兔椎间盘器官与脊柱运动节段离体培养条件下髓核组织的变化

目的:比较离体培养的兔椎间盘器官及脊柱运动节段两种模型椎间盘髓核组织的变化.方法:将21只新西兰白兔随机分为器官组8只,节段组13只,处死后在无菌条件下分别取出椎间盘器官和脊柱运动节段各50个,在高渗培养基中进行整体培养(410 mOsm/kg),于培养前及培养后第3、7、14、21天,两组各取10个椎间盘分别进行HE染色、II型胶原免疫组化、蛋白多糖含量和髓核细胞活力测定.结果:培养21 d器官组与培养14 d节段组HE染色示椎间盘组织结构基本保持完整,21 d节段组椎间盘组织形态学破坏;21 d器官组与14 d节段组Ⅱ型胶原免疫组化染色强度差异无统计学意义(P>0.05),21 d节段组染色变浅,与之前各时间点及器官组相比差异有统计学意义(P<0.05);蛋白多糖PAS/AB染色7 d内两组强度无降低,14 d两组强度均有所减弱,21 d节段组染色强度进一步减弱,改变比器官组更为明显;髓核细胞荧光检测两组7 d时强度较培养前变化不明显(P>0.05),21 d器官组与14 d节段组强度略有降低,但与之前时间点比较差异无统计学意义(P>0.05),21 d节段组髓核细胞荧光强度减弱,细胞活性降低,与之前各时间点及器官组比较差异明显(P<0.05).结论:14d内脊柱运动节段可作为研究生物力学对椎间盘影响的离体实验模型.     

大鼠椎间盘器官整体培养条件下髓核组织的变化

目的对大鼠椎间盘包括上下软骨终板、纤维环及髓核组织进行整体培养,观察髓核组织的变化,探索椎间盘器官整体培养的实用技术。方法取健康清洁级5～6周龄SD大鼠60只,体重约150g,雌雄不限,完整取出腰段椎间盘器官共335个,用含肝素的高渗PBS液充分冲洗后置入含有渗透压为410mOsmol/kg高渗培养液的12孔培养板内,每天换液1次。于培养第0、3、7、14、21天行髓核细胞成活率检测(n=15)、免疫组织化学染色观察(n=2)、HE染色(n=15)、番红O染色观察(n=15),培养第0、3、7、14天行RT-PCR检测(n=5)。结果培养14d内髓核细胞成活率无明显变化(P0.05),21d时显著低于其余各时间点(P0.01)。各时间点免疫组织化学染色均显示髓核细胞内含大量Ⅱ型胶原。培养14d内HE染色和番红O染色示髓核和基质组织结构完整。图像分析显示,培养14d内各时间点间髓核组织灰度值比较差异均无统计学意义(P0.05),21d与其余各时间点比较差异均有统计学意义(P0.05)。RT-PCR检测显示,随着培养时间延长,Ⅰ型胶原mRNA表达呈上升趋势,而Ⅱ型胶原、核心蛋白聚糖和聚集蛋白聚糖均呈下降趋势;各基质蛋白mRNA表达的相对强度各时间点间两两比较,差异均有统计学意义(P0.05)。结论利用高渗培养液可对椎间盘器官进行整体培养,为椎间盘生理与病理研究提供了一种理想模型。     

软骨终板通透性对体外培养大鼠髓核细胞生物学特性的影响

目的:观察软骨终板营养通路通透性对外培养大鼠髓核细胞生物学特性的影响。方法:4周龄雄性SD大鼠20只,处死后立即手术切取腰段椎间盘(包括邻近的软骨终板),每只6个,随机分为A、B、C 3组,其中A组为正常对照组,B组用骨蜡封闭上软骨终板,C组用骨蜡封闭上、下软骨终板,3组椎间盘在体外进行整体器官培养。于培养前和培养7d、14d时,分别用Mitotracker Green荧光探针和RT-PCR方法评估椎间盘髓核细胞的活力和髓核Ⅱ型胶原及蛋白多糖mRNA的表达;于培养前和培养14d时用免疫组化方法观察髓核蛋白多糖、Ⅱ型胶原和基质金属蛋白酶3(MMP-3)的表达。结果:取材后培养前髓核细胞的荧光强度最高;在体外培养7d,3组髓核细胞的荧光强度较培养前变化均不明显,3组之间无显著性差异(P>0.05);培养14d时A、B、C组荧光强度较培养前分别降低约19%、22%和30%,与培养前比较差异均有显著性(P<0.05),其中C组与A、B两组比较有显著性差异(P<0.05),A、B两组比较差异无显著性(P>0.05)。免疫组织化学观察显示在培养14d时3组髓核蛋白多糖和Ⅱ型胶原的染色强度与培养前比较均有所降低,MMP-3阳性染色增加,蛋白多糖、Ⅱ型胶原和MMP-3染色强度的变化以C组最为明显。3组髓核细胞Ⅱ型胶原和蛋白多糖mRNA的表达在培养7d和14d时均较培养前显著降低(P<0.05),其中7d时3组之间无显著性差异(P>0.05),14d时A、B两组间无显著性差异(P>0.05),C组与A、B组比较有显著性差异(P<0.05)。结论:降低体外培养大鼠椎间盘上下软骨终板的通透性,可在短期内影响髓核细胞的生物学特性,加速椎间盘的退变。     

