弓形虫病的血清学诊断研究Ⅰ.抗原的收集与纯化

本文改良Tsunematsu(1960)及Petrov(1974)两者的方法,用弓形虫猪株和人株感染小鼠,收集腹腔液,经胰蛋白酶消化,G_3砂芯漏斗过滤,离心,制备较纯的虫体抗原,并用冻干法长期保存。对数批感染小鼠的腹腔液在处理前、后分别进行虫体细胞计数,用伊文思蓝液染色鉴别死活。并测定虫体的得量、纯度、存活率和回收率。     

组织内弓形虫病原体的分离纯化

采用0.01％(W/V)浓度的植物血凝素P(PHAP)亲和分离法自RH株弓形虫感染小鼠腹腔液内分离到纯净的速殖子,纯度达99.5％,收获为73.2％。本法克服了胰酶消化法对虫体的化学损伤。采用Ficoll-Paque密度梯度离心法从感染鼠脑组织中分离到纯净的包囊。     

不同途径感染弓形虫小鼠在脑内形成包囊的研究

目的用3种不同途径感染Fukaya株弓形虫速殖子,观察弓形虫感染小鼠慢性期病变特点及虫体在脑内的成囊过程,以期寻求一个稳定、易建的慢性感染动物模型,为弓形虫病的病理诊断提供依据,并对弓形虫的致病机理加深理解。方法弓形虫Fukaya株速殖子(5×104个)分别以腹腔、皮下和口服途径感染小鼠,给适量药物使之形成慢性感染,并与不给药组做对照,于感染后第3d、6d1、4d2、1d、28d、42d和90d,取脑进行间接免疫酶染色,统计脑内虫体数量及形成包囊情况。结果不给药组第3d、6d与给药组第6d,3种感染途径的腹腔含虫数比较:均为腹腔感染>皮下感染>经口感染。比较小鼠脑内虫体分布:腹腔感染组,第28d的脑内虫体达到高峰,此时脑内包囊最多。皮下感染组,第21d的脑内虫体最多,脑内包囊也多。经口感染组,第21d脑内虫体最多,但脑内偶见包囊。经口感染Fukaya株速殖子似不易成囊。经腹腔、皮下和口服感染虫体的小鼠存活率在第42d分别为100%、66%、80%。结论弓形虫感染慢性期小鼠脑多被累及。腹腔与皮下感染弓形虫Fukaya株速殖子比口服易成囊,经腹腔感染方式建立弓形虫慢性感染动物模型较稳定。     

抗P30 McAb对弓形虫感染的保护性作用

用杂交瘤技术获得抗弓形虫Ｐ３０ＭｃＡｂ,按不同剂量分别与同等数量的弓形虫ＲＨ株（２×１０５／ｍｌ）作用后,经腹腔注射ＢＡＬＢ／ｃ鼠,发现该ＭｃＡｂ对弓形虫感染具保护性作用。ＲＨ株致死量试验显示：每鼠注射１０个虫体,１ｗｋ内死亡率达６２．５％,９ｄ内全部死亡,而在３．００ｍｇ的ＭｃＡｂ保护下注射１０５ＲＨ株虫体的小鼠可在１０ｄ内无一死亡。用目测概率法计算其ＥＤ５０为每鼠１．２３ｍｇ／１０５ＲＨ株虫体。对照组与实验组小鼠存活时间及存活率间经统计学检验均有显著性差异。     

