汉坦病毒H8205株G1-人源IL-2融合基因疫苗的免疫效应

目的探讨汉坦病毒H8205株G1-人源IL-2融合基因疫苗（pcDNA3．1／HisB-IL-2-G1）的免疫效应。方法将pcDNA3.1／HisB-IL-2-G1融合基因疫苗通过肌肉注射途径免疫BALB／c小鼠，每隔3周免疫1次，共免疫3次；酶联免疫法（ELISA）检测抗汉坦病毒（HTNV）抗体；空斑减少中和试验检测免疫血清中和抗体效价；淋巴细胞增殖试验（MTT法）检测免疫小鼠的细胞免疫反应；动物保护试验以BALB／c小鼠为感染动物模型，在第3次免疫后2周，腹腔内注射100TCID50（半数感染量）HTNV，然后以免疫荧光法观察鼠肾切片，评价其保护力。结果pcDNA3．1／HisB—IL—2—G1融合基因疫苗免疫后可刺激机体产生特异性抗体和中和抗体，中和效价为1：20～1：80。MTT法结果表明，免疫小鼠的脾淋巴细胞有特异性增殖反应。动物试验表明pcDNA3．1／HisB—IL—2—G1融合基因疫苗能保护小鼠免受HTNV感染。结论pcDNA3．1／HisB—IL—2—G1融合基因疫苗可诱导特异性体液免疫应答和较强的细胞免疫应答。     

汉坦病毒包膜糖蛋白基因核酸免疫的初步研究

目的将克隆有汉坦病毒包膜糖蛋白基因M片段及G1、G2基因的重组质粒免疫动物，了解上述目的基因在核酸疫苗中的应用价值。方法大量制备已构建好的pcDNA3．1-M、pcDNA3．1-G1、pcDNA3．1-G2重组质粒DNA及对照空质粒pcDNA3．1。然后用这四组质粒DNA通过肌肉注射的方法免疫6～8周龄的BALB／c小鼠（每组5只），每4周免疫一次，共免疫3次，每次免疫前及最后一次免疫后2周断尾取血，用免疫荧光的方法检测基因免疫的体液免疫应答效果。结果重组质粒pcDNA3．1-G1免疫小鼠有4只血清抗汉坦病毒抗体为阳性，重组质粒pcDNA3．1-G2以及重组质粒pcDNA3．1-M免疫小鼠各有1只血清抗汉坦病毒抗体为阳性。结论汉坦病毒糖蛋白基因核酸免疫动物后可刺激机体产生特异性的体液免疫应答。     

中国汉坦病毒H8205株G1-G2-人源IL-2融合基因DNA免疫的实验研究

目的评价融合基因 pcDNA3.1/HisB- IL- 2- G1- G2的 DNA免疫效果. 方法肌注免疫小鼠,分次采血,用酶联免疫法( ELISA)直接免疫酶斑减少中和试验检测小鼠体液免疫;淋巴细胞增殖试验( MTT法)检测其细胞免疫应答.免疫后第六周感染病毒.间接免疫荧光试验( IFIA)观察免疫小鼠抗病毒感染能力. 结果 pcDNA3.1/HisB- IL- 2- G1- G2可诱导小鼠产生特异性抗汉坦病毒抗体和中和抗体,其效价均高于其他对照组,差异显著( P< 0.05). MTT实验表明, pcDNA3.1/HisB- IL- 2- G1- G2诱导小鼠脾细胞对病毒抗原的增殖指数明显高于其他对照组. IFIA结果显示免疫小鼠对病毒攻击有保护性. 结论 pcDNA3.1/HisB- IL- 2- G1- G2可诱导小鼠产生特异性体液和细胞免疫应答,为新一代汉坦病毒( HTV) DNA疫苗开发提供了实验依据.     

汉坦病毒S基因0.7 kb片段真核载体的构建、表达及基因免疫

目的 在本室前期工作的基础上,进一步进行汉坦病毒S基因0．7kb片段的真核表达及基因免疫的研究。方法 构建汉坦病毒76－118株S基因5'端700bp片段的真核表达载体pcDNA3.1-S0.7,脂质体转染COS－7细胞,免疫荧光检测表达结果;用该质粒免疫BALB／c小鼠,并用免疫荧光法及ELISA法检测免疫的体液免疫应答效果。结果 免疫荧光检测结果表明,目的基因在COS－7细胞中获得瞬时表达;用pcDNA3.1-S0.7基因免疫小鼠可引起抗汉坦病毒核蛋白（NP）特异性的抗体应答。结论 汉坦病毒S基因0．7kb片段可刺激机体产生特异的抗汉坦病毒体液免疫应答。为进一步进行细胞免疫反应的检测及基因疫苗的研究提供实验基础。     