冻椎间盘复合表达hBMP7的髓核细胞体外构建生物椎间盘的可行性研究

目的 探讨利用液氮储存的椎间盘与表达人BMP7的髓核细胞体外构建生物活性椎间盘器官的可行性.方法 取液氮储存2个月的犬椎间盘48个,分为EGFP对照组、1×10^4、1×10^5和1×106共四组,每组12个椎间盘.对照组用22 G注射器自椎间盘后正中注入20 μL 含有1×10^5表达EGFP的髓核细胞,1×10^4组注入20 μL含有1×10^4 PKH-26标记的表达hBMP7的髓核细胞,1×10^5组注入20 μL含1×106KH-26标记的表达hBMP7的髓核细胞,1×106组注入20 μL含1×10^5KH-26标记的表达hBMP7的髓核细胞.注射后立即置入50 mL离心管中,加入30 mL完全培养基,分别于培养第4、7、14 d,从外源细胞存活、存活细胞量、hBMP7的表达、蛋白多糖及总胶原含量变化对体外构建的生物活性椎间盘进行评价.结果 在椎间盘培养的各时间点均可见PKH-26红色荧光和表达绿色荧光蛋白的髓核细胞存在.对不同组、不同时间点的椎间盘中荧光强度定量后发现：培养第7天、14天时1×10^5组荧光强度明显高于1×106组和1×10^4组（P〈0.05）.1×10^5组在第7、14天时hBMP7 mRNA表达量明显高于1×106组和1×10^4组（P〈0.05）,EGFP组未见表达;且1×10^5组在培养的第7天、14天时蛋白多糖及总胶原含量均较另外三组明显增高（P〈0.05）.结论 应用液氮冻存的椎间盘与1×10^5个表达hBMP7的髓核细胞复合,外源性髓核细胞可较长时间存活,并能增加蛋白多糖及胶原含量,是一种体外构建生物活性椎间盘的可行性方法.     

慢病毒载体GV115介导Caspase-3 siRNA转染人椎间盘髓核细胞的生物学效应

目的 :研究慢病毒载体GV115介导Caspase-3 si RNA转染人椎间盘髓核细胞的生物学效应。方法 :采集12例外伤致脊柱爆裂性骨折患者(22~36岁)术中切除的椎间盘髓核组织,采用组织块法分离培养髓核细胞并传代。取第2代髓核细胞,分为GV115-Caspase3 si RNA组、GV115组和对照组,各组12个细胞培养孔。在荧光显微镜下观察计数阳性髓核细胞,计算GV115-Caspase3 siRNA对人椎间盘髓核细胞的转染效率;采用免疫荧光法检测三组髓核细胞中Caspase-3表达;采用MTT法检测三组髓核细胞活性;采用Western-Blot法和Antonopulos法分别检测三组髓核细胞的Ⅱ型胶原和蛋白多糖含量。结果 :椎间盘髓核细胞被成功分离培养,培养1周后细胞达到80%融合,进行传代培养。转染后1周(85.6±1.3)%的髓核细胞可被GV115-Caspase3 si RNA转染而表达绿色荧光素。GV115-Caspase3 siRNA组Caspase-3免疫荧光阳性细胞率[(19.4±3.2)%]较GV115组[(84.3±9.2)%]和对照组[(83.9±8.7)%]明显减少(P0.05),OD值(1.56±0.21)较GV115组(0.91±0.15)和对照组(0.92±0.17)高(P0.05),Ⅱ型胶原免疫印迹染色强度(1.32±0.09)较GV115组(0.81±0.05)和对照组(0.79±0.04)高(P0.05),蛋白多糖含量(0.56±0.09)较GV115组(0.35±0.06)和对照组(0.34±0.05)高(P0.05)。结论:GV115-Caspase3 siRNA可高效转染人椎间盘髓核细胞,增强髓核细胞的生物活性,并促进细胞外基质的合成。     