复方一枝蒿颗粒抗小鼠急性弓形虫感染的实验研究

目的观察复方一枝蒿颗粒单用或联合阿奇霉素治疗小鼠急性弓形虫感染效果。方法通过腹腔注射弓形虫RH株速殖子的方法建立KM小鼠急性弓形虫感染动物模型,随机分成4组:急性弓形虫感染模型对照组、复方一枝蒿颗粒治疗组、复方一枝蒿颗粒与阿奇霉素联合治疗组,阿奇霉素对照组。观察小鼠病症及存活情况,采用ELISA法检测小鼠外周血弓形虫循环抗原CAg的表达变化;采用双基因PCR法检测弓形虫RH株速殖子在小鼠腹腔和脑、心、肺、肝、脾、肾等脏器中的增殖变化,并制备病理切片,染色后观察各脏器组织病理学变化。结果复方一枝蒿颗粒能够适当延长小鼠生存时间,延长率17.74%。组织学变化显示药物可减轻小鼠肺脏组织瘀血,并使小鼠脾脏出现大量多核型巨细胞形态。复方一枝蒿颗粒可抑制虫体在腹腔和肝、肾、心、肺组织中的增殖,感染4d时对小鼠腹腔冲洗液中游离速殖子的增殖抑制率可达92.80%,联用阿奇霉素增值抑制率达98.53%。相对定量PCR法显示弓形虫复方一枝蒿颗粒对小鼠肝、肾、心、肺组织中弓形虫增殖抑制率分别为(79.60±0.08)%、(42.00±0.20)%、(50.80±0.08)%、(60.40±0.21)%,作用虽弱于阿奇霉素对照组和联合药物组,但可显著抑制小鼠脑组织中弓形虫的增殖,增值抑制率达(76.80±0.07)%(F=63.08,P0.01);核酸检测弓形虫529基因比B1基因在小鼠脏器中的表达更稳定,适宜作为弓形虫在宿主脏器组织中的监测指标。复方一枝蒿颗粒能降低虫体循环抗原CAg在感染小鼠外周血清中的表达水平,与感染组小鼠相比(3 970.82±20.52)pg/ml,至感染4d时药物组小鼠血清中CAg水平为(3 163.01±15.94)pg/ml。结论复方一枝蒿颗粒单用或联合阿奇霉素使用对小鼠急性弓形虫感染有一定治疗效果。与阿奇霉素对虫体的直接杀伤作用不同,复方一枝蒿颗粒主要通过增强脾脏免疫细胞吞噬作用和抑制虫体向脑能远端脏器的侵袭抑制感染鼠的病情发展,推测可能通过调节小鼠免疫功能起到治疗小鼠急性弓形虫感染的作用。     

应用PCR技术评价抗弓形虫药物的疗效

目的　探讨应用PCR技术对药物治疗小鼠急性弓形虫感染的疗效进行了考核评价。方法　小鼠腹腔内感染RH株弓形虫速殖子 2× 10 3 ,8h后给予双氢青蒿素 75mg/kg d和双氢青蒿素 75mg/kg d联合磺胺嘧啶钠 10 0mg/kg d每日两次灌胃小鼠治疗 ,疗程 15d ,观察小鼠存活率 ,并于感染后第 9、15、31d取小鼠腹水及肝、脾和脑进行弓形虫PCR检测 ;于停药后5个月取存活小鼠脑再行弓形虫PCR检测。结果　双氢青蒿素联合磺胺嘧啶钠组小鼠存活率达 93% ,明显高于磺胺嘧啶钠组 (6 8 3% )及双氢青蒿素组 (0 % )。PCR检测可见小鼠腹水中除联合治疗组外 ,其余各组均可检测出特异弓形虫DNA ;但只有对照组和双氢青蒿素组小鼠的肝脏和脑中可检测出虫体DNA ,而脾脏中只有对照组可检出虫体DNA。结论　小鼠腹水的PCR检测结果与存活率和腹水虫体镜检结果一致 ,并弥补了镜下检查由主观造成的不足 ;肝、脾、脑等脏器的PCR检测也取得与存活率基本一致的结果 ;总之 ,本研究中的PCR检测结果较客观地反映药物对小鼠的疗效情况 ,为动物实验性弓形虫病的药物疗效考核提供了一个较为简便、灵敏、特异的方法     

弓形虫低温冷冻保存后超微结构观察

弓形虫的低温冷冻保存方法已为国内外学者采用。我们将弓形虫置于液氮保存,并对保存后虫体的超微结构进行观察。 材料和方法 NP株弓形虫系南京农业科学院畜牧兽医研究所自当地猪体内分离出的虫株,在本所用小鼠传代,每4d发病传代1次。收集感染NP株弓形虫小鼠的腹水和腹腔冲洗液,充分摇匀后用消毒安瓿分装,每     