汉坦病毒H8205株G1-人源IL-2融合基因的克隆与表达

目的 构建融合基因pcDNA3．1／His-B-IL-2-G1，为进一步研究汉坦病毒新型裸DNA疫苗奠定基础。方法 采用PCR从含有人源IL-2的质粒中扩增出IL-2片段，将人源IL-2插入真核表达载体pcDNA3．1／His—B中，构建的质粒命名为pcDNA3．1／His-昏IL-2。同样采用PCR扩增汉坦病毒H8205株G1基因片段，将回收的G1片段经双酶切插入到pcDNA3．1／His-B-IL-2，构建成新的质粒pcDNA3．1／His-B-IL-2-G1。采用脂质体介导包裹，转入NIH3T3细胞中进行瞬时表达；采用原位杂交观察细胞内的基因表达，SDS-PAGE法作重组质粒pcDNA3．1／His-B-IL-2-G1瞬时表达产物的鉴定。结果 融合基因可转录并表达-分子量为78kD左右的蛋白，对照组则未见电泳条带出现。结论 成功构建pcDNA3．1／His-B-IL-2-G1融合基因，融合基因能在真核细胞中瞬时表达。     

CVB3VP1与IL-2基因双表达重组质粒的构建及免疫效果

目的 探讨白细胞介素-2(intefleukin-2，IL-2)基因佐剂对柯萨奇病毒B3(Coxsackievirus B3，CVB3)基因疫苗的免疫增强作用。方法 从CVB3VP1基因的重组质粒peDNA3／VP1上扩增出带有完整表达构件的VP1基因，克隆至pcDNA3／IL-2，构建成CVB3VP1基因和IL-2基因双表达质粒pcDNA3／VP1-IL-2，转化DH5a大肠杆菌。将peDNA3／VP1-IL-2、peDNA3／IL-2 peDNA3／VP1、pcD．NA3／VP1、peDNA3／IL-2、空白质粒peDNA3和生理盐水分别肌肉注射BALB／C小鼠，每周注射1次，共注射3次，每次注射后的第6天，断尾取血，用微量中和试验方法检测血清中和抗体；第3次注射后的第7天，用800TCID50CVB3感染小鼠，观察各组小鼠的生存情况。结果pcDNA3／VP1-IL-2、pcDNA3／IL-2 pcDNA3／VP1和pcDNA3／VP1组小鼠能产生中和抗体，抗体滴度随免疫次数增加而提高，pcDNA3／VP1-IL-2和pcDNA3／IL-2 pcDNA3／VP1组抗体水平高于同期pcDNA3／VP1组抗体水平，但各组小鼠的生存率无明显差异。结论IL-2基因单独或与VP1基因共表达对pcDNA3／VP1诱导抗体产生均有一定免疫增强作用。     

汉坦病毒H8205株包膜糖蛋白G2-IL-2嵌合基因的稳定表达

目的 探讨汉坦病毒H8205株包膜糖蛋白G2-IL-2嵌合基因（IL-2-G2）在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞获得稳定表达可溶性融合蛋白的可行性。方法 将人源IL-2基因与汉坦病毒H8205株包膜糖蛋白G2的cDNA分别克隆于真核表达载体pcDNA3．1-HisB，构建重组真核表达载体pcDNA3．1HisB-IL2G2，在脂质体介导下，将其导入cHO细胞，通过G418筛选获得阳性克隆，并继续培养6周，然后用原位杂交、ELISA、SDS-PAGE电泳方法检测IL-2-G2基因在CHO细胞中的稳定表达情况。结果 经原位杂交和SDS-PAGE电泳证实，转染pcDNA3．1-HisB-IL-2-G2的CHO细胞内有IL-2-G2的mRNA转录，且在培养上清和CHO细胞胞质中有融合蛋白的表达，经人IL-2 ELISA检测试剂盒检测证实在培养上清和细胞裂解物中所表达的融合蛋白有IL-2特性。结论 在脂质体介导下，外源性IL-2-G2嵌合基因能够成功导入CHO细胞并获得稳定表达。     

