GRP94表达在大细胞肺癌NCI-H460细胞对顺铂耐药中的作用

[目的]检测在诱导剂A23187与抑制剂BAPTA - AM作用下,大细胞肺癌细胞NCI - H460中GRP94的表达水平,并分析其表达在肺癌细胞对顺铂耐药发生中的作用.[方法]将NCI - H460细胞分为诱导剂A23187组、抑制剂BAPTA - AM组和对照组,RT - PCR、Western blot方法检测...     

THP、ADM和VP-16诱导CNE-2鼻咽癌细胞凋亡的研究

[目的]探讨拓扑异构酶Ⅱ(TopoⅡ)抑制剂吡喃阿霉素(THP)、阿霉素(ADM)、鬼臼乙叉甙(VP-16)对鼻咽低分化鳞癌细胞株CNE-2抑制增殖及诱导细胞凋亡的作用;进一步检测了TopoⅡ抑制剂作用以后鼻咽癌细胞Survivin表达水平的变化.[方法]采用MTT法检测THP、ADM和VP-16对CNE-2细胞的生长抑制,Annenxin V FITC染色检测凋亡早期细胞,流式细胞仪检测Survivin的表达情况.[结果]ADM、THP和VP-16对鼻咽低分化鳞癌细胞株CNE-2均具有较强的体外抗肿瘤作用,随着药物浓度增高细胞增殖抑制率增高.ADM、THP和VP-16的IC50分别为(0.0238±0.0089)μg/mL、(0.0019±0.0030)μg/mL、(0.6416±0.0691)μg/mL.THP的IC50明显低于ADM.随着药物作用时间的增加,CNE-2细胞凋亡率逐渐增高.但ADM和VP-16作用CNE-2 48 h后细胞凋亡率的升高不如THP作用48h后明显.ADM、THP和VP-16诱导CNE-2细胞凋亡过程中出现Survivin的表达上调,但THP作用后表达上调的程度较ADM、VP-16低.[结论]TopoⅡ抑制剂THP、ADM和VP-16对CNE-2鼻咽癌细胞均具有抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡的作用.含TopoⅡ抑制剂的化疗方案可能在鼻咽癌的治疗中具有一定价值.THP在诱导细胞凋亡时Survivin的上调不如ADM、VP-16明显,是否意味着临床使用中THP有较少的耐药性有待进一步研究.     

非小细胞肺癌体外化疗药物敏感性与GRP94表达的相关性

[目的]探讨非小细胞肺癌(NSCLC)对8种化疗药物的体外敏感性与GRP94表达的相关性。[方法]用四噻唑蓝(MTT)法检测52例手术切除新鲜NSCLC组织8种化疗药物体外敏感性;免疫组织化学方法检测肺癌组织GRP94表达。采用Spearman法进行相关性分析。[结果]NSCLC52例对紫杉醇(PTX)、阿霉素(ADM)、卡铂(CBP)、拓扑替康(TPT)、长春瑞滨(NVB)、长春新碱(VCR)、顺铂(DDP)和鬼臼乙叉苷(VP-16)8种化疗药物的耐药率分别为42.31%、57.69%、63.46%、65.38%、67.31%、73.08%、78.85%和90.38%。其中,14例表现为完全耐药;且其高表达与肺癌细胞对VP-16的耐药明显相关(P<0.05)。[结论]检测GRP94表达对推测NSCLC对VP-16的耐药性具有参考意义。     

利用电泳迁移分析法初步探讨肺癌细胞株CEA有转录调控

[目的] 探讨癌胚抗原(CEA)表达水平不同的肺癌细胞株在转录因子水平有无差异.[方法] 利用电泳迁移分析法(EMSA)检测这些细胞株与CEA启动子阳性足迹区探针结合的DNA结合蛋白.维甲酸(RA)诱导分化A549细胞,检测诱导前后转录因子的变化.[结果] CEA水平高的细胞DNA结合蛋白的条带信号强,CEA水平低的细胞DNA结合蛋白的条带信号弱,CEA阴性细胞可见到较弱的DNA结合蛋白信号.结合条带信号在诱导后细胞组明显减弱.[结论] CEA基因特异性的表达部分依赖于转录因子的合成.转录因子量的改变与CEA表达的高低有关,并且提示RA对CEA阳性肺癌细胞的诱导是在转录水平起作用.     