刚地弓形虫感染对小鼠外周血和脾淋巴细胞Crry和CD55表达的影响

目的 探讨刚地弓形虫急性感染对小鼠外周血细胞和脾淋巴细胞表面补体调节蛋白Crry和CD55表达的影响.方法 将30只雄性C57BL/6小鼠按完全随机分组法分为感染组(20只)和对照组(10只).感染组小鼠每只腹腔注射1.0×104个RH株刚地弓形虫速殖子,对照组注射等量生理盐水.感染组依次于感染后2d和5d采集标本,同时对对照组取材.采用流式细胞仪检测小鼠外周血红细胞、白细胞及脾淋巴细胞Crry与CD55的表达情况.结果 ①感染后2d小鼠外周血红细胞Crry和CD55阳性表达率依次为(96.17±2.86)％和(65.23±4.99)％,对照组依次为(98.24±0.83)％和(68.57±5.31)％,组间差异均无有统计学意义；感染后5d,其红细胞Crry和CD55阳性率依次为(81.77±4.51)％、(51.72±8.29)％,对照组依次为(97.94±0.95)％、(70.57±6.44)％,感染组较对照组降低(t=7.786,t=4.433,P＜0.01).②感染后2d,白细胞Crry和CD55阳性率依次为(96.74±3.76)％、(71.80±6.74)％,对照组依次为(97.25±1.16)％、(74.84±3.87)％,两组比较均无有统计学意义的差异；感染后5d,其阳性率依次为(93.46±4.38)％、(59.67±6.37)％,对照组依次为(97.47±1.56)％、(75.10±4.58)％,感染组比对照组降低(t=2.585,t=4.792,P＜0.05,P＜0.01).③感染后2d,脾淋巴细胞Crry和CD55阳性率依次为(97.74±1.55)％和(66.58±2.67)％,对照组依次为(98.20±1.19)％和(69.98±4.62)％,两组比较均无有统计学意义的差异；感染5d后,其阳性率依次为(94.71±3.59)％、(56.86±6.98)％,对照组依次为(98.24±1.63)％、(71.18±4.09)％,其中,感染组CD55阳性率较对照组降低(t=4.195,P＜0.01),而Crry阳性率较对照组无有统计学意义的差异.结论 小鼠感染刚地弓形虫RH株后,不会立刻影响外周血和脾淋巴细胞补体调节蛋白Crry、CD55表达水平；随着病情发展,刚地弓形虫感染可导致机体免疫细胞补体调节蛋白的表达水平降低,但对不同免疫细胞各补体调节蛋白影响程度并不相同.     

弓形虫Fukaya株在慢性感染小鼠体内分布的研究

目的观察弓形虫(Fukaya株)感染时的慢性期病变特点及虫体在主要脏器的动态分布,以期为弓形虫病的病理诊断提供依据,并对弓形虫的致病机理加深理解。方法弓形虫Fukaya株速殖子(5×104个)分别以腹腔、皮下和口服途径感染小鼠,给适量药物使之形成慢性感染,对照组不给药。于感染后第3、6、14、21、28、42和90 d,取肝、肺和脑进行间接免疫酶染色检查。结果经腹腔感染的实验组小鼠第21、28 d肺与脑内均可见虫体,脑内有包囊;皮下感染组第21 d肺和脑内也可见虫体,脑内有包囊;经口感染组第14、21 d肺和脑内均可见虫体,脑内偶见包囊,并检测到弓形虫抗原。感染后第21 d,3种方式感染的实验组小鼠肺内虫体数差异无显著性(P>0.05),而脑内虫体数差异有显著性(P<0.05),口服感染组>皮下感染组>腹腔感染组。结论间接免疫酶染色方法可清楚显示弓形虫感染慢性期的组织内弓形虫速殖子、抗原成分和包囊。弓形虫感染慢性期小鼠肺与脑多被累及。小鼠脑内较其他脏器易成囊。弓形虫体内成囊的影响因素很多,感染方式及感染阶段也是影响成囊的重要因素。     