MDC、STxB与CVB3 VP1融合DNA疫苗的免疫效果比较

目的比较小鼠巨噬细胞源趋化因子（macrophage-derived chemokine,MDC）和志贺毒素B亚单位（Shiga toxin B subunit,STxB）与柯萨奇病毒B组3型（coxsackievirus B3,CVB3）VP1融合DNA疫苗的免疫效果。方法将120只雄性BALB／c小鼠分为6组,每组20只,分别肌内注射pcDNA3、pcDNA3／MDC、pcDNA3／STxB、pcDNA3／VP1、pcDNA3／MDC-VP1和pcDNA3／STxB-VP1,每3周1次,共3次,每次免疫后20d取血清,用微量中和试验检测CVB3中和抗体,第3次免疫后3周,每组取3只小鼠,取脾脏制备脾细胞,用CCK-8法检测特异性CTL杀伤活性,其余小鼠用10LD50的CVB3攻击,观察小鼠的生存情况。结果pcDNA3／VP1、pcDNA3／STxB-VP1和pcDNA3／MDC-VP1组均能诱导小鼠产生中和抗体;除pcDNA3／STxB-VP1组外,另两组抗体滴度随免疫次数增加而提高;第3次免疫后,pcDNA3／MDC-VP1组平均抗体滴度和脾淋巴细胞特异性CTL杀伤活性高于pcDNA3／VP1（P〈0．05）。病毒攻击后,pcDNA3／MDC-VP1组21d生存率高于其他各组（P〈0．05）。pcDNA3／STxB-VP1组抗体滴度和生存情况与pcDNA3／VP1组无明显差异。结论融合基因疫苗pcDNA3／MDC-VP1能诱导小鼠产生较强的体液和细胞免疫,提高了小鼠生存率,免疫效果优于pcDNA3／STxB-VP1。     

C3d对分泌型柯萨奇病毒B组3型VP1 DNA疫苗的免疫增强作用

目的 构建分泌型柯萨奇病毒B组3型（CVB3）衣壳蛋白1（sVPl）与三拷贝补体3片段（C3d3）融合基因疫苗,并观察其免疫效果。方法 将C3d3 cDNA与带有白细胞介素2（IL-2）信号肽的CVB3VPl基因拼接,构建真核表达质粒pcDNA3／sVP1-C3d3。BALB／c小鼠随机分为3组,分别肌肉注射pcDNA3／sVP1-C3d3、pcDNA3／sVP1和pcDNA3质粒,于不同时间检测小鼠血清中和抗体滴度、特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）杀伤活性、血中病毒滴度,并观察疫苗的免疫保护作用。结果 小鼠的中和抗体滴度随免疫次数增加而提高,第3次免疫后pcDNA3／sVP1-C3d3组中和抗体滴度（33．6±1．7）和特异性CTL杀伤率（66．1％±2．9％）均明显高于pcDNA3／sVP1组（28．3±1．7,52．8％±3．3％,均P〈0．05）;以致死量CVB3感染小鼠后,经融合基因免疫的小鼠血中病毒滴度显著降低,生存率达50％,而pcDNA3／sVP1组仅为25％,pcDNA3组无存活。结论 C3d可以显著增强sVPI基因免疫诱导的特异性免疫应答。     

白细胞介素-2基因佐剂对柯萨奇病毒B3 VP1基因疫苗的免疫增强作用

目的探讨白细胞介素 2 (interleukin 2 ,IL 2 )基因佐剂对柯萨奇病毒B3(CoxsackievirusB3,CVB3)基因疫苗的免疫增强作用。方法将 pcDNA3/IL 2 pcDNA3/VP1、pcDNA3/VP1、pcDNA3/IL 2、空白质粒 pcDNA3和生理盐水分别肌内注射免疫BALB/C小鼠 ,1次 /周 ,共注射 3次 ,每次注射后的第 6天断尾取血 ,用微量中和试验方法检测血清中和抗体 ;第 3次注射后的第 7天用 80 0TCID50 CVB3感染小鼠 ,观察各组小鼠的生存情况。结果pcDNA3/IL 2 pcDNA3/VP1和 pcDNA3/VP1组小鼠能产生中和抗体 ,抗体滴度随免疫次数增加而提高 ,pcDNA3/IL 2 pcDNA3/VP1组抗体水平高于同期 pcDNA3/VP1组抗体水平 ,但各组小鼠的生存率无显著性差异(P >0 .0 5 )。结论IL 2基因佐剂对 pcDNA3/VP1诱导抗体产生有一定免疫增强作用。     

Dab2/DOC-2基因的研究进展

Dab2/DOC-2是具有信号转导功能的磷蛋白,在丝裂原信号转导途径中起作用,通过蛋白质的相互作用和蛋白磷酸化发挥作用,参与控制细胞生长的信号通路而发挥生长抑制效应,Dab2/DOC-2又作为胞质衔接蛋白,参与细胞内蛋白运输。在肿瘤中纯合子基因缺失时被激活,是抑癌基因的候选成员。其在多种肿瘤中低或失表达,如卵巢癌,乳腺癌,绒毛膜癌和前列腺癌等,重新表达能抑制肿瘤的生长。Dab2也在胚胎的发生过程中发挥重要的作用。     