钙离子载体A23187诱导人外周血单个核细胞生成树突状细胞

目的:研究钙离子载体(CI)A23187诱导健康人外周血单个核细胞(PBMNCs)生成树突状细胞(DCs),探索DCs扩增的新方法。方法:分离健康人PBMNCs,分别加入GM-CSF+IL-4,A23187。体外培养72 h后,于光镜、电镜下观察细胞的形态,流式细胞仪检测细胞的表面标志,MTT比色法检测其对同种异体T细胞的刺激增殖作用,ELISA法检测IL-12、IFN-γ的水平。结果:健康人PBMNCs在A23187的条件下培养72 h后,就可以看到典型的DCs形态,CD40、CD86、CD83分子的表达均明显增高,但CD1α分子的表达增高不明显。具有明显刺激同种异体T细胞增殖的能力。IL-12、IFN-γ的水平比其他组明显增高。结论:健康人PBMNCs在钙离子载体A23187作用下能更有效地诱导生成成熟DCs。     

IL-24对小鼠黑色素瘤B16细胞的抑制作用

[目的]研究携带IL-24基因的真核表达质粒对小鼠黑色素瘤B16细胞的凋亡和体外增殖的影响.[方法]采用重组DNA技术构建含有IL-24基因的真核表达质粒pEGFP-N1-IL-24,用脂质体法将pEGFP-N1-IL-24转染B16细胞,用荧光显微镜观察其表达,在生物显微镜下观察细胞的形态学变化,用吖啶橙/溴化乙锭（AO/EB）法检测细胞凋亡,用MTT比色法检测B16细胞的体外增殖能力.[结果]荧光显微镜下观察到pEGFP-N1-IL-24可在B16细胞中表达;生物显微镜下显示转染IL-24基因的B16细胞皱缩、成团;AO/EB法检测显示转染IL-24的B16细胞核染色质着橘黄色或橙红色,并呈固缩状;MTT比色法显示IL-24明显抑制B16细胞的生长,与对照组相比较差异有统计学意义（P〈0.05）.[结论]外源性IL-24基因在体外对小鼠黑色素瘤B16细胞有显著的诱导凋亡和抑制增殖的作用.     

端粒酶11-聚体寡核苷酸联合依托泊苷对肺癌细胞的作用

目的: 探讨依托泊苷(VP-16)单独或联合端粒酶11-聚体寡核苷酸对肺腺癌细胞的作用。方法: VP-16单独或联合脂质体介导的端粒酶11-聚体寡核苷酸与肺腺癌细胞株共培养,MTT法检测细胞生长抑制率;流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡;以TRAP-ELISA法半定量测定细胞端粒酶活性。结果: VP-16抑制肺腺癌细胞株SPC-A₁细胞生长,抑制率18.9%,下调端粒酶活性,与未加VP-16比较均有明显不同(P<0.01),可诱导细胞凋亡。VP-16联合反义寡核苷酸(ASODN)与联合正义寡核苷酸(SODN)对SPC-A₁细胞的抑制率分别为43.5%和41.0%,两者差异无显著性(P>0.05);联合用药效果明显优于单用VP-16,差异有显著性(P<0.01)。结论: 化疗药联合短链正、反义核苷酸可抑制肺癌细胞生长,较二者单独应用可提高疗效,同时降低副作用。     

羟基喜树碱联合足叶乙甙对肺腺癌细胞的放射增敏作用

目的：探讨拓扑异构酶（TOP0）Ⅰ抑制剂－羟基喜树碱（HCPT）与TOPOⅡ抑制剂足叶乙甙（VP-16）对肺腺癌细胞毒作用及放疗增敏作用。方法：MTT法检测HCPT、VP-16及二药在间隔不同时间应用对肺腺癌GLC-82的细胞毒作用及放疗增敏作用。结果：HCPT、VP-16单药及联合用药各实验组均对GLC-82细胞生长产生抑制作用，以HCPT＋VP-16（12h后）组对癌细胞的抑制作用最强（38．31％）。放疗后应用HCPT、VP-16可降低癌细胞存活率，其中以放疗＋HCPT＋VP-16组存活率最低。结论：HCPT与VP-16联合应用时抗癌效应呈时问依赖性，以间隔12h用药最佳。HCPT联合VP-16对肺腺癌放疗起增敏作用。     