PRU株弓形虫包囊感染小鼠模型的建立

目的建立一个合理、经济的弓形虫包囊小鼠感染模型,为弓形虫的相关研究提供参考。方法 20个PRU株弓形虫包囊分别感染C57BL/6J、ICR、KM或BALB/c四个品系雌性小鼠10只,感染后42d,统计小鼠存活率、脑组织包囊数和包囊直径。结果 KM小鼠存活率100%(10/10),ICR小鼠存活率70%(7/10),C57BL/6J存活率10%(1/10),BALB/c全部死亡(0/10);ICR小鼠包囊数和包囊直径与KM小鼠相比具有显著性差异(P0.01):ICR鼠脑组织包囊数为1385.71±378.555,直径为4.044±0.187μm;而KM鼠脑组织包囊数为290.00±129.743,直径为3.557±0.271μm。结论与其他3个品系小鼠相比,ICR小鼠对PRU株弓形虫包囊的抗性较强,可以作为弓形虫包囊感染模型。     

高表达毒力因子ROP18的转基因刚地弓形虫株的建立及鉴定

目的构建并鉴定高表达毒力因子ROP18的转基因刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)虫株。方法 RTPCR扩增刚地弓形虫RH株速殖子的ROP18基因片段。将纯化的PCR产物克隆至p CR-BluntⅡ-Topo载体构建p ROP18质粒,PCR扩增ROP18基因序列。将纯化的PCR产物亚克隆至p TUB8-myc GFPPftail-Ty1载体,构建p TUB8-ROP18-Ty1质粒。将质粒电穿孔转染刚地弓形虫RH株,刚地弓形虫悬液转移到长有贴壁细胞的培养瓶中培养,用含25μg/ml霉酚酸和50μg/ml黄嘌呤的DMEM培养基筛选高表达ROP18的刚地弓形虫RH株。免疫荧光和蛋白质印迹(Western blotting)检测ROP18在转基因刚地弓形虫株中的表达。吉氏染色比较弓形虫RH株和高表达ROP18的转基因RH株弓形虫分别感染人包皮成纤维细胞(HFF细胞)的增殖情况。20只昆明小鼠均分为2组,每鼠分别腹腔内注射1×103高表达ROP18弓形虫RH株和1×103弓形虫RH株,统计小鼠存活率。结果 RT-PCR扩增出1 665 bp的ROP18基因序列。经酶切和测序鉴定证明p TUB8-ROP18-Ty1质粒构建成功。Western blotting分析结果显示,高表达ROP18 RH株可表达相对分子质量(Mr)为56 000的蛋白,与ROP18-Ty1蛋白预期结果一致。免疫荧光结果发现,ROP18-Ty1定位于弓形虫前端的棒状体。吉氏染色结果表明,高表达ROP18 RH株弓形虫感染HFF细胞6、12和24 h后的速殖子数量分别为100.0±16.9、476.0±31.1和860.0±52.3,均显著高于RH株弓形虫(88.0±16.9,300.0±11.3,675.0±35.4)(P0.05)。弓形虫毒力实验结果显示,RH株弓形虫感染小鼠在第8天均存活,第14天存活率下降至30%(3/10),至第16天全部死亡;高表达ROP18 RH株弓形虫感染小鼠在第5天均存活,第8天存活率下降至30%(3/10),至第9天全部死亡。结论构建了高表达毒力因子ROP18的转基因弓形虫虫株。     

刚地弓形虫株在抗IFN-γ抗体处理小鼠发生弓形虫脑炎中的作用

作者实验观察了不同虫株所致小鼠弓形虫病动物模型在经抗IFN-γ单抗处理后脑部包囊形成数目和炎症的变化。3株弓形虫:ME-49、C56及Beverley株。各以10个包囊(感染ddy的小鼠的脑悬液)定量接种C57BL/10小鼠,10wk后以腹腔注射抗     