霍乱弧菌抑制子基因及间隔区(rstR-ig2)多态性研究

目的研究霍乱弧菌CTXφ基因组抑制子基因及间隔区（rstR-ig2）多态性。方法聚合酶链反应（PCR）及限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP）、型特异性引物PCR分型。结果霍乱弧菌（VC）01群古典型（CVC）5株均为class类型。VC01群埃尔托型（EVC）155株共分为4个类型：class、ET、class＋ET、class ＋newET,后2个类型为首次发现。不同地区分离的EVC均以ET类型为主,以class和class＋ET类型为辅。O139群VC82株共分为4个类型：ET、ET＋new O139、ET＋calc、ET＋calc＋newO139,后3个类型为首次发现;福建省分离的菌株以ET4-newO139类型为主,其它地区分离的均以ET类型为主。结论EVC和O139群VC的rstR-ig2基因均以ET类型为主．首次发现5种不同类型rstR-ig2基因共存的新类型。     

小鼠肾素－Ⅱ全长基因的物理图谱

小鼠肾素－Ⅰ（Ｒｅｎ－１）和肾素－Ⅱ（Ｒｅｎ－２）的ｃＤＮＡ有９６％的同源性。以ＸｈｏⅠ从重组质粒ｐＫＧ－Ｒ２Ｄ上切取包含Ｒｅｎ－２全长基因及周围序列的２４ｋｂ片段。该片段分别经单、双酶切后，用Ｒｅｎ－１ｃＤＮＡ半长（７３５ｂｐ）及全长序列（１４００ｂｐ）为探针进行分子杂交，据片段大小及杂交带的位置关系构建出此２４ｋｂ片段的物理图谱。     

CDX2基因研究进展

基因系尾型同源盒基因(CDX2)尾型同源框转录因子2,是一种新发现的特异性的核转录因子,属于果蝇尾部相关同源框基因家族成员,不仅控制着胚胎细胞的发育和分化,而且在成人组织的分化和增殖调控中起着重要作用。新的研究发现,消化道、泌尿生殖、妇科、头颈部等部位均有CDX2表达。本文就CDX2基因的研究现状予以综述。     

TAFA2基因剔除小鼠模型的建立

目的 建立TAFA2基因剔除小鼠模型,为在体研究TAFA2基因的生物学功能及其与中枢神经系统发生、发育的关系创造条件. 方法 运用生物信息学手段确定小鼠TAFA2基因组的序列,设计基因剔除策略,构建基因剔除载体pBR322-MK-MCS-TAFA2,以电穿孔方法将基因剔除载体导入ES细胞,用G418和Ganciclovoir进行正负筛选,获得双抗性克隆,PCR鉴定出正确同源重组的ES细胞克隆. 结果 同源重组的ES细胞注入小鼠囊胚后获得嵌合体小鼠,嵌合体小鼠与C57BL/6J小鼠交配后获得Aguoti（野生型）毛色的小鼠41只,其中14只为TAFA2基因剔除杂合子小鼠,阳性率为34.1%.在雌、雄杂合子小鼠交配的后代中获得纯合子小鼠,初步的表型观察未发现TAFA2基因剔除小鼠出现异常改变. 结论 已成功建立了TAFA2基因剔除小鼠模型,其中纯合子小鼠未出现胚胎致死现象.     

长片段基因FMNL2 PCR实验的体会

目的尝试扩增长片段FMNL2基因。方法采用巢式PCR或和降落PCR相结合的方法进行了FMNL2基因编码区全长及FMNL2-NT、-CT的扩增。结果高效、特异地扩增出FMNL2基因编码区全长及FMNL2-NT、-CT片段。结论巢式PCR或和降落PCR相结合,提高了目的基因的扩增效率和扩增产物的特异性。     

HER-2癌基因信号转导与肿瘤发生之间的关系

HER-2与许多恶性肿瘤的发生、发展密切相关。HER-2可通过信号转导途径间接调控许多肿瘤相关基因的表达,亦可作为转录因子直接调控某些基因的表达,而一些基因表达产物又进而增强HER-2或其他基因的表达,这就构成了以HER-2为中心的基因表达调控网络,这些基因表达产物和HER-2可能共同成为肿瘤诊断和预后的标志物。阐明这个网络中各个分子间的相互作用关系,将为HER-2过表达肿瘤的治疗提供新的药物设计靶标。     

磺酰脲受体1基因与2型糖尿病

在胰腺 β细胞膜上表达的磺酰脲受体 1(SUR1)是胰岛 β细胞ATP敏感钾通道 (KATP)的功能亚单位。SUR1作为调节亚基和ATP/ADP感受器与内向性整流K+通道Kir6 .2共同组成胰腺KATP通道 ,编码二者的基因被定位于人染色体11p15 .1上 ,两者相隔 4 .5kb。KATP是通过将糖代谢释放的信号与细胞膜的去极化和胰岛素的出胞作用相互连接而在葡萄糖诱导的胰岛素分泌中起关键作用。由于糖代谢产生ATP或由磺脲类药物的作用导致KATP的关闭提高了细胞内的K+的浓度并导致了 β细胞膜的去极化 ,导致电压依从性Ca2 +通道的打开 ,Ca2 +的内流及胞内C…