葡萄糖调节蛋白78对胃癌SGC7901细胞侵袭和转移的影响

目的:探讨钙离子螯合剂BAPTA-AM和钙离子载体A23187对胃癌SGC7901细胞葡萄糖调节蛋白78(Glucose regulated protein,GRP78)表达水平的影响,分析GRP78表达改变对胃癌细胞侵袭转移能力的影响.方法:BAPTA-AM和A23187处理细胞,RT-PCR和Western-blot检测3组细胞GRP78在mRNA和蛋白水平的表达,体外侵袭实验和划痕实验检测3组细胞的侵袭转移能力.结果:与对照组相比,BAPTA-AM组GRP78在mRNA和蛋白水平表达量降低,A23187组GRP78表达量升高;且BAPTA-AM组侵袭和转移能力明显低于对照组,而A23187组则高于对照组.结论:BAPTA-AM和A23187可分别下调和上调胃癌细胞GRP78的表达水平,GRP78的表达水平可能与胃癌细胞的侵袭和转移有关.     

肺癌原代细胞耐药基因的表达和化疗敏感性的研究

目的探讨ATRA与VD3逆转肺癌细胞多药耐药，提高肺癌细胞化疗敏感性的机制。方法应用原代细胞培养、MTT比色、RT—PCR等方法观察ATRA联合VD3对人肺癌原代细胞、肺腺癌A549细胞株化疗敏感性及MRP、LRP表达水平的影响。结果人肺癌原代细胞MRP、LRP高表达，其表达与肿瘤病理无明显相关，MRP表达阳性与ADM、VP-16、VCR的耐药相关，LRP表达阳性与DDP、CBP、ADM、VP-16、VCR的耐药相关。结论MRP、LRP在肺癌尤其非小细胞肺癌中高表达，可反应肿瘤细胞多药耐药性；ATRA或VD3可下调肺腺癌MRP、LRP基因的表达水平，从而提高肺腺癌的化疗敏感性。     

GRP78 upregulation-induced increase in cisplatin sensitivity of SPCA1 lung cancer cells

Background  Glucose regulated protein 78 (GRP78), an endoplasmic reticulum (ER) chaperone, plays a critical role in chemotherapy resistance in a variety of cancers. In this study, we investigated the up-regulation of GRP78 induced by A23187 and its association with the chemotherapeutical sensibility to cisplatin in human lung cancer cell line SPCA1.

Methods  SPCA1 cells were pretreated with A23187 at different concentrations. The expression of GRP78 at the mRNA level was analyzed by RT-PCR; the expression of GRP78 at the protein level was determined by Western blotting and immunofluorescence assay. Cell survival was determined by MTT assay. Cell apoptosis was analyzed by flow cytometry.

Results  The expression of GRP78 at both the mRNA and protein levels was obviously induced by A23187 in SPCA1 cells, with an elevation of GRP78 by 2.1-fold at the mRNA level and by 3.8-fold at the protein level compared to the control. There was a dose-dependent response. Survival curve analysis demonstrated that A23187 induction caused a significant reduction of survival for the cells subjected to cisplatin treatment (P <0.05). After treatment by cisplatin, the percentage of apoptotic cells in the A23187 pretreated group increased about three fold compared with the control group ((27.53±4.32)% vs. (9.25±3.64)%, P <0.05).

Conclusions  A23187 treatment was fairly effective for the induction of GRP78 in SPCA1 cells at both the mRNA and protein levels. To a certain extent, GRP78 up-regulation by A23187 was associated with the enhancement of drug sensitivity to cisplatin in human lung cancer cell line SPCA1.

     