弓形虫保种的实验观察

弓形虫保种常用小鼠腹腔转种传代 ,该法费时费力 ,若转种不及时容易断种 ,为解决此问题 ,我们对弓形虫在 4℃存放不同时间后的感染力 ,及应用保护剂在不同温度下存放不同时间后弓形虫的死亡率进行了观察。材料与方法1　 4℃存放对弓形虫感染力的影响弓形虫 RH株引自上海第二医科大学。将虫株接种于普通小白鼠 ,体重约 2 2 g,3 d后 (小鼠死亡前 )用 2 ml无菌生理盐水洗涤小鼠腹腔 ,收集含弓形虫速殖子的腹腔液 ,4℃贮存。弓形虫贮存至 10 d、2 0 d、30 d、40 d、5 0 d和 6 0 d,分别腹腔接种小鼠 (0 .2 ml/只 ,约 2 0 0 0个虫体 ) ,每组 5只…     

刚地弓形虫China 1基因型成囊株在小鼠体内的动态分布

目的观察流行我国的刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)主要基因型China 1成囊株在感染小鼠体内的动态分布和包囊形成。方法采自武汉的猫源性刚地弓形虫株(TgCtwh1,基因型为China 1,即ToxoDB#9)包囊50个(约含1×104个缓殖子)经口感染SPF级CD1雌性小鼠50只,于感染后第2、4、7、10、14、21、35、50和72天,分别大体观察小鼠健康状况并测定体重;颈椎脱臼法处死小鼠,脑组织压片观察弓形虫包囊形成时间,计算成囊率,测量包囊直径;荧光定量PCR和组织接种方法检测弓形虫在血液、心、肝、脑和淋巴结组织中的动态分布。结果实验小鼠感染后第7天体重减轻(3.650±0.252)g;第10天[(1.730±0.017)g]与第14天体重差值[(-0.390±0.554)g]比较,有统计学意义(P<0.05)。感染后第21天,在脑组织中查获包囊,成囊率为80%,直径为20～40μm;至感染后第35天,小鼠成囊率增为100%,包囊直径为50～60μm。感染后第2天,TgCtwh1虫体即出现在血液、心、肝和淋巴结组织中,拷贝数分别为3.510±0.152、4.100±0.198、4.220±0.209和4.960±0.052,感染后第4天见于脑组织(3.800±0.154);血液中的虫体在第7天达峰值(5.240±0.115),随后逐渐下降,至第35天消失;心和脑组织中的虫体分别于第14天和第10天达峰值后(5.640±0.214和5.790±0.060)维持相对稳定的水平;肝和淋巴组织中的虫体分别于第7天和第10天达峰值(5.310±0.038和6.200±0.152),此后虫体逐渐减少,至第50天转阴。结论流行中国的弓形虫China 1基因型成囊株在感染小鼠体内虫血症可持续至少21 d,感染后第21天首次在小鼠脑组织内检测到包囊。     

纤维素滤膜过滤法纯化弓形虫速殖子并制备可溶性抗原

取弓形虫RH株感染小鼠腹腔灌洗液20ml,加入无菌生理盐水至250ml,在5μm滤膜孔径的容器过滤器上过滤。收集的滤液经1512×g离心15min,沉淀即为纯净虫体。超声粉碎虫体,11200×g离心30min,收集上清即为弓形虫可溶性抗原。采集感染弓形虫SD大鼠慢性期血清和健康SD大鼠血清,用上述抗原作间接酶联免疫吸附试验(indirectELISA),检测抗原特异性和抗原效价。结果显示,通过改进过滤器、滤膜孔径和过滤方法纯化弓形虫速殖子,平均白细胞清除率为99.9%,红细胞清除率为80.3%,虫体回收率为71.0%。平均每只小鼠提取1.38mg弓形虫可溶性抗原。间接ELISA试验结果表明,抗原效价为5μg/ml。     