兔不同节段椎间盘髓核细胞培养特性的比较

目的:探讨兔颈段、胸段及腰段椎间盘髓核细胞的培养特性.方法:3～4月龄兔10只,麻醉后,在无菌条件下手术分离整段脊柱,分别取颈段(C1/2～C7/T1)、胸段(T1/2～T1/L1)、腰段(L1/2～L7/S1)髓核细胞进行培养,于培养后的24h计算贴壁率.并于贴壁后的第3、7、14及21天计算细胞死亡/成活比,判断细胞活力并检测蛋白多糖的含量.结果:颈段、胸段、腰段细胞贴壁率差异具有显著性,腰段细胞贴壁牢最高(P<.01).不同节段之间,在多个时间点观察髓核细胞死亡/存活比差异具有显著性,腰段椎间盘髓核细胞的死亡/成活比最低(P<0.01).不同节段之间,不同时间点观察的蛋白多糖含量差异具有显著性,且腰段椎间盘髓核细胞的蛋白多糖含量最高(P<.01).结论:腰段椎间盘髓核细胞较颈段及胸段的髓核细胞生长状态好,兔腰椎髓核细胞更适宜作为细胞培养的种子细胞.     

经皮颈椎间盘髓核成形术与激光减压术治疗颈椎病的疗效比较

目的比较经颈椎间盘髓核成形术(PCDN)与经皮颈椎间盘激光气化减压术(PLDD)治疗颈椎病的临床疗效及对颈椎稳定性的影响.方法回顾性分析我院2005年1月～2007年4月因颈椎病住院采用PCDN(72例)与PLDD(72例)治疗病例,比较两组在手术时间、临床效果及颈椎稳定性等方面的差异.临床效果评价采用JOA评分及Williams疗效标准,颈椎稳定性评价采用Katsumi标准.结果两组手术均成功,手术时间PCDN组平均7.12±3.20min,PLDD组平均7.10±2.05min,两组间无显著性差异(P＞0.05).PLDD组1例患者术中发生终板损伤出血,术后出现颈部疼痛,对症处理后疼痛缓解.所有病例随访3～28个月,PCDN组平均16.76±6.87个月,PLDD组平均17.23±7.40个月.JOA评分,PCDN组术前为9.37±0.98分,术后为14.52±0.78分;PLDD组术前为9.42±1.21分,术后为14.33±0.85分.两组JOA评分术后与术前比较均有显著性差异(P＜0.01);两组之间无显著性差异(P＞0.05).Williams评估,PCDN组优42例,良21例,可7例,差2例;PLDD组优39例,良23例,可7例,差3例,两组间无显著性差异(P＞0.05).两组病例手术后均无颈椎不稳发生,颈椎稳定性手术前后均无显著性差异(P＞0.05).结论经皮颈椎间盘髓核成形术与经皮椎间盘激光气化减压术治疗颈椎病的临床疗效优良,对颈椎稳定性影响小,不会造成颈椎失稳的发生.     

舒筋祛痹汤对腰椎间盘突出症大鼠PLA2活性、IL-6、TNF-α水平和椎间盘退变的影响

目的探究舒筋祛痹汤对腰椎间盘突出症(LDH)大鼠磷脂酶A2(PLA2)活性、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平及椎间盘退变的影响。方法将60只SD雄性大鼠随机分为正常组、西医组、中医组各20只,除正常组大鼠正常环境下继续饲养以外,西医组、中医组建立LDH模型,并分别给予西药双氯芬酸钠肠溶片、中药舒筋祛痹汤连续灌胃给药14 d。于制模后3、7、14d分别取出移植髓核观察移植髓核组织内PLA2活性,并于断头处死大鼠后取血测定血清IL-6、TNF-α浓度,取L5神经根组织,常规脱蜡、HE染色、脱水、封片后观察病理改变。结果制模成功经大鼠灌胃后第3天,中药组、西药组大鼠髓核组织中PLA2活性达到最高,均显著高于正常组(P0.05);此时中药组髓核组织中PLA2活性略高于西药组,但差异无显著性(P0.05)。第7、14天中药组、西药组髓核组织中的PLA2活性均显著较第3天降低(P0.05),且第7、14天中药组髓核组织中PLA2活性均略低于西药组,但差异无显著性(P0.05)。制模成功经大鼠灌胃后第14天西药组、中药组血清IL-6、TNF-α浓度略高于正常组,但差异无显著性(P0.05);且中药组血清IL-6、TNF-α浓度略低于西药组,但差异无显著性(P0.05)。中药组大鼠神经根髓鞘、轴突及雪旺细胞病理变化较西药组改善明显。结论舒筋祛痹汤可降低LDH大鼠突出髓核组织PLA2活性及血清IL-6、TNF-α浓度,抑制炎症介质合成,从而起到与抗炎镇痛类西药类似效果,对延缓椎间盘退变有重要作用。     