葡萄糖调节蛋白78对非小细胞肺癌患者吉西他滨 化疗敏感性的影响

目的：探讨葡萄糖调节蛋白78（GRP78）表达与非小细胞肺癌（NSCLC）患者吉西他滨化疗的关系及GRP78对肺腺癌SPCA1细胞活力和吉西他滨化疗敏感性的影响,并阐述其作用机制。方法：选取32例NSCLC患者的癌组织石蜡标本,采用免疫组织化学染色检测NSCLC癌组织中GRP78阳性表达率。选取GRP78高表达的SPCA1细胞作为研究对象。采用RNA干扰技术在SPCA1细胞中下调GRP78的表达水平（干扰组）,并设对照组（给予shNC）;MTT法检测各组SPCA1细胞活力。实验分为阴性对照组、干扰组、对照＋吉西他滨组和干扰＋吉西他滨组,克隆形成实验检测各组SPCA1细胞克隆形成率,Western blotting法检测各组SPCA1细胞中Akt、p-Akt、PI3K和p-PI3K的表达量。结果：免疫组织化学染色法检测,与经吉西他滨治疗缓解的NSCLC患者癌组织比较,经吉西他滨治疗未缓解NSCLC患者癌组织中GRP78阳性表达率明显升高（P<0.05）。MTT法检测,与对照组比较,干扰组细胞活力明显降低（P<0.05）。克隆形成实验,与阴性对照组比较,干扰组SPCA1细胞克隆形成率明显降低（P<0.05）,干扰＋吉西他滨组SPCA1细胞克隆形成率降低更加明显（P<0.05）。Western blotting法检测,与阴性对照组比较,干扰组细胞中p-Akt、p-PI3K表达量明显降低,干扰＋吉西他滨组细胞中p-Akt和p-PI3K表达量降低更加明显。结论：干扰GRP78可以增加吉西他滨化疗的敏感性,GRP78可能通过PI3K/Akt途径降低NSCLC患者对吉西他滨的敏感性。     

熊果酸对肺癌细胞株A549及SPCA1细胞周期的抑制作用

目的 研究熊果酸(ursolic acid,UA)对肺癌细胞株A549及SPCA1细胞周期的抑制作用,探讨其分子机制。方法 采用MTS法检测不同浓度UA作用不同时间对A549及SPCA1细胞的增殖抑制作用;光镜下观察细胞形态学变化;流式细胞仪检测不同浓度UA对A549及SPCA1细胞周期分布的影响;实时荧光定量PCR分析UA作用下A549及SPCA1的相关分子表达情况。结果 MTS结果显示UA对A549及SPCA1细胞具有增殖抑制作用,且呈时间和剂量依赖性。经UA作用后,光镜下可见A549及SPCA1细胞增殖受到抑制,细胞出现变圆、回缩和脱落。流式细胞仪结果显示在UA作用后,A549及SPCA1细胞周期抑制在G₀/G₁期,S期和G₂/M期的比例降低。实时荧光定量PCR结果表明,UA作用后A549及SPCA1细胞cyclinD1 mRNA、cyclinE mRNA、Ankrd17 mRNA表达水平降低,p27 mRNA、p16 mRNA表达增加,Ankrd17 mRNA表达变化差异无统计学意义。结论 UA能明显抑制A549及SPCA1细胞增殖,呈时间和剂量依赖性,该作用是通过将细胞周期抑制在G₀/G₁期实现的。其分子机制可能与上调p27和p16的表达,下调cyclinD1和cyclinE的表达有关。     

沉默GRP94基因对肝癌细胞的影响

目的:探讨GRP94基因对肝癌细胞的影响。方法:用脂质体法转染GRP94 siRNA序列及阴性对照序列,采用实时荧光定量PCR及Western blotting方法检测转染后GRP94的mRNA和蛋白表达水平。以CCK-8和流式细胞仪来检测细胞增殖和细胞凋亡的情况。以划痕实验和Transwell方法检测转染后细胞的迁移和侵袭能力。结果:在肝癌细胞HepG2中瞬时转染siRNA-GRP94序列及阴性对照序列后,其mRNA和蛋白表达显著减低;转染48 h后,细胞增殖能力明显下降,而细胞凋亡率明显上升。划痕实验检测发现24 h细胞愈合率明显抑制,Transwell实验发现迁移和侵袭至下室的细胞数目显著减少。结论:GRP94基因对肝癌细胞HepG2凋亡有抑制作用,促进增殖、迁移和侵袭能力,为进一步研究GRP94在肝细胞肝癌发生和进展中的作用奠定了基础。     

肺癌细胞株E - cadherin的表达状态及其与启动子甲基化的关系

[目的]研究肺癌细胞株上皮钙粘蛋白(E - cadherin)的表达与基因启动子甲基化状态的关系.[方法]采用免疫细胞化学法检测肺癌细胞株NCI - H460、SPCA和A549的E- cadherin蛋白表达;半巢式甲基化特异性PCR法(MSP)和微流控芯片技术检测E- cadherin基因启动子甲基化状态.[结果]...     