弓形虫ROP12核酸疫苗对小鼠弓形虫感染度的影响

目的探讨弓形虫ROP12核酸疫苗对小鼠弓形虫感染度的影响。方法提取弓形虫RH株速殖子总RNA,根据ROP12基因全长编码序列(登录号为DQ096559)的开放阅读框设计引物并进行逆转录PCR(RT-PCR),扩增目的片段ROP12基因克隆至真核表达质粒pVAX1上,构建重组表达质粒pVAX1-ROP12,并进行酶切和测序鉴定。将小鼠随机分为pVAX1-ROP12组、pVAX1组及空白对照组,分别用相应接种物(空白对照不作处理)免疫小鼠3次,每次间隔2周,末次免疫2周后各组小鼠腹腔攻击感染RH株弓形虫速殖子1×10~3个/只,定时解剖小鼠,取组织印片并染色,观察各器官的虫体感染度。结果 RT-PCR扩增产物约为711 bp,菌落PCR及双酶切结果正确,序列测序结果与GenBank上报告的ROP12序列相似度为99.9%。用构建的弓形虫ROP12基因真核表达重组质粒pVAX1-ROP12免疫小鼠后,取弓形虫进行攻击感染,相同时间点小鼠各器官的感染度较空质粒对照和空白对照显著降低(均P0.05)。结论 ROP12核酸疫苗免疫对弓形虫在小鼠各组织器官的感染度有显著的抑制作用,这为弓形虫疫苗提供理论基础。     

不同生长条件下刚地弓形虫毒力的变化型

取死亡播散型弓形虫病野兔的肝、肺匀浆作体外培养或小鼠腹腔接种,分别分离到虫体后转染小鼠。结果观察到直接用野兔脏器及体外培养虫体接种的小鼠均无急性弓形虫感染的症状与体征,小鼠存活也基本不受影响。接种野兔器官的第一批小鼠中只有2     

获得性及先天性弓形虫病人血清对弓形虫排泄分泌抗原的识别:急、慢性感染标志的鉴定

本文主要探讨不同感染期包括先天性弓形虫病对弓形虫排泄分泌抗原(ESA)的血清免疫应答。分别采集急性、亚急性、慢性病人血清和感染新生儿及其母亲的血样,用~(35)S甲硫氨酸标记ESA和放射碘标记虫膜抗原(MA)进行放射免疫沉淀试验,而后用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行比较分析。制备抗原的虫体取自RH株感染小鼠腹腔液,制备ESA~((?)5)S甲硫氨酸标记物,取     

虫体直接凝集试验检测弓形虫病

虫体直接凝集试验是一种广泛用于诊断弓形虫病的血清学诊断法。它具有操作简便的优点,只要根据弓形虫加以受检血清后所出现的沉淀状态就可显示抗体的存在或缺如。但由于正常血清中存在非特异性IgM“天然”抗体也能与弓形虫表膜结合,因而出现假阳性,若血清先经2-巯基乙醇处理,灭活IgM,虽可克服假阳性,但缺乏敏感性。为此作者采用一种十分敏感的表膜抗原和含有2-巯基乙镜的缓冲剂来检测特异性IgG的改良直接凝集试验,用于弓形虫病的诊断。方法:以RH株弓形虫和TG180肉瘤细胞株混悬液感染小鼠,在细胞内原虫集落破裂前杀死小鼠,取其腹腔渗出液,经胰蛋白酶处理及梯度离心获纯化抗原,用甲醛固定,保存于4℃P~H7.2的缓冲液内。使用时需用     

阿齐霉素治疗弓形虫病初步研究

近年来试用阿齐霉素(Azithromycin、Sumamed克罗地亚PLIVA药厂出品)治疗小鼠弓形虫感染及临床确诊弓形虫病例,均取得一定疗效。 1 小鼠感染人源型弓形虫KS强毒株,从接种0.5×10~3—1.0×10~5后2h后每日一次喂服阿齐霉素100—200mg/kg×5—10d,虽仍有类似对照组较轻的发病,并晚死亡2d左右,但腹液稀薄、澄清、镜下虫体极少,比对照组减少95％以上,油镜所见虫体成倍胀大或裂解,泡浆凝集成网状,核浅染,且以此腹液接种健康鼠,发病不明显,50d时取全部鼠脑,用淋巴细胞分离液法,在三层分离液层作多张厚涂片,姬氏染色均未查见弓形虫包囊。 2 临床弓形虫病例治疗 试治8例有全身性症状、脑炎、伴肝脾肿大或淋巴结肿大及多次畸胎史,并经IHA、ELISA-IgG、IgM、IgA系列检测2次