重组人生长激素对严重烧伤患者体液分布及水钠潴留的影响

目的 了解重组人生长激素(rhGH)对严重烧伤患者体液分布及水钠潴留的影响.方法 成年重度烧伤患者30例,按区组随机法分为治疗组和对照组.伤后第7天开始分别为2组患者皮下注射rhGH(12 U/d)和等量等渗盐水,持续14 d.于伤后第7天(用药前)及伤后第14、21天(用药后第7、14天),应用生物电阻抗法观察2组患者机体总水量(TBW)、细胞内水量(ICW)及细胞外水量(ECW),同时应用离子选择电极法测量24 h尿钠,进行对比分析和综合统计. 结果 治疗组与对照组比较,伤后第7、14、21天的TBW、ICW、ECW及24 h尿钠变化差异无统计学意义(P＞0.05).各组内不同时相点比较,差异亦无统计学意义(P＞0.05).但将2组患者数据合并进行统一处理后.伤后第21天TBW值和ICW值分别为(36±6)、(21±4)L,与伤后第7天[(38±6)、(23±7)L]比较,差异有统计学意义(P＜0.01). 结论 重度烧伤患者随着病程延长,TBW和ICW逐渐减少,适量廊用rhGH对患者体液分布和水钠潴留无明显影响.     

基质细胞衍生因子-1在人正常和退变椎间盘中的表达、分布及意义

目的:比较人正常和退变椎间盘髓核中央区、髓核与纤维环交界区、纤维环外层、纤维环内层及软骨终板5个相邻部位的基质细胞衍生因子-1 (SDF-1)的表达情况,探讨退变椎间盘SDF-1的表达在上述五个相邻部位是否具有差异.方法:获取20例腰椎间盘突出症患者的椎间盘(L4/5,病理证实为退变椎间盘组织),并纳入退变组;7例急性腰椎爆裂骨折患者的椎间盘(L3/4)及3例脊柱侧凸患者的椎间盘(L2/3,病理证实为正常椎间盘组织),纳入正常组.HE染色观察两组椎间盘的组织学结构,免疫组织化学、Western-blot、rt-PCR检测椎间盘髓核中央区、髓核与纤维环交界区、纤维环内层、纤维环外层及软骨终板5个部位的SDF-1表达情况及分布,并将退变椎间盘上述5个部位的SDF-1免疫组化积分光密度值与供者年龄、椎间盘Thompson分级作相关分析.结果:正常组的上述5个部位SDF-1免疫组化积分光密度值分别为420.87±89.93、407.80±100.76、380.02±85.05、342.89±63.76、344.06±88.97;Western-blot灰度比值分别为0.08±0.03、0.08±0.05、0.07±0.04、0.05±0.03、0.05±0.02;rt-PCR灰度比值分别为0.22±0.06、0.22±0.05、0.20±0.04、0.20±0.04、0.20±0.04.退变组上述5个部位SDF-1免疫组化积分光密度值分别为7355.13±2271.74、5959.58±2436.23、5397.49±3044.80、1605.44±825.31、361.91±104.22; Western-blot灰度比值分别为0.55±0.29、0.52±0.28、0.42±0.18、0.21±0.12、0.06±0.04;rt-PCR灰度比值分别为0.75±0.30、0.71±0.26、0.55±0.22、0.36±0.17、0.22±0.13.退变椎间盘5个部位的SDF-1表达均高于正常组(P＜0.05),且SDF-1表达量髓核中央区＞纤维环内层＞纤维环外层＞软骨终板,差异有统计学意义(P＜0.05),而髓核中央区和髓核与纤维环交界区比较无统计学差异(P＞0.05);退变椎间盘上述5个部位的SDF-1表达与椎间盘Thompson分级、年龄呈正相关性(P＜0.05).结论:SDF-1广泛表达于退变和正常的椎间盘中,其表达在退变椎间盘中上述5个相邻部位存在差异.