Expression of endoplasmic reticulum molecular chaperon GRP94 in human lung cancer tissues and its clinical significance

Objective To investigate the relationship between the expression of glucose regulated protein 94 (GRP94) at the level of mRNA and protein in vivo and in human lung cancer. Methods RT-PCR, immunohistochemistry and/or Western blot were used in 54 cases of lung cancer tissues and corresponding normal lung tissues.Results There was a significant overexpression of GRP94 mRNA and protein in lung cancer tissues as compared with lung normal tissues.In lung cancer tissue, the relative level of GRP94 mRNA as evaluated by RT-PCR was 3.48±2.06, the level of GRP94 protein as evaluated by immunohistochemistry was ++ to +++, and by Western blot was 256.7±80.6.In lung normal tissue, the relative level of GRP94 mRNA was 2.01±1.83, the level of GRP94 protein was + to ++ and 108.1±42.3.The differences in expression of GRP94 between the two tissues were significant ( P &lt;0.05).Furthermore, the over-expression of GRP94 in the lung cancer tissues was correlated to grade of differentiation and stage of tumors.There was stronger expression in poor-differentiated tumors than in mild-to-high differentiated tumors ( P &lt;0.05).There was also a stronger expression in stage Ⅲ than in stage Ⅰ and Ⅱ tumors ( P &lt;0.05).No statistically significant difference was found among various pathological types of tumors. Conclusion GRP94 was related with the occurrence, differentiation and progress of human lung cancer.Ascertaining the levels of GRP94 mRNA and protein may be valuable in evaluating the grade of differentiation and clinical stage of human lung cancer.     

鬼臼叉甙诱导HL－60细胞分化时c－myc蛋白的表达

目的：观察小剂量鬼臼叉甙对ＨＬ－６０细胞的诱导分化作用和对ｃ－ｍｙｃ蛋白表达的影响。方法：应用加入鬼臼叉甙（ＶＰ－１６）和维甲酸（ＲＡ）的含２０％小牛血清的培养基培养人类早幼粒细胞株（ＨＬ－６０），分别在培养后１、２、４、６ｄ测定细胞各时相的ｃ－ｍｙｃ蛋白水平。结合细胞形态、细胞化学和氯化硝基四氮唑蓝（ＮＢＴ）还原试验，观察ＶＰ－１６、ＲＡ对ＨＬ－６０细胞的诱导分化作用及其与ｃ－ｍｙｃ蛋白表达的关系。结果：与ＲＡ一样，小剂量ＶＰ－１６能诱导ＨＬ－６０细胞向粒系分化。并且在ＨＬ－６０细胞分化过程中ｃ－ｍｙｃ蛋白水平明显降低。ＶＰ－１６处理的ＨＬ－６０细胞其ｃ－ｍｙｃ蛋白降低与其诱导分化作用呈负相关。结论：实验结果提示，ｃ－ｍｙｃ原癌基因表达的变化可能是ＶＰ－１６诱导ＨＬ－６０细胞分化的机制之一。     

地塞米松对顺铂诱导人肺腺癌细胞株凋亡的抑制作用及其机制

目的 研究地塞米松（Dex）对顺铂（CDDP）引起的人肺腺癌细胞株SPCA/Ⅰ凋亡的抑制作用及其分子机制探讨。方法 体外培养SPCA/Ⅰ细胞,分别加入不同浓度Dex培养24 h后,加入不同浓度CDDP继续培养48 h,采用二甲基溴化四氮唑蓝（MTT）法检测细胞存活率;流式细胞仪检测细胞凋亡;用1 μmol/L Dex刺激SPCA/I细胞,分别于1 h、2 h、4 h、6 h、12 h采用RT-PCR技术,检测SPCA/I细胞中糖皮质激素诱导的蛋白激酶1基因（SGK-1）和丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶1（MKP-1）基因的表达;用生物素标记的抗糖皮质激素受体（GR）抗体对SPCA/I细胞中GR行细胞免疫组化检测。结果 SPCA/I细胞经Dex刺激后,对CDDP所致的抑制细胞生长和凋亡呈抵抗作用（P<0.05）。 Dex刺激后的SPCA/I细胞表达SGK-1上调,在12 h时表达达高峰,未检测到MKP-1表达;细胞免疫组化显示SPCA/Ⅰ细胞经Dex刺激后GR表达上调,细胞内GR数目高于对照组（P<0.05）。结论 体外实验结果表明,Dex对CDDP引起的SPCA/I细胞凋亡有抑制作用。其分子机理可能是通过上调细胞内GR数目,增强通路下游SGK1的表达,从而产生抗凋亡作用。