程度、肿瘤直径、淋巴结转移、TNM分级有关,CUL4A能够促进肝癌细胞的增殖、细胞周期进程和侵袭迁移